聚乳酸/羟基磷灰石纳米复合物对MC3T3-E1细胞增殖活性的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.43.007

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (43): 6929-6934.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.43.007

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聚乳酸/羟基磷灰石纳米复合物对MC3T3-E1细胞增殖活性的影响

李敏，唐元，atik badshah shaikh，史占军，王健

南方医科大学南方医院关节与骨病外科，广东省广州市 510515

收稿日期:2014-09-14 出版日期:2014-10-15 发布日期:2014-10-15
通讯作者: 王健，副主任医师，副教授，南方医科大学南方医院关节与骨病外科，广东省广州市 510515
作者简介:李敏，女，1986年生，重庆市人，汉族，南方医科大学南方医院在读硕士，主要从事骨与关节疾病研究。
基金资助:
广东省科技厅项目(2011B090300016，S2011040003467)

Nano-hydroxyapatite/polylactic acid biomaterials influence proliferative ability of MC3TC-E1 cells

Li Min, Tang Yuan, Atik Badshah Shaikh, Shi Zhan-jun, Wang Jian

Department of Joint and Bone Surgery, Nanfang Hospital of Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China

Received:2014-09-14 Online:2014-10-15 Published:2014-10-15
Contact: Wang Jian, Associate chief physician, Associate professor, Department of Joint and Bone Surgery, Nanfang Hospital of Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China
About author:Li Min, Studying for master’s degree, Department of Joint and Bone Surgery, Nanfang Hospital of Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China
Supported by:
the Project of Guangdong Provincial Science and Technology Bureau, No. 2011B090300016, S2011040003467

摘要/Abstract

摘要：

背景：研究表明聚乳酸/羟基磷灰石复合材料与自然骨结构和性能相似，具有骨传导性和良好的生物相容性。
目的：观察聚乳酸/羟基磷灰石纳米复合物与成骨细胞株MC3T3-E1的生物相容性。
方法：分别采用普通完全培养基(对照组)与聚乳酸/羟基磷灰石纳米复合物浸提液(实验组)培养第3代成骨细胞株MC3T3-E1，培养3，5，7 d，采用CCK-8法检测细胞的吸光度值；在培养第7，14天检测细胞碱性磷酸酶、骨钙素、Ⅰ型胶原、核心结合因子α1/成骨特异性转录因子表达。将聚乳酸/羟基磷灰石纳米复合物与第3代成骨细胞株MC3T3-E1共培养，培养7，14 d细胞骨架染色及扫描电镜观察细胞在支架材料上的形态。
结果与结论：随着时间的延长，成骨细胞株MC3T3-E1的吸光度值明显增加，两组细胞吸光度值比较差异无显著性意义。实验组培养第7天细胞碱性磷酸酶活性高于对照组(P < 0.05)，培养第14天细胞碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原、核心结合因子α1/成骨特异性转录因子表达高于对照组(P < 0.05)。种植7 d后细胞在材料上贴附生长，细胞呈多角形；种植14 d后细胞较7 d前数目明显增多，且完全伸展，呈多角形和梭形。表明聚乳酸/羟基磷灰石纳米复合物对成骨细胞有良好的生物相容性，无细胞毒性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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关键词: 生物材料, 纳米材料, 成骨细胞, 细胞培养, 纳米羟基磷灰石, 聚乳酸, 细胞增殖, 生物相容性

Abstract:

