断肢再植后肢体缺血再灌注损伤模型大鼠与补阳还五汤的干预影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.36.016

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (36): 5830-5835.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.36.016

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断肢再植后肢体缺血再灌注损伤模型大鼠与补阳还五汤的干预影响

张辉，袁治国，邵建军

甘肃省第二人民医院骨科，甘肃省兰州市 730000

修回日期:2014-07-11 出版日期:2014-08-30 发布日期:2014-08-30
通讯作者: 邵建军，主任医师，甘肃省第二人民医院骨科，甘肃省兰州市730000
作者简介:张辉，男，1983年生，陕西省镇安县人，汉族，2010年甘肃中医学院毕业，硕士，主治医师，主要从事中医骨伤科临床研究。
基金资助:
甘肃省中医药管理局资助项目(GZK-2012-9)

Effect of Bu Yang Huan Wu Decoction on ischemia reperfusion injury after limb replantation in rats

Zhang Hui, Yuan Zhi-guo, Shao Jian-jun

Department of Orthopedics, Second People’s Hospital of Gansu Province, Lanzhou 730000, Gansu Province, China

Revised:2014-07-11 Online:2014-08-30 Published:2014-08-30
Contact: Shao Jian-jun, Chief physician, Department of Orthopedics, Second People’s Hospital of Gansu Province, Lanzhou 730000, Gansu Province, China
About author:Zhang Hui, Master, Attending physician, Department of Orthopedics, Second People’s Hospital of Gansu Province, Lanzhou 730000, Gansu Province, China
Supported by:
a grant by Gansu Provincial Administration of Traditional Chinese Medicine, No. GZK-2012-9

摘要/Abstract

摘要：

背景：近年来，中医药在缺血再灌注损伤的临床诊疗中发挥着独特作用。
目的：探讨补阳还五汤在大鼠下肢断肢再植后缺血再灌注损伤中的影响，评估其对缺血组织的保护作用及机制。
方法：将120只Wistar大鼠随机均分为4组，正常对照组仅麻醉及灌胃给予生理盐水，其余3组建立下肢断肢再植后缺血再灌注损伤动物模型，补阳还五汤组再灌注即刻灌胃给予补阳还五汤10 mL/kg，依达拉奉组再灌注即刻尾静脉注射依达拉奉10 mL/kg，空白对照组灌胃给予生理盐水。再灌注24 h后，测定血液髓过氧化酶、乳酸脱氢酶、总一氧化氮合酶、诱导型一氧化氮合酶、结构型一氧化氮合酶水平；再灌注1周后，检测腓肠肌组织中超氧化物歧化酶活性、一氧化氮及丙二浓度、钙离子负载，采用RT-PCR半定量分析腓肠肌组织中bcl-2 mRNA和bax mRNA转录水平。
结果与结论：与空白对照组、依达拉奉组相比，补阳还五汤可有效降低肢体缺血-再灌注后氧自由基的产生，增强超氧化物歧化酶活性，减轻钙超载，减少血浆一氧化氮的大量生成，增强抗凋亡基因bcl-2的表达，减弱促进凋亡基因bax的表达，减轻肢体缺血再灌注后骨骼肌损伤程度。结果表明补阳还五汤对大鼠断肢再植后下肢缺血再灌注损伤具有明显的保护作用，能有效清除自由基，抑制骨骼肌细胞凋亡，减轻再灌注损伤。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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关键词: 实验动物, 组织构建, 补阳还五汤, 断肢再植, 肢体, 缺血再灌注

Abstract:

