在心肌组织工程构建中的心肌干细胞：认识现状与预测未来

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.37.029

摘要/Abstract

摘要：

背景：长期以来，人们认为成年哺乳动物的心肌是终末分化的组织，没有再生能力。心肌细胞一旦受损将由纤维结缔组织取代。
目的：重新认识心肌细胞，对心肌干细胞的相关研究做一综述，以明确心肌干细胞的存在。
方法：计算机检索中国期刊网全文数据库以及PubMed数据库2003至2014年期间有关心肌干细胞的文章。检索词分别为“心肌干细胞，干细胞，心脏再生”和“cardiac stem cells，stem cells，cardiac regeneration ”。初检得到82篇文献，最终纳入文章40篇。
结果与结论：心脏中存在具有再生潜能的心肌干细胞，现已研究出一些心肌干细胞的表面标记物。心肌干细胞的研究为临床治疗某些心肌细胞损伤性疾病开辟了崭新的思路，但心肌干细胞的数量较少，如何分离纯化、培养鉴定，并扩增为满足再生医学和组织工程需要的心肌细胞还有待于进一步研究，心肌干细胞的研究将为心肌组织工程研究开辟崭新的途径。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 移植, 心肌干细胞, 心脏再生, 综述

Abstract:

BACKGROUND: For a long time, the myocardium of adult mammalians is the terminally differentiated tissue with no regeneration capacity. If damaged, myocardial cells will be replaced by fibrous connective tissue.
OBJECTIVE: To rediscover the myocardial cells and to do a review for cardiac stem cells, in order to define the existence of myocardial cells.
METHODS: A computer-based online research of CNKI and PubMed databases was performed to collect articles published between 2003 and 2014 with the key words of “cardiac stem cells, stem cells, cardiac regeneration” in Chinese and English, respectively. There were 82 articles after the initial survey, and finally 40 articles were included in result analysis.
RESULTS AND CONCLUSION: Cardiac stem cells exist in the heart, and some surface markers of cardiac stem cells have been discovered. Cardiac stem cells for some diseases with myocardial cell injury have opened up a new way. Because of the small number of myocardial cells, how to purification, culture, identification and proliferation will be further studied to meet the need for regenerative medicine and tissue engineering. Cardiac stem cell research will open a new approach for cardiac tissue engineering.

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Key words: stem cells, myocardium, regeneration, review

中图分类号:

R318

李润琴，黄春. 在心肌组织工程构建中的心肌干细胞：认识现状与预测未来[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(37): 6064-6068.

Li Run-qin, Huang Chun. Cardiac stem cells in cardiac tissue engineering: present and future[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(37): 6064-6068.

图/表（结果） 1

2.1 心肌纤维的特点 长期以来，人们都认为心肌细胞的特殊之处是：自动物出生之日起，心肌细胞就作为永久细胞只能通过体积的增大而代偿，不能通过数目的增多而再生。发表在2013年Pnas杂志的一篇论著^[7]：美国波士顿儿童医院心脏研究实验室研究表明，动物的心肌细胞有增殖和再生的潜能。他们对左心室心肌细胞增殖的研究证实了从出生后到20岁心肌细胞有增殖和再生能力，但仅见于年轻人。通过刺激心肌细胞的增殖潜能可能被用于治疗很多心脏疾病。有研究显示，在成年哺乳动物的心肌细胞表面表达具有多种干细胞相关抗原，这些细胞具有心肌干细胞的潜能，能够自我复制^[8]。心肌干细胞对心脏的修复与心脏的生长因子有关，这些表达干细胞相关抗原的心肌细胞在生长因子的作用下能重建室壁^[9]。因此，虽然成人心肌细胞被称为永久细胞，但通过解除阻断仍具有再生潜能而不是一个终末分化的器官^[10]。心肌干细胞的研究将为心肌组织工程研究开辟崭新的途径。

2.2 心脏损伤后的再生治疗 心肌受损后的再修复已经成为再生医学领域中发展最快的部分。把死亡或受损的心肌细胞替换为新的心肌细胞可能是一个逆转心脏疾病的理想方式。然而，成人心脏主要是晚期分化心肌细胞，没有明显的再生能力。最新研究表明干细胞有巨大的再生潜力，因此，当前心脏再生的研究专注于干细胞，使其作为替代受损心肌的来源用于心脏治疗。未来发展方向是努力改善当前干细胞的研究策略和方法^[11]。干细胞疗法的临床意义是改善心肌梗死后心脏重构，诱导有功能心肌的再生和新构建血管的形成^[12]。一旦心肌梗死导致心力衰竭，会有大量心肌纤维死亡，所以要达到心脏损伤后的再生治疗，需要有充足数目的自体心肌纤维和保证移植后进入受到损伤的宿主心脏的心肌纤维能够与宿主心肌纤维形成有效机械偶联，并且使心肌纤维能够同步收缩。除此之外，新移植的心肌干细胞是否能够接受神经内分泌的调节？及这些新生的心肌纤维是否具有接触性抑制？在局部致炎因子的作用下，移植的心肌干细胞是否会被清除等等问题仍然等待科学家继续研究^[13]。