BACKGROUND: Studies have shown that polylactic acid/hydroxyapatite (PLA/HA) composite materials have structure and properties similar to natural bone, exhibiting bone conductivity and good biocompatibility.
OBJECTIVE: To evaluate the biocompatibility of nano-hydroxyapatite/polylactic acid (n-HA/PLA) biomaterials with MC3T3-E1 cells.
METHODS: The isolated third generation MC3T3-E1 cells were cultured in complete medium (control group) and n-HA/PLA extract (experimental group) for 3, 5, and 7 days. The material cytotoxicity was determined by Cell Counting Kit-8. Expression of alkaline phosphatase, osteocalcin, type I collagen, core binding factor α1/ osteoblast-specific transcription factor were tested by Real Time-PCR at days 7 and 14 after culture. MC3T3-E1 cells were inoculated onto the biomaterials of n-HA/PLA. Immunofluorescence and scanning electron microscope were use to observe MC3T3-E1 cell morphology and attachment at days 7 and 14 after culture.
RESULTS AND CONCLUSION: The osteoblast proliferation rates in the experimental and control groups were increased gradually with time, and there was no difference in the absorbance between the two groups. At day 4, the activity of alkaline phosphatase was higher in the experimental group than the control group (P < 0.05); at day 7, the expressions of alkaline phosphatase, type I collagen, core binding factor α1/osteoblast-specific
transcription factor were higher in the experimental group than the control group (P < 0.05). Cells began to grow adherently on the materials at day 7 after co-culture, and present a polygon shape. At day 14, cells on the scaffold increased significantly in number and fully extended with polygon and fusiform morphology. These results reveal that n-HA/PLA biomaterials have good cell compatibility and no cytotoxicity.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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Key words: hydroxyapatites, osteoblasts, materials testing

中图分类号:

R318

李敏，唐元，atik badshah shaikh，史占军，王健. 聚乳酸/羟基磷灰石纳米复合物对MC3T3-E1细胞增殖活性的影响[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(43): 6929-6934.

Li Min, Tang Yuan, Atik Badshah Shaikh, Shi Zhan-jun, Wang Jian. Nano-hydroxyapatite/polylactic acid biomaterials influence proliferative ability of MC3TC-E1 cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(43): 6929-6934.

图/表（结果） 2

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引言

骨缺损后的修复与重建一直是骨科领域的热点和难点。自体或异体骨移植、人工材料替代物置入、假体置换等方法虽已应用于临床上，但都有各自的局限性，限制了其广泛应用。显微外科技术的发展虽为骨缺损修复重建注入了新的活力，提出了新的方向，但仍有其不足之处，临床上尚未广泛应用。

组织工程学的发展使组织工程技术治疗骨缺损成为目前研究的热点^[1]。在骨组织工程研究中，细胞、支架材料、细胞和材料的相互作用是研究重点，理想的骨替代材料应具有良好的相容性、机械耐受性、生物降解性、诱导再生性，材料应该有一个三维与多孔隙结构，以允许细胞生长和物质运输，表面利于细胞黏附和增殖，且对细胞和组织无毒副作用^[2-3]。

羟基磷灰石是骨中无机物的主要成分，由于其良好的生物相容性和骨传导性，成为组织工程中常用的生物活性材料^[4]，但由于脆性大，限制了它的广泛应用。近年来的研究表明，羟基磷灰石/聚乳酸复合材料等与自然骨结构和性能相似，具有骨传导性和良好的生物相容性，临床应用前景广阔^[5-7]。Lee等^[8-9]将纳米羟基磷灰石/聚乳酸与人骨髓干细胞复合体外培养，发现复合材料不仅不影响骨髓干细胞生长，还增强该细胞的碱性磷酸酶及成骨基因的表达，有明显的促进钙离子矿化作用。刘冰等^[10]用无水乙醇将纳米羟基磷灰石复合胶原/聚乳酸材料经湿化后，使内部孔隙均匀地吸附骨形态发生蛋白2，制备出具有良好骨诱导性的活性复合支架材料，该材料在小鼠肌肉中成骨量是单纯骨形态发生蛋白2的10.5倍，为临床上用于修复骨缺损奠定了理论基础。黄江鸿等^[11]的体外降解实验表明，在聚D，L-丙交酯/纳米羟基磷灰石复合材料降解过程中由于纳米羟基磷灰石粒子的掺入，降低了聚乳酸在降解前期产生的酸性产物而导致的酸度值，从而减少或避免由于酸性物质引起的无菌性炎症反应，提高了聚合材料的生物相容性。目前尚无文献报道利用聚乳酸/羟基磷灰石纳米复合物制作捆绑带。

