椎体成形过程中磷酸钙骨水泥及可降解网状微孔球囊的应用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.47.005

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (47): 7566-7572.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.47.005

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椎体成形过程中磷酸钙骨水泥及可降解网状微孔球囊的应用

谢志勇¹，刘训伟¹，钟建²，魏岱旭²，叶勇¹，杜艳霞¹，孙钢¹

1解放军济南军区总医院医学影像科，山东省济南市 250031
2纳米技术及应用国家工程研究中心，上海市 200241

修回日期:2014-09-19 出版日期:2014-11-19 发布日期:2014-11-19
通讯作者: 孙钢，主任医师，博士，教授，博士生导师，解放军济南军区总医院医学影像科，山东省济南市 250031
作者简介:谢志勇，男，1964年生，山东省莱州市人，解放军第四军医大学毕业，副主任医师，主要从事介入诊疗研究。
基金资助:
国家高技术研究发展计划(863计划)资助(2013AA032203)；国家自然科学基金资助(51073173)

Calcium phosphate bone cement and biodegradable mesh-like microporous balloon for vertebroplasty

Xie Zhi-yong¹, Liu Xun-wei¹, Zhong Jian², Wei Dai-xu², Ye Yong¹, Du Yan-xia¹, Sun Gang¹

1Department of Medical Image, Jinan Military General Hospital, Jinan 250031, Shandong Province, China
2National Engineering Research Center for Nanotechnology (NERCN), Shanghai 200241, China

Revised:2014-09-19 Online:2014-11-19 Published:2014-11-19
Contact: Sun Gang, M.D., Chief physician, Professor, Doctoral supervisor, Department of Medical Image, Jinan Military General Hospital, Jinan 250031, Shandong Province, China
About author:Xie Zhi-yong, Associate chief physician, Department of Medical Image, Jinan Military General Hospital, Jinan 250031, Shandong Province, China
Supported by:
the National High Technology Research and Development Program of China (863 Program), No. 2013AA032203; the National Natural Science Foundation of China, No. 51073173

摘要/Abstract

摘要：

背景：体外实验研究证明可降解高分子网状球囊具有较好的防渗漏性，并能保证周围钙离子处于一恒定状态，对细胞生长及新骨与钙盐骨水泥形成微观绞锁无抑制作用。
目的：通过动物实验评估可降解网状微孔球囊联合钙盐骨水泥治疗椎体骨折的作用。
方法：穿刺48只新西兰兔左下肢近股骨端，建立通道后引入骨钻，建立骨折模型，随机均分为两组，实验组于骨折处植入可降解网状微孔球囊与磷酸钙骨水泥，对照组植入磷酸钙骨水泥。术后1，3，6个月测试血细胞、生化指标，并行X射线摄片或CT扫描，将标本固定处理后进行病理分析。
结果与结论：骨水泥注入过程顺利，实验组球囊膨胀良好，未见明确骨水泥外渗；对照组骨水泥弥散，3只出现肺栓塞。两组手术前后血细胞、生化指标组内与组间比较差异均无显著性意义。两组材料在骨骼内生物相容性好，病理学无明显免疫反应；实验组1个月时囊壁变薄，部分部位骨组织长入骨水泥内，3个月时有大量骨组织进入骨水泥间隙，骨水泥体积减少，6个月时球囊消失，骨组织内可见部分骨水泥成分；对照组骨水泥降解时间不确定。表明可降解网状微孔球囊联合钙盐骨水泥治疗骨折的效果满意，优于单独骨水泥治疗效果。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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关键词: 生物材料, 骨生物材料, 可降解材料, 纳米纤维, 骨折, 生物相容性, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: In vitro experiments have demonstrated that the biodegradable mesh-like microporous balloon made of macromolecular materials has obvious advantage of anti-leakage, which is capable of maintaining calcium homeostasis, has no inhibitory effects on cell growth and on microscopic interdigitation formation between new bone and bone cement.
OBJECTIVE: To evaluate the therapeutic effects of biodegradable mesh-like microporous balloon with calcium bone cement on vertebral fractures based on animal experiments.
METHODS: The fracture model was established in 48 New Zealand rabbits, in which a bone drill was introduced after successful puncture at sites near left low extremity of the femur. These rabbit models were randomized into two groups: experimental group with calcium phosphate bone cement and biodegradable mesh-like microporous balloon and control group only with calcium phosphate bone cement. Clinical parameters such as blood cell count, biochemistry, and CT/X ray were examined at 1, 3 and 6 months after implantation of the balloon and bone cement. After that, the specimens were fixed for pathological analysis.
RESULTS AND CONCLUSION: The operation was performed under general anesthesia with no eventful infusion of bone cement. The expansion of balloon was satisfactory without definite extravasation of bone cement in the experimental group. In the control group, cement diffusion was found with pulmonary embolism occurring in three New Zealand rabbits. No statistical significance for blood cell counts and biochemistry was found between pre- and postoperation or between two groups. The materials in the two groups had favorable biocompatibility with injured bones without obvious immunological response. In the experimental group, the balloon wall was thinned and partial bone tissues grew into the cement at 1 month; at 3 months, a large amount of bone tissues grew into the cement and cement volume diminished; at 6 months, the balloon disappeared and only a small amount of cement left in the bone tissues. In the control group, it was difficult to determine when the cement degraded. The biodegradable mesh-like microporous balloon combined with calcium bone cement is superior to bone cement alone in the management of vertebral fractures.