BACKGROUND: Traditional Chinese medicine plays a specific role in the clinical diagnosis and treatment of ischemia reperfusion injury.
OBJECTIVE: To investigate the effect of Bu Yang Huan Wu Decoction on ischemia reperfusion injury in rats after replantation of of lower limbs, and evaluate the protective effect and mechanism of ischemic tissue.
METHODS: A total of 120 Wistar rats were randomly divided into four groups: normal control (intragastric administration of saline after anesthesia), Bu Yang Huan Wu Decoction (intragastric administration of 10 mL/kg Bu Yang Huan Wu Decoction immediately after reperfusion), edaravone (intravenous administration of 10 mL/kg edaravone immediately after reperfusion), and blank control (intragastric administration of saline) groups. At 24 hours after reperfusion, the myeloperoxidase, lactate dehydrogenase, nitricoxide synthase, inducible nitricoxide synthase, constitutive nitricoxide synthase level in the blood were detected. At 1 week after reperfusion, the activity of superoxide dismutase in gastrocnemius tissue, nitrogen monoxidum and malondialdehyde, and the load of Ca²⁺ were assayed. RT-PCR semiquantitative analysis was performed to detect bcl-2 mRNA and bax mRNA transcriptional levels in the gastrocnemius.
RESULTS AND CONCLUSION: Bu Yang Huan Wu Decoction protected the rats from ischemia reperfusion injury by reducing the production of oxygen free radicals, reinforcing the activity of superoxide dismutase, lessening the calcium overload, decreasing the production of nitrogen monoxidum, up-regulating the expression of anti-apoptotic gene bcl-2, down-regulating the expression of pro-apoptotic gene bax, and attenuating the injury of skeletal muscle after ischemia reperfusion injury. Bu Yang Huan Wu Decoction has significant protection on cerebral ischemia reperfusion injury in rats after replantation of severed limb, which may be related to the scavenge of free radicals, inhibition of skeletal cells apoptosis, and attenuation of reperfusion injury.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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Key words: drugs, Chinese herbal, reperfusion injury, muscle, skeletal

中图分类号:

R318

张辉，袁治国，邵建军. 断肢再植后肢体缺血再灌注损伤模型大鼠与补阳还五汤的干预影响[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(36): 5830-5835.

Zhang Hui, Yuan Zhi-guo, Shao Jian-jun. Effect of Bu Yang Huan Wu Decoction on ischemia reperfusion injury after limb replantation in rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(36): 5830-5835.

图/表（结果） 3

2.1 实验动物数量分析 120只Wistar大鼠均进入结果分析。

2.2 各组动物肢体成活情况检测 再灌注1周后，观察再植后肢体成活情况。补阳还五汤组20只大鼠，肢体全部成活，成活率100%；空白对照组20只大鼠，术后有6只大鼠逐渐出现肢体坏死，成活14只，成活率70%，提示补阳还五汤组肢体成活率明显增高(P < 0.001)；依达拉奉组成活18只，成活率90%，与补阳还五汤组相比差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.3 血管吻合情况

吻合口通畅情况：术中见血管搏动良好，通畅实验良好。所有大鼠吻合口即时通畅率100%，各组间差异无显著性意义。

血管内膜情况：空白对照组吻合口处有少量血栓形成，依达拉奉组血管吻合口处不平整，欠光滑，有少量纤维组织依附，但血管通畅均不受影响；补阳还五汤组血管内膜均平整光滑，无狭窄或闭锁及血栓形成。

2.4 各组血清指标检测结果 再灌注24 h后，与正常对照组比较，补阳还五汤组、依达拉奉组血清中髓过氧化酶、乳酸脱氢酶、总一氧化氮合酶、诱导型一氧化氮合酶活性均增高(P < 0.001)，空白对照组血清中结构型一氧化氮合酶活性降低(P < 0.05)，补阳还五汤组血清中结构型一氧化氮合酶活性增高，差异有显著性意义(P < 0.05)；与空白对照组比较，补阳还五汤组、依达拉奉组血清中髓过氧化酶、乳酸脱氢酶、诱导型一氧化氮合酶活性均降低(P < 0.05)，总一氧化氮合酶、结构型一氧化氮合酶活性增高(P < 0.05)；与依达拉奉组比较，补阳还五汤组髓过氧化酶、乳酸脱氢酶、诱导型一氧化氮合酶活性均降低(P < 0.05)，结构型一氧化氮合酶、总一氧化氮合酶活性差异无显著性意义(表1)。