本实验应用体外细胞培养技术，选用小鼠成骨细胞株MC3T3-E1细胞，从成骨细胞增殖活性的角度来探讨聚乳酸/羟基磷灰石纳米复合物对细胞的相容性，为进一步制作骨折内固定捆绑带材料的研究提供实验基础。

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材料方法

1 材料和方法 Materials and methods

设计：体外细胞学观察实验。

时间及地点：于2013年8月至2014年5月在广州南方医院中心实验室完成。

材料：成骨细胞株MC3T3-E1购买于美国模式培养物集存库American type culture collection。

聚乳酸/羟基磷灰石纳米复合物细胞相容性实验用主要试剂：
试剂	来源
胎牛血清	南美血清
高糖DMEM培养基，内含体积分数为10%的胎牛血清、青霉素100 kU/L、链霉素10 kU/L	corning公司
胰蛋白酶、二甲基亚砜、CCK-8溶液	Sigma公司
LIVE/DEAD 细胞活性检测试剂盒	life 公司

实验方法：

支架材料的准备：聚乳酸/羟基磷灰石纳米复合材料由武汉理工大学生物材料与工程研究中心实验室制备^[12]。根据实验需要将材料加工成长7 mm×7 mm、高2 mm的四方柱状，孔径为100-300 μm，孔隙率为85%，环氧乙烷消毒备用。

材料浸提液的提取：将制备好的聚乳酸/羟基磷灰石纳米复合材料剪裁成20 mm×10 mm×0.3 mm大小，分别称取各块材料质量，制作浸提液前将材料置于超净工作台中正反各用紫外灯照射30 min，已确保材料无菌。在超净工作台中，取剪好的材料用镊子装入5 mL EP管中，按照每 33.3 mg材料的比例加入1 mL高糖DMEM培养基。之后置于37 ℃恒温振荡箱中(100 r/min)。24 h后取出浸提液，过滤除菌，分装后置于-80 ℃冰箱中备用，此浸提液用于后续细胞学实验。

成骨细胞增殖率(CCK-8试剂盒)与相关基因表达检测：将培养的第3代成骨细胞株MC3T3-E1稀释至细胞浓度为3.5×10⁸ L^-¹，用加样器吸取0.1 mL细胞悬液，加入到4块6孔板中，将每块6孔板分为实验组与对照组，对照组向培养孔中加入充足的高糖DMEM完全培养基[含体积分数10%胎牛血清、1%双抗(青霉素100 kU/L、链霉素 10 kU/L)]，实验组用聚乳酸/羟基磷灰石纳米复合材料浸提液培养，每二三天更换培养液。

在培养第3，5，7天时将每组各2孔消化后各制成1 mL的细胞悬液，加入100 μL/孔的细胞悬液至96孔板中，每组重复5孔，空白对照组为100 μL无细胞的培养基，再每孔加入10 μL的CCK-8液，继续培养1.5 h，在酶标仪上以490 nm波长测定吸收光度。在培养第7，14天时将剩余孔的细胞用TRIzol试剂提取总RNA，以看家基因GAPDH作为基准，RT-PCR半定量检测成骨相关基因碱性磷酸酶、骨钙素、Ⅰ型胶原、核心结合因子α1/成骨特异性转录因子的表达情况。

聚乳酸/羟基磷灰石纳米复合材料与成骨细胞直接培养：将已备好的聚乳酸/羟基磷灰石纳米复合材料放入96孔板中，加入完全培养基至完全浸泡材料，置于恒温培养箱中过夜后，加入细胞浓度为3.5×10⁸L^-¹的细胞悬液20 μL，再置于恒温培养箱中培养4 h，加入100 μL完全培养基，每两三天换液。

材料中成骨细胞的荧光染色：将培养第7，14天的材料-细胞复合物取出，PBS洗涤3次后用LIVE/DEAD细胞活性检测试剂盒染色，倒置显微镜观察。

材料中成骨细胞的扫描电镜观察：将培养第7，14天的材料-细胞复合物取出，PBS洗涤3次后2.5%戊二醛固定，PBS清洗2次，体积分数10%，30%，50%，70%，80%，90%，100%，100%梯度叔丁醇逐级脱水，每个浓度脱水 10 min，加入体积分数100%叔丁醇0.5 mL每孔，至-20 ℃冰箱隔夜，放入冷冻干燥机，冷冻干燥5 h左右，直至样品干燥完全，表面喷金，扫描电镜观察材料表面细胞生长情况。