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Key words: nanofibers, fractures, biocompatible materials

中图分类号:

R318

谢志勇，刘训伟，钟建，魏岱旭，叶勇，杜艳霞，孙钢. 椎体成形过程中磷酸钙骨水泥及可降解网状微孔球囊的应用[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(47): 7566-7572.

Xie Zhi-yong, Liu Xun-wei, Zhong Jian, Wei Dai-xu, Ye Yong, Du Yan-xia, Sun Gang . Calcium phosphate bone cement and biodegradable mesh-like microporous balloon for vertebroplasty[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(47): 7566-7572.

图/表（结果） 5

2.1 实验动物数量分析 实验用新西兰兔48只，实验术中2只因股骨骨折放弃入组，对照组灌注磷酸钙骨水泥时因骨水泥渗漏致肺栓塞死亡3只，补充实验动物5只，术后动物饲养情况同术前，术后及观察期未出现动物感染及死亡，最终新西兰兔48只进入结果分析。

2.2 球囊膨胀及骨水泥渗漏的观察 实验组在灌注磷酸钙骨水泥过程中球囊逐渐膨胀，呈椭圆球形，在X射线下未见明确骨水泥渗出，球囊与输送装置结合紧密，无球囊脱离现象发生，球囊松解后，球囊位置无移动。对照组骨水泥直接进入骨小梁间隙，3只因骨水泥溃散渗漏入髂静脉，通过肺循环进入肺动脉，引起肺栓塞导致动物死亡(图2)，发生率为11%。

2.3 影像学检查 术后1个月时，实验组兔股骨内骨水泥形态呈球形，对照组形态不规整；3个月后，实验组形态仍保持，股骨内见骨小梁长入，对照组骨水泥降解速度较实验组快，骨小梁形态恢复；6个月后，骨水泥基本降解，股骨内见粗大骨小梁，见图3。

术后1个月时，对照组有1只股骨内骨水泥完全降解，新骨组织未形成的情况发生，查对照组其余动物，磷酸钙骨水泥仍存在于股骨内，本只动物进一步证实磷酸钙骨水泥降解时间的不确定性^[25]，见图4。

2.4 血液指标检测 在术前、术后1，3，6个月时，两组血细胞、血清碱性磷酸酶和钙磷指标手术前后组间和组内比较差异均无显著性意义，见表1。

2.5 组织学检测 标本在脱钙过程中磷酸钙骨水泥丢失，因此未能显示出新生骨组织与磷酸钙骨水泥及球囊的关系，脱钙苏木精-伊红染色病理图片只是显示出成骨细胞活跃，骨组织周围无明显免疫反应。硬组织切片显示：①实验组：术后1个月时有小的骨组织通过球囊膜进入磷酸钙骨水泥孔隙内；3个月时球囊膜变薄，磷酸钙骨水泥内见广泛分布的骨髓组织；6个月时骨小梁交织成网状，其内少量磷酸钙骨水泥残留。②对照组：术后1个月时显示骨组织与磷酸钙骨水泥结合紧密，有骨组织探入磷酸钙骨水泥孔隙内，3个月时进入磷酸钙骨水泥内的骨组织增多，6个月时骨小梁已进入磷酸钙骨水泥内交织成网。两组在术后1个月时均见有骨组织进入磷酸钙骨水泥孔隙，差异性不明显；3个月时实验组新骨生长情况较对照组活跃，6个月时实验组骨小梁增生情况明显优于对照组，见图5。

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引言

经皮椎体成形、经椎体后凸成形现已成为临床上治疗骨质疏松性椎体压缩性骨折最重要的手段。目前植入材料以聚甲基丙烯酸树酯骨水泥为主，聚甲基丙烯酸树酯骨水泥刚度强、硬度大，与骨弹性模量差异较大，植入后易导致弹簧效应，引起邻近椎体骨折^[1-6]，且其不可降解性、无骨传导和诱导活性及单体毒性，可导致伤椎再骨折发生^[7-9]。