在以前的大量研究中，虽然已经证实干细胞治疗能够改善受损心肌的功能，但至今还没在已经梗死的心肌上建立与宿主心肌纤维同步收缩，并且可以复制的模型。以前的研究能够为现有心肌损伤后再修复的策略提供基础，并为有志于心肌纤维再生及其机制的探索提供研究思路。

2.3 心脏干细胞 表达转录因子Nkx2.5和Isl1的心脏祖细胞，能发育为心肌纤维，平滑肌纤维和血管内皮细胞^[14]。正常小鼠心脏发育过程中，Wt1基因表达位于心外膜上，这些Wt1⁺的前体心肌细胞能向全功能的心肌细胞分化。Wt1⁺的细胞起源于表达转录因子Nkx2.5、Isl1的心脏祖细胞，这些结果确定Wt1⁺心外膜细胞是先前未确认的心肌细胞的祖细胞，为利用心肌祖细胞促进心肌的再生和修复提供有力的依据^[15]。《自然》杂志也证实了Isl1心脏祖细胞的存在，2009年Bu研究小组对小鼠胚胎的研究，证实了多能心脏祖细胞的存在，心脏祖细胞可以发育为心脏中所有主要类型的细胞。对比小鼠的心脏发生发展，人类心脏细胞谱系有多元化扩张，具有不同的途径。这些结果为心血管疾病和人类心血管药物的再生治疗提供了新的研究思路^[16]。

麻省总医院心血管研究中心的研究报告发表于《细胞》杂志。在这篇研究报告里，科学家记录了对大鼠祖细胞的鉴别和克隆单一胚胎干细胞的过程，以及表明这些克隆细胞可以分化成心肌细胞、平滑肌细胞和内皮细胞。大鼠胚胎试管研究发现原始心脏组织里有少量Isl1表达细胞和另外两种重要蛋白质Nkx2.5和flk1^[17]。

《细胞》杂志刊载了另一篇研究方向相同的文章，来自于波士顿儿童医院司徒•沃金博士的实验室和哈佛干细胞研究所，他们发现表达蛋白质Nkx2.5的第一心区祖细胞能够产生心细胞和平滑肌细胞两种细胞。该文章的第一作者西恩•吴博士最近加盟麻省总医院心血管研究中心，他将与陈博士的研究小组对这些初步发现进行后续研究，包括弄清楚这两种祖细胞之间所存在的任何发展关系^[18]。心脏干细胞是有可能修复受损伤心肌的“候选人”，应用这种方法进行心脏修复的基本原理是体外扩增心脏干细胞到临床实验以及后期进行活组织检查，输送心肌干细胞到受损伤的心肌区域，使心肌干细胞再生，以此来治疗心力衰竭^[19]。

心肌梗死后的心脏是否拥有促进心肌再生的心肌干细胞池？为了这个目的，有人测定了20例急性心肌梗死患者的心脏、20例终末期梗死后心肌病的心脏和12例正常心脏的心肌干细胞生长和衰老的情况。结果发现急性心肌梗死心脏中的心肌干细胞数量明显增加，在终末期梗死后心肌病的心脏中心肌干细胞数量亦较少程度的增加。通过端粒酶活性成分来确定干细胞的生长：急性心肌梗死的心脏增加到28%、终末期梗死后心肌病的心脏增加到14%，而正常心脏为1.5%；来源于心肌干细胞的心肌细胞、平滑肌细胞和内皮谱系细胞在急性心肌梗死心脏中和终末期梗死后心肌病的心脏中分别增加了约85倍和25倍。然而，代表衰老的p16INK4a-p53阳性心肌干细胞也同样增多(急性心肌梗死：3.8%；终末期梗死后心肌病：9.6%；正常心脏：0.3%)，有功能活性的心肌干细胞的数量明显减少(急性心肌梗死： 26 000/cm³；终末期梗死后心肌病：7 000/cm³)。在7个急性心肌梗死的心脏中，自发再生的心肌细胞相互聚集。总之，人类心脏拥有心肌干细胞池，并且心肌缺血损伤可诱导心肌干细胞的激活^[20]。

2.4 心脏干细胞的标志和鉴定 2003年，Beltrami等首次从20-23个月龄的大鼠心肌内分离出一种in-c-kit⁺-CD45^--CD38^-细胞，其具有自我更新能力并能分化成心肌细胞、内皮细胞及平滑肌细胞。由于起源于心脏，缺乏血细胞系、心内皮祖细胞及骨髓造血干细胞的表面标记特征，因此判断此类细胞为心肌干细胞^[21]。心肌干细胞是指存在于胚胎和成体心脏中提交心肌谱系的多能干细胞，在成熟心肌中，具有高度自我更新和特异性心肌分化、增殖潜能的未分化细胞。