主要观察指标：聚乳酸/羟基磷灰石纳米复合材料与成骨细胞的生物相容性。

统计学分析：定量数据以x(_)±s表示，组间两两比较采用t 检验的方法。定性数据使用χ²检验。

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讨论

自20世纪90年代以来，聚乳酸因其良好的生物相容性和可吸收性，迅速发展成为新一代可完全降解高分子材料的热点，受到了世界各国的广泛关注和深入研究，并被美国FDA批准为生物降解性医用材料^[13]。它是以微生物发酵产物L-乳酸为单体，用化学合成方法聚合而成的，其降解产物基本上都是水或二氧化碳一类的小分子，对生物体本身无毒无害^[14]，具有较好的机械强度、弹性模量和热成型性，在骨组织和软骨组织的再生与修复等骨组织工程中基本能满足作为细胞生长载体材料的要求；不足之处在于其机械强度较差，不具有骨传导性。纳米羟基磷灰石是一种具有代表性的生物活性材料，是现在人工骨材料研究的一个热点，其具有良好的骨传导性能和生物活性，能与骨组织形成牢固的骨性结合，促进骨骼生长，并且相态比较稳定，无毒性、无炎性，是公认的性能良好的骨修复替代材料^[15]。但纳米羟基磷灰石也自身存在的一些不足，如抗疲劳性差，生物可吸收性差，压缩强度较低，替代速度慢，植入体内后可能出现疏松、迁移、破坏等。目前，研究最多的是纳米羟基

磷灰石与聚乳酸复合的人工骨材料，将这两种材料进行复合则有望使其相互取长补短，从而得到理想的骨替换材料。与目前应用的非降解性材料相比，人工合成可吸收聚合材料具有以下优势：①可按照不同的聚合单体和聚合方式合成具有不同机械强度和降解速率的聚合材料，为骨缺损修复提供早期力学支撑。②避免二次手术取出，减少患者痛苦和医疗费用。③可按照需求设计不同形状和构型，为骨组织长入、细胞黏附及增殖提供良好的三维孔隙结构。④可作为骨生长因子的控释载体，提高材料的骨诱导性能。⑤组织相容性好，无毒，不致畸，能安全用于人体。⑥降解产物无毒，能通过生理排泄系统排出体外。⑦来源不受限制，消毒、运输方便^[16]。目前，聚乳酸/羟基磷灰石纳米复合人工骨材料正处于研发阶段，前期实验证实：当纳米羟基磷灰石含量为20%时，聚乳酸/羟基磷灰石纳米复合材料的抗弯强度为 175 MPa，能很好地满足人体自然骨的生物力学要求^[17]。人工骨进入人体后将与组织和细胞直接接触，因此，人工骨需要有很好的生物相容性。此外，还需为种子细胞的长入提供足够的支架空间。Chen等^[18]研究聚乳酸对成骨细胞增殖及分化的影响，将成骨细胞和聚乳酸复合培养，在电镜下观察发现，和对照组相比，成骨细胞成群的生长，并且多边形和星形细胞比例明显增多，碱性磷酸酶活性降低，然而这种影响在实验的前3 d比较明显，之后基本没变化，指出聚乳酸对成骨细胞增殖及分化有一定的促进作用。Chung等^[19]认为组织工程骨移植通过骨传导和骨诱导两种方式修复骨缺损，不仅宿主骨与移植骨桥接部有新骨形成，材料周围和内部也有新骨形成。