磷酸钙骨水泥具有自行固化、生物相容、逐步降解等特性，有较好的生物相容性、骨传导性，在椎体内可逐渐被新骨取代，恢复椎体的骨量^[10]，但存在注射时易固液分离、遇水溃散、强度低、不适宜承重骨等缺点^[11]。目前，虽对磷酸钙骨水泥进行改良或改性研究^[12-20]，但未有大规模临床应用报告。为此，本课题组采用生物高分子材料，应用静电纺丝技术，制备出可降解网状微孔球囊，利用球囊的包裹性能，提高磷酸钙骨水泥的承压能力，防止磷酸钙骨水泥过多接触体液而溃散，对球囊性能、生物相容性及力学研究证实球囊在体外符合具有预先设计的要求^[21-23]。

为进一步观察可降解网状微孔球囊植入时的改变、机体的免疫反应，球囊能否保证钙盐骨水泥的降解和骨组织生长相匹配情况，遵循动物实验原则，本课题组首先应用小动物新西兰兔建立骨折模型；新西兰兔椎体较细小，穿刺套件和球囊无法安全进入，而新西兰兔股骨头处血供丰富，体液环境与椎体相似，且承受质量大于椎体部位，可模拟人类椎体的受力，因此课题组选择股骨头作为实验部位，穿刺后用骨钻建立骨折模型，通过植入球囊并灌注磷酸钙骨水泥检验可降解网状微孔球囊的性能，并与直接灌注磷酸钙骨水泥相比较，通过检验学、影像学和组织病理学来评价可降解网状微孔球囊联合磷酸钙骨水泥治疗骨折的效果，验证可降解网状微孔球囊在临床应用的可行性。

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材料方法

设计：对比观察动物实验。

时间及地点：于2013年1月至2014年6月在解放军济南军区总医院医学影像科、实验诊断科、病理科及动物实验中心完成。

材料：可降解网状微孔球囊以聚乳酸-已内酯共聚物(P(DLLA-CL))为原材料，采用静电纺丝技术在纳米技术及应用国家工程研究中心实验室制备。

实验动物：健康成年新西兰兔48只，雄性22只，雌性26只，体质量2.5-3.0 kg，由解放军济南军区总医院动物实验中心提供，许可证号SCXK(鲁)2010-0005。实验对动物的处理方法符合《关于善待实验动物的指导性意见》^[24]。将新西兰兔随机均分成对照组与实验组，于左下肢股骨头端分别填充磷酸钙骨水泥和可降解网状微孔球囊+磷酸钙骨水泥。

实验方法：

骨折模型制作与分组干预：麻醉成功后，将新西兰兔固定在固定架上，左下肢部位备皮后消毒、铺洞巾，在DSA透视监视下穿刺进入股骨上段，利用骨钻建立通道并制造骨小梁骨折模型，对照组在透视监视下直接灌注磷酸钙骨水泥0.5 mL至套管内，利用穿刺针芯缓慢推入进入股骨骨折部位，灌注结束后，撤出套管，穿刺点压迫止血；实验组建立骨折模型后，引入球囊输送装置，经输送装置灌注磷酸钙骨水泥0.5 mL，应用推杆将骨水泥推入球囊内，并用可降解栓子将球囊尾端封闭，解脱并撤出输送装置，其余操作同对照组。手术过程见图1。

于术后1，3，6个月时采集血液标本并将动物处死，每一时间点8只/组。取手术部位标本，先行X射线摄片，CT扫描，明确植入物的位置、变化，再将标本按照规定大小截取，用40 g/L多聚甲醛固定后行组织学观察。

主要观察指标：

球囊膨胀及骨水泥渗漏的观察：在X射线透视下观察实验组的球囊膨胀过程中有无破裂及脱离，球囊内骨水泥渗出情况；对照组骨水泥在骨骼内的分布及有无外溢。

影像学检查：标本首先通过X射线检查可清楚显示骨小梁形态，整体显示植入物改变情况。CT扫描数据可通过多平面重建技术清晰显示磷酸钙骨水泥的形态，以及植入物降解、骨组织生长情况。

血液指标的检测：于术前及术后各时间点，经耳缘静脉采取血液，利用兽用血液细胞分析仪和生化仪检测血细胞计数和微量元素及血清碱性磷酸酶数值，各取6个标本进行测试，取统计值。