2.5 各组腓肠肌组织中超氧化物歧化酶、一氧化氮、丙二醛、Ca²⁺浓度的测定 下肢再植后24 h，与空白对照组相比，其余3组腓肠肌组织中超氧化物歧化酶活性、一氧化氮、丙二醛含量均明显降低，钙负载水平显著降低(P < 0.01)；与正常对照组相比，其余3组腓肠肌组织中超氧化物歧化酶活性、一氧化氮、丙二醛含量均显著升高，钙负载水平亦显著升高(P < 0.01)；与依达拉奉组相比，补阳还五汤组能有效降低血清中超氧化物歧化酶、一氧化氮、Ca²⁺含量(P < 0.05)，丙二醛含量差异无显著性意义(P > 0.05)，见表2。

2.6 RT-PCR检测结果 与正常对照组相比，其余3组骨骼肌bcl-2基因表达、bcl-2/bax的比值降低，bax基因表达增高，以空白对照组为甚；与空白对照组比较，依达拉奉组bcl-2基因表达、bcl-2/bax比值升高，bax基因下降(P < 0.05)，应用补阳还五汤后，bcl-2基因表达、bcl-2/bax比值进一步升高，bax基因进一步下降(P < 0.05，表3)。

2.7 各组大鼠骨骼肌苏木精-伊红染色结果 光镜观察显示，正常对照组大鼠骨骼肌肌纤维呈长条索状，肌浆丰富，每条肌纤维内均有多个紧贴肌膜内面的细胞核，排列整齐(图1A)；空白对照组大鼠骨骼肌缺血后肌纤维排列紊乱，增粗、水肿，部分肌纤维完整性、连续性破坏，肌细胞破坏，肌纤维间炎性浸润明显(图1B)；依达拉奉组肌纤维排列不整齐，肌纤维增粗、水肿，部分连续性遭到破坏，有少量白细胞与红细胞渗出(图1C)；补阳还五汤组骨骼肌仍有明显水肿，但较依达拉奉组为轻，肌纤维破坏较轻，细胞有少量破坏，排列较整齐，炎性浸润不明显(图1D)。

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引言

断肢(指)再植是指失去血液供应的离断肢体，通过手外科与显微外科手术重建其血液循环使肢体获得再生的手术^[1]。肢体离断后，有效循环血量瞬间大量减少，肢体迅速出现缺血性改变，当重建血液循环、恢复再灌注后，细胞结构、代谢、组织功能等方面出现损伤加重现象，这种损伤称为缺血再灌注损伤。断肢再植后常可引起肢体缺血再灌注损伤^[2]，严重的肢体缺血再灌注损伤不仅可以造成局部严重功能障碍、肢体坏死，导致截肢可能，亦可以造成心、肺、肾、胰腺、脊髓等远隔脏器及组织损伤，引起全身炎症反应综合征，甚至多器官功能不全综合征^[3-4]。缺血再灌注损伤机制尚无明确定论，目前研究认为与再灌注后细胞内Ca²⁺超载、氧自由基大量生成、微血管内皮细胞损伤及血管内皮细胞与白细胞/血小板之间相互作用，以及代谢产物毒素作用学说有关^[5]。大部分学者都倾向于氧自由基学说，认为氧自由基在缺血再灌注损伤过程中发挥着十分重要的作用，缺血组织再灌注时造成的微血管和实质器官损伤主要是由活性氧自由基引起的，在缺血组织中具有清除自由基的抗氧化酶类合成能力发生障碍，从而加剧了自由基对缺血后再灌注组织的损伤^[6]。如何减轻肢体缺血再灌注的损伤，降低肢体缺血再灌注后的致残率和死亡率逐渐成为研究的热点。