本实验采用乳液共混法制备的聚乳酸/羟基磷灰石纳米复合材料具有良好的孔隙率和降解特性，孔径为100-300 μm，孔隙率为85%，支架的有效空间大，不仅能保证良好的骨传导性，而且为种子细胞黏附、分化及成骨提供更好的场所^[20]。细胞伸展形态在细胞的生长过程及各项功能如细胞生存力、迁移能力、增殖活性及分化能力中均有重要作用^[21-23]。复合材料的纳米级特性能调节细胞整合素和细胞内局部黏附装置的分布，进而引起细胞骨架和机械性能的变化，所以改变细胞形态^[24-26]。免疫荧光染色及扫描电镜观察均显示MC3T3-E1细胞在聚乳酸/羟基磷灰石纳米复合材料表面均黏附紧密，细胞完全伸展开来，呈梭形或多角形，随着培养时间的延长，细胞数量明显增多，细胞间可见桥接，说明聚乳酸/羟基磷灰石纳米复合材料可为细胞提供良好的贴附环境。

CCK-8实验是检测细胞增殖活性和细胞毒性的常用方法，已被广泛应用于医用材料的生物学评价和免疫学肿瘤学研究。细胞的表面黏附是增殖及其他功能表达的前提条件，进一步用CCK-8检测细胞的增殖活性，结果表明在同样的接种条件下，培养3，5，7 d后细胞在浸提液和普通完全培养基中的增殖能力无显著差异，说明复合材料的浸提液对细胞增殖无抑制作用。碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原、骨钙素、核心结合因子α1/成骨特异性转录因子作为成骨细胞鉴定和功能评价的指标，其中碱性磷酸酶是早期成骨分化的标志^[27]，Ⅰ型胶原是骨组织中含量最多的蛋白，它的表达由一套不同因子复杂地调控完成^[28]，骨钙素为晚期基质沉积和矿化指标^[29]，核心结合因子α1/成骨特异性转录因子是与成骨细胞分化及软骨细胞成熟相关的重要的转录因子^[30]。半定量RT-PCR检测基因表达结果显示，实验组和对照组在培养7 d后成骨基因表达除碱性磷酸酶外其余各基因表达比较差异均无显著性意义，在培养14 d后，实验组成骨相关基因碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原、核心结合因子α1/成骨特异性转录因子的表达显著高于普通培养基组，以碱性磷酸酶增高最为明显，表明材料浸提液有促进细胞成骨作用。

聚乳酸/羟基磷灰石纳米复合材料有良好的生物相容性，对MC3T3-E1细胞无毒副作用，同时促进支架材料上细胞的成骨分化，是骨组织工程中极具研究前景的一种支架材料，为进一步骨折内固定材料可吸收捆绑带的研发提供了理论依据。本实验的不足之处在于未做纳米羟基磷灰石材料的对照组，不能对比复合材料较单纯纳米材料有更好的细胞黏附作用和促成骨作用。

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本实验采用乳液共混法制备的聚乳酸/羟基磷灰石纳米复合材料具有良好的孔隙率和降解特性，孔径为100-300μm，孔隙率为85％，支架的有效空间大，不仅能保证良好的骨传导性，而且为种子细胞黏附、分化及成骨提供更好的场所。细胞伸展形态在细胞的生长过程及各项功能如细胞生存力、迁移能力、增殖活性及分化能力中均有重要作用。复合材料的纳米级特性能调节细胞整合素和细胞内局部黏附装置的分布，进而引起细胞骨架和机械性能的变化，所以改变细胞形态。免疫荧光染色及扫描电镜观察均显示MC3T3-E1细胞在聚乳酸/羟基磷灰石纳米复合材料表面均黏附紧密，细胞完全伸展开来，呈梭形或多角形，随着培养时间的延长，细胞数量明显增多，细胞间可见桥接，说明聚乳酸/羟基磷灰石纳米复合材料可为细胞提供良好的贴附环境。CCK-8实验是检测细胞增殖活性和细胞毒性的常用方法，已被广泛应用于医用材料的生物学评价和免疫学肿瘤学研究。细胞的表面黏附是增殖及其他功能表达的前提条件，进一步用CCK-8检测细胞的增殖活性，结果表明在同样的接种条件下，培养3，5，7d后细胞在浸提液和普通完全培养基中的增殖能力无显著差异，说明复合材料的浸提液对细胞增殖无抑制作用。碱性磷酸酶、I型胶原、骨钙素、核心结合因子α1/成骨特异性转录因子作为成骨细胞鉴定和功能评价的指标，其中碱性磷酸酶是早期成骨分化的标志，I型胶原是骨组织中含量最多的蛋白，它的表达由一套不同因子复杂地调控完成，骨钙素为晚期基质沉积和矿化指标，核心结合因子α1/成骨特异性转录因子是与成骨细胞分化及软骨细胞成熟相关的重要的转录因子。半定量RT-PCR检测基因表达结果显示，实验组和对照组在培养7d后成骨基因表达除碱性磷酸酶外其余各基因表达比较差异均无显著性意义，在培养14d后，实验组成骨相关基因碱性磷酸酶、I型胶原、核心结合因子α1/成骨特异性转录因子的表达显著高于普通培养基组，以碱性磷酸酶增高最为明显，表明材料浸提液有促进细胞成骨作用。