组织学检测：样品用40 g/L多聚甲醛固定24 h后，将标本均分为2部分，一份置于复方甲酸溶液中脱钙3 d，梯度乙醇脱水，常规石蜡包埋切片，苏木精-伊红染色；一份流水冲洗24 h，梯度乙醇脱水，用聚甲基丙烯酸甲酯包埋，凝固后切片并研磨抛光，用VAN GIESON-苦味酸品红染色。光学显微镜下观察植入物周围骨组织形态学变化。

统计学分析：采用SPSS Statistics 17.0统计软件进行分析。数据以x(_)±s表示，所得数据进行配对t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

1987年法国Galibert等^[26]首次报道经皮穿刺注射骨水泥治疗颈椎血管瘤获得成功后，经皮椎体成形、经皮椎体后凸成形以其微创、安全性已在临床得到广泛应用，并成为临床上治疗椎体压缩性骨折的主要手段。随着骨水泥外溢、椎体高度恢复不足、邻近椎体继发骨折的发生，国内外学者通过应用不同类型的骨扩张器、骨水泥包裹系统试图解决这些问题，对于减少手术并发症起到一定的作用^[27-31]。但椎体内植入的骨水泥仍为聚丙烯酸甲酯骨水泥，其为非生物材料，硬度大、不降解、无骨诱导作用，不能实现椎体内的骨性融合，可引起弹簧效应，在剪切力和骨质疏松加重的条件下可引起椎体内骨水泥块的松动，导致继发骨折。因此椎体内植入材料应该是具有良好的成骨作用，与椎体相似的抗压强度，以及降解时间与骨组织生长相匹配的性能。本课题组尝试应用聚乳酸-已内酯共聚物(P(DLLA-CL))，利用静电纺丝技术制备可降解网状微孔球囊，通过球囊植入椎体后，向球囊内灌注磷酸钙骨水泥，球囊可承受一定的压力，在灌注过程中可抬高压缩椎体的高度，又能避免其他骨扩张器撤出时的高度丢失，同时球囊的包裹作用可完全防止骨水泥渗漏及遇水溃散的问题，增加了磷酸钙骨水泥的承重能力。球囊和磷酸钙骨水泥均为可降解材料，在降解过程中保证局部Ca²⁺浓度，为成骨创造了良好条件，并最终为正常骨组织替代。

实验结果显示可降解网状微孔球囊具有较好的防渗漏性，实验组磷酸钙骨水泥灌注后呈“橄榄球”形，与周边骨组织结合紧密，未见到磷酸钙骨水泥溃散现象；而对照组出现3例骨水泥溃散导致动物死亡的发生，说明球囊对磷酸钙骨水泥防渗漏和溃散的作用明显。

聚乳酸-已内酯共聚物具有较好的生物可降解性、生物相容性和可吸收性，但降解产生的酸性代谢物会降低其周围组织的pH值，对细胞生长、增殖产生影响，引起周围组织纤维化和机体免疫反应。椎体和股骨头具有丰富的血供和较多的回流静脉，血液流速较快，因此聚乳酸-已内酯共聚物降解产物对pH值的影响不大，血液学检查也未提示有明确免疫反应发生。

磷酸钙是人和动物骨骼中的主要无机成分，具有良好生物相容性、骨传导性及生物可降解性，固化后的磷酸钙骨水泥具有多孔结构，能够促进新生血管在基质中形成及纤维结缔组织的增生，能容纳大量的成骨细胞，而且这些相通的均匀孔径在组织修复过程中有利于营养物质的运输，有利于组织的快速长入。实验中有椎体内形成空洞，说明磷酸钙骨水泥存在降解时间的不确定性。可降解网状微孔球囊的包裹使磷酸钙骨水泥植入后受体液影响较小，更好的形成固化状态，同时也保证了磷酸钙骨水泥在椎体内的降解速率。X射线、CT及组织病理学表明，球囊的包裹和降解更能保证磷酸钙骨水泥降解与骨组织生长时间相匹配，且球囊的微孔不妨碍骨组织通过球囊膜伸入到磷酸钙骨水泥间隙。新生骨组织和磷酸钙骨水泥形成微观绞锁，增加了骨折部位对抗剪切力的能力，进一步增加了稳定性。

总之，可降解网状微孔球囊使磷酸钙骨水泥应用到承重骨成为可能，较好的降解特性使骨组织可完全替代植入物，实现体内无异物存留，避免了经皮椎体成形、经皮椎体后凸成形手术继发问题的出现。本课题所用新西兰兔股骨作为椎体实验的替代品，主要是因为穿刺套件和球囊较大，无法植入小动物椎体内，新西兰兔股骨头端血供丰富，环境与椎体相似，可模仿椎体内环境，但与实际椎体比较仍有差别，还需进一步的研究证实。

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Calcium phosphate bone cement and biodegradable mesh-like microporous balloon for vertebroplasty

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