中药对肢体缺血再灌注损伤保护作用的研究也愈来愈受到重视^[7-14]。本实验以名方补阳还五汤为基础，建立大鼠下肢断肢再植后缺血再灌注损伤动物模型，再灌注即刻给予补阳还五汤灌胃，初步探讨补阳还五汤对大鼠下肢缺血再灌注损伤的影响，评估其对缺血组织的保护作用，为进一步开展临床上应用补阳还五汤防治断肢再植后肢体缺血再灌注损伤奠定基础。

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材料方法

设计：随机分组动物观察实验。

时间及地点：实验于2012年1月至2013年12月在甘肃省第二人民医院实验中心完成。

材料：

实验动物：成年健康雄性SD大鼠120只，清洁级，体质量250-320 g，由甘肃中医学院学院实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK2012-0106-0001418。将120只大鼠随机均分为4组，正常对照组、补阳还五汤组、依达拉奉组与空白对照组，后3组建立断肢再植后肢体缺血再灌注损伤模型。

主要仪器：SpectraMax 190酶标仪(Molecular Devices，美国)；TDZ4-WS低速台式离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)；756MC紫外分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)； FA 1004天平(上海精科天平厂)；原子吸收分光光度计(北京瑞利分析仪器公司，型号：UV-9100)；低温高速离心机(eppendorf公司，5415R型)；光学显微镜、摄像头(Olympus BX41、SPOT4-CCD，diagnostic公司)；透射电镜(荷兰菲利浦，TECNAL-10)；PCR扩增仪(eppendorf公司)；Versa Doc 5000Mp成像系统(BIO-RAD公司)。

实验方法：

断肢再植后肢体缺血再灌注损伤动物模型的建立：术前Wistar大鼠常规禁食12 h，自由饮水。3%戊巴比妥钠(事先用蒸馏水和戊巴比妥钠粉剂配制)30 mg/kg腹腔内注射麻醉，将大鼠仰卧固定于操作台上，在左后肢股三角处剪毛，于腹股沟处沿血管走行纵行切开皮肤、皮下组织，钝性分离缝匠肌后部，游离股动脉、股静脉和股神经，组织剪迅速切断动、静脉，在股动、静脉近端分别用动、静脉夹夹闭，并用张力带于股鞘下环绑扎肢体阻断侧支循环，以下肢急性缺血趾腹苍白、皮温降低为标准。4 h后行断肢再植，采用二定点间断缝合法，对动脉、静脉行端端吻合，吻合口无明显渗血，通畅实验良好，动脉搏动良好，解除张力带，恢复血液灌注。逐层缝合切口。再灌注4 h，后肢颜色恢复红润，制成缺血再灌注模型。

给药：正常对照组仅麻醉及灌胃给予生理盐水 10 mL/kg；补阳还五汤组缺血4 h后行血管吻合，断肢再植，再灌注即刻灌胃给予补阳还五汤10 mL/kg；依达拉奉组缺血4 h后行血管吻合，断肢再植，再灌注即刻灌胃给予尾静脉注射依达拉奉注射液10 mL/kg；空白对照组缺血4 h后行血管吻合，断肢再植，再灌注即刻灌胃给予生理盐水10 mL/kg。

主要观察指标：

血液标本的采集：每组选10只造模成功的大鼠，分别于再灌注24 h后处死，做中下腹正中切口，暴露下腔静脉用皮试针头穿刺自下腔静脉取静脉血2.0-3.0 mL，分离血清，测定血清中髓过氧化酶、乳酸脱氢酶、总一氧化氮合酶、诱导型一氧化氮合酶、结构型一氧化氮合酶的水平。