心肌干细胞体积较小，呈圆形或杆状，多为单个细胞核，微丝束排列不规则或平行排列，呈现出肌微丝装配和新闰盘形成的特征，并表达心肌特异基因心肌肌钙蛋白I(cTnI)、心肌肌钙蛋白T(cTnT)、心房肌球蛋白轻链(MLC-2A)、心室肌球蛋白轻链(MLC-2V)和α肌球蛋白重链(α-MHC)，也表达心肌转录因子GATA-4、Nkx2.5^[22]。心脏祖细胞早期表达Nkx2.5，GATA-4，MEF2C^[23]。心肌干细胞的研究采用c-kit、Sca-1、MDR1和Isl1等作为判断心肌干细胞的标志^[24]。识别标志不同，心肌干细胞主要包括c-kit⁺细胞群、Sca-1⁺细胞群及侧群(SP)细胞等。c-kit⁺的心肌干细胞数量相对最多。有研究显示c-kit⁺的大鼠心肌干细胞表达CD29、CD90，不表达CD11bc、CD34和CD45^[25]。

Hodgkiss-Geere取狗的心房组织培养并分离出成年心肌干细胞，这些细胞表达c-kit和GATA-4，心脏肌钙蛋白T和Nkx2.5表达水平低^[26]；干细胞向心脏的分化到一定程度后，心脏肌钙蛋白T和Nkx2.5表达增加，c-kit表达下调。Isl1基因的表达可以修复受损心肌，Isl1作为心肌祖细胞的标志之一受到广泛关注^[27] (表1)。心肌干细胞常用正常情况下多处于G₀期这个特性来鉴定，也就是LRC(label-retaining cell)法通过单细胞培养^[28]，它能分化为表面标志清楚的干细胞的特点及其具有无限扩增及其分化的潜能。鉴定时以此两点为主，再辅助表面标志物。

2.5 心肌干细胞扩增与临床应用 在中国，心肌干细胞的分离及体外扩增方法多采用免疫磁珠或流式细胞仪分离具有心肌干细胞表面标志物的心肌干细胞。国外研究表明心脏本身会分泌促进心脏干细胞生长的各种生长因子促进心肌梗死区域的心肌细胞的再生^[29-30]。有研究通过自体c-kit⁺的心肌干细胞进行冠状动脉旁路移植术治疗缺血性心脏病引起的心力衰竭^[31]。在研究中，33例患者(20例用心肌干细胞治疗的患者和13例对照组)通过右心耳收获和加工分离出心脏干细胞，心脏磁共振外科结果显示，心肌干细胞输入区域左室内径功能明显改善，梗死面积减少，心脏再生显著增加^[32]。为探讨年龄和疾病对内源性心肌祖细胞的影响，Chan等^[33]发现年龄或其他疾病对内源性心肌祖细胞没有影响。Ellison等^[34]使用的弥漫性心肌损伤导致的急性心力衰竭动物模型表明 c-kit⁺是心肌损伤修复和再生的必要和足够条件。

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引言

随着全世界人口老龄化，每年心脏疾病死亡数达到2 000万，而失代偿心衰治疗花费高达1 200亿美元，5年死亡率50%左右^[1]。心肌梗死是冠心病死亡的主要原因，也是导致心衰的主要原因之一。以2011年为例，中国有(50-60)万急性心肌梗死患者。β阻滞剂、ACEI和醛固酮受体拮抗剂等药物保护治疗旨在限制心肌缺血损伤；心脏同步化治疗以及辅助装置等旨在减少心衰死亡率，改善患者生活质量；但是对于心衰患者，心脏的再生治疗才能保留正常心肌功能。迄今心脏移植才是惟一有效治疗手段，然而，全球心脏移植供体短缺是巨大障碍。随着新治疗手段的探索，多能干细胞已经应用于心血管疾病再生治疗。经过多年基础与临床研究，包括干细胞分离、生长和输送，治疗安全性和机制的研究，给大家带来了新的曙光^[2]。

近期，科学家们发现了人的心脏中有可分化为所有主要心脏细胞的干细胞^[3]，人们称之为心肌干细胞，是指起源于发育成心脏自身的早期胚胎干细胞，不是起源于骨髓的细胞，其具有心脏再生的潜能。该发现为自体细胞用于受损心脏治疗开辟一条新的道路。心肌损伤的患者立即注射干细胞，可以预防缺血性心肌病或充血性心力衰竭的发生^[4]。

目前干细胞正处于技术瓶颈阶段，干细胞移植的效果在多数研究中基本上得到了肯定，但是还存在许多急待解决的问题，如干细胞治疗各种疾病的确切机制不清楚，移植后的远期效果如何等等^[5]。心肌干细胞的研究为心肌组织工程研究及临床治疗某些心肌细胞损伤性疾病开辟了崭新的思路^[6]。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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