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Nano-hydroxyapatite/polylactic acid biomaterials influence proliferative ability of MC3TC-E1 cells

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[1]	李偲, 赵婷, 谭戈, 郑雨林, 张若男, 吴艳, 唐俊明. 血小板源生长因子BB可促进骨骼肌成肌细胞增殖、分化与迁移[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1050-1055.
[2]	王丰, 周立宇, 赛吉拉夫, 齐士斌, 马艳霞, 韦善文. CaMKⅡ-Smad1促进外周神经的轴突再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1064-1068.
[3]	刘聪, 刘肃. miR-17-5p调控低氧诱导因子1α介导脂肪细胞分化及血管生成的分子机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1069-1074.
[4]	马泽涛, 曾晖, 王德利, 翁鉴, 冯松. 微小RNA-138-5p与软骨细胞增殖和自噬的关系[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 674-678.
[5]	王玉姣, 刘丹, 孙嵩, 孙勇. 改良型富血小板纤维蛋白复合双相磷酸钙可促进兔骨髓间充质干细胞的活性[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 504-509.
[6]	周继辉, 姚猛, 王岩松, 李新志, 周游, 黄卫, 陈文瑶. 新型纳米支架对神经干细胞生物行为及相关基因表达的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 532-536.
[7]	刘江锋. 纳米羟基磷灰石/聚酰胺66复合材料联合锁定钢板治疗股骨骨纤维异常增殖症[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 542-547.
[8]	李黎, 马力. 磁性壳聚糖微球固定化乳糖酶及其酶学性质[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 576-581.
[9]	陈扬, 黄邓高, 高元慧, 王顺兰, 曹卉, 郑琳麟, 何浩伟, 罗思琴, 肖敬川, 张应爱, 张淑芳. 低强度脉冲场超声促进人脂肪间充质干细胞的增殖和黏附[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 3949-3955.
[10]	王秋霏, 顾叶, 彭育沁, 薛峰, 巨荣, 朱锋, 王熠军, 耿德春, 徐耀增. 人工假体磨损颗粒作用下Wnt/β-catenin信号通路对成骨细胞的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(24): 3894-3901.
[11]	唐小凯, 李伟明. Nel样分子1型蛋白在脊柱融合术后促进骨性融合的作用与机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(24): 3914-3920.
[12]	周武, 王彬娉, 王雅雯, 程亚楠, 黄谢山. 转化生长因子β和骨形成蛋白2联合诱导小鼠成骨细胞系MC3T3-E1细胞的增殖与分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3630-3635.
[13]	李鑫平, 崔秋菊, 曾曙光, 冉高英, 张兆强, 刘显文, 方炜, 徐帅妹. β-磷酸三钙/壳聚糖水凝胶改性对牙髓干细胞生长与矿化的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3493-3499.
[14]	刘利永, 周雷. 组织工程用水凝胶研发现状和发展趋势：基于专利信息的分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3527-3533.
[15]	周安琪, 唐渝菲, 吴秉峰, 向琳. 骨膜组织工程设计：共性与个性的结合[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3551-3557.