腓肠肌标本的采集：各组剩余20只大鼠在1周后脱臼处死，分别取左后肢腓肠肌组织后取约200 mg入冻存管低温保存测Ca²⁺负载；约200 mg腓肠肌组织用冰生理盐水冲洗后低温保存经后续处理测超氧化物歧化酶活性、一氧化氮及丙二醛浓度；50-100 mg入经DEPC水处理并灭菌的冻存管放入液氮中保存做RT-PCR。每只大鼠顺肌纤维方向切下大小约为0.1 cm×0.1 cm×0.2 cm的肌肉标本3块，用牙签小心移入装有预冷2.5%戊二醛的标本瓶内，4 ℃冷藏，用100 g/L中性多聚甲醛固定，经后续处理后普通光镜观察。

血管通畅情况观察：通畅实验检测血管吻合口再通情况。1周后处死大鼠，分别以吻合口为中心取长约4 cm血管组织，纵行剖开观察血管内膜情况。

RT-PCR检测：腓肠肌组织提取总RNA，采用RT-PCR半定量分析bcl-2 mRNA和bax mRNA转录水平。

苏木精-伊红染色：观察腓肠肌组织形态学变化。

统计学分析：以SPSS 15.0统计软件包进行统计分析,所有数据均以x(_)±s表示，组间样本均数比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

各种原因造成的肢体离断、血管损伤，肢体缺血是血管外科常见的病理生理过程，迅速重建血管的完整性，恢复缺血肢体的血液供应是肢体得以存活和保持功能的关键，但缺血组织再灌注又可导致其损伤的进一步加重，称为缺血再灌注损伤^[15]。组织损伤可进一步引发远隔器官的损伤，进一步发展可演变成全身炎性反应综合征，甚至多器官功能衰竭，危及生命。缺血再灌注损伤的概念最早由McCord^[16]在1985提出，到目前为止，学者们已经在多种组织、器官中发现再灌注损伤的存在^[17-18]。如何能消除再灌注损伤，进一步减少组织损伤，保护细胞功能和避免缺血坏死区扩大，是广大临床工作者非常关注的一个问题。

近年来，中医药在缺血再灌注损伤的临床诊疗中开始发挥其独特的作用，逐渐受到大家的关注。蓝旭等^[19]通过测定兔血浆中丙二醛、肌酸磷酸激酶、天冬氨酸氨基转移酶和乳酸脱氢酶含量，以及骨骼肌中丙二醛、髓过氧化酶活性，发现七叶皂苷钠能显著降低肌细胞线粒体钙含量，具有减轻肢体缺血-再灌注损伤，保护骨骼肌的作用。陈建常等^[20]通过研究发现丹参具有一定抗氧化作用，能减少氧自由基的产生，减轻细胞损伤，显著改善微循环，以达到减轻肢体缺血再灌注损伤的作用。还有研究认为银杏叶提取液可以减少骨骼肌髓过氧化酶、丙二醛含量，降低钙负载水平^[21]。李晖等^[22]研究认为黄芪能有效清除氧自由基的产生，提高超氧化物歧化酶的活性，显著改善内皮细胞的功能，从而减轻骨骼肌超微结构损伤。

补阳还五汤由王清任所创，方由黄芪、当归、芍药、川芎、桃仁、红花、地龙７味组成，大补元气，佐以活血，使亏损之五成元气恢复，是谓“还五”，而阳气重新周行全身回复“十全”，故称此方为“补阳还五汤”^[23]。现代医学研究表明，本方功能广泛，可抑制血小板聚集，抗血栓形成或溶血栓；扩张血管，增加血流量；改善血液流变性和微循环；增加心肌营养性并有强心作用；对急性缺血损伤有预防作用；对神经损伤有修复作用；可降血脂和抑制动脉粥样硬化斑块形成；耐缺氧和抗疲劳、抗炎并可提高免疫功能^[24-28]。

缺血再灌注损伤是个多因素共同作用的复杂临床过程，其损伤机制目前尚无明确定论^[29-32]，但多数学者认为氧自由基是造成缺血再灌注损伤的重要因素。Pack等^[33]在1999年提出，氧自由基的大量产生和细胞内钙超载，以及随之而来微血管功能障碍是导致缺血再灌注损伤发生的最根本的原因。

氧自由基对缺血细胞造成损害其主要的机制是造成脂质过氧化，丙二醛正是其过氧化代谢产物，通过测定丙二醛的含量，能够反映氧自由基体内代谢对机体所产生损伤的程度。超氧化物歧化酶是一种广泛的自由基清除剂，其活力的高低间接反应了氧自由基的含量, 而丙二醛的高低又间接反映了机体细胞受自由基攻击的严重程度。NO本身就是一种自由基，在再灌注损伤过程中，由于细胞内钙超载，可激活一氧化氮合酶，使NO增加，NO与O₂反应生成NO₂，可使超氧化物歧化酶的酪氨酸硝基化，从而使细胞发生缺血性改变^[34]。细胞缺血时ATP生成减少，细胞Na⁺-Ca²⁺交换增加，再灌后恢复了能量供应和ATP值，促进Na⁺-Ca²⁺交换，使细胞外钙大量内流，造成细胞内钙超载，Ca²⁺浓度升高可激活多种磷脂酶，促进蛋白质分解酶合成增加、人血小板活化因子合成增加；激活磷脂酶促进膜磷脂的分解，破坏细胞和线粒体膜及促进氧自由基形成，造成细胞严重损伤^[35]。

宋煊赫等^[36]通过对大鼠皮瓣缺血再灌注损伤的研究证明，钙离子拮抗剂可以显著提高皮瓣的超氧化物歧化酶活性和谷胱甘肽过氧化酶活性，并可显著降低丙二醛的含量。当肢体缺血达到一定程度，骨胳肌细胞受到损伤，细胞水肿，细胞膜通透性增高，细胞内含有的大量乳酸脱氢酶入血，因而血中乳酸脱氢酶活性变化可作为缺血后骨骼肌损伤的指标^[37]。bcl-2和bax对细胞凋亡的调控，与自身表达水平的高低及bcl-2/bax的比值密切相关，比值增加，细胞活性增加，反之则导致细胞凋亡^[38]。

依达拉奉是一种作用机制明确的新型自由基清除剂^[39]，主要通过提供电子直接清除羟自由基，抑制自由基的生成及细胞膜过氧化连锁反应，有效抑制氧自由基对机体造成的损伤，抑制细胞凋亡。依达拉奉在缺血再灌注早期通过清除过多的羟自由基，有效提高超氧化物歧化酶的活性，降低丙二醛、髓过氧化酶，抑制血管内细胞遭受氧自由基的损伤，减轻血管通透性，减少间质水肿、间质血管扩张及炎性细胞因子的释放，从而保护肌组织灌注正常和软骨组织未发生退行性改变^[40]。

本课题以依达拉奉作为对照组，研究结果表明：补阳还五汤能有效降低肢体缺血再灌注后氧自由基产生，增强超氧化物歧化酶活性，减轻有钙超载所导致肢体缺血再灌注损伤；能够减少血浆NO的生成；改善微循环，扩张血管，抗血小板聚集，抗血栓形成；降低钙超载，减轻内皮细胞损害，显著改善大鼠缺血再灌注后肢体修复状况，并明显提高断肢再植成活率；抑制大鼠血清乳酸脱氢酶活性的升高，减少血清丙二醛水平；通过增强抗凋亡基因bcl-2的表达和减弱促进凋亡基因bax表达，抑制肢体缺血再灌注后骨骼肌细胞的凋亡，减轻肢体缺血再灌注损伤。光镜下观察肢体缺血再灌注后骨骼肌苏木精-伊红染色图像，可以看到骨骼肌组织在缺血后出现肌纤维水肿，炎性细胞浸润；再灌注后组织水肿加重，大量炎性细胞浸润，出现肌纤维断裂、变性、溶解；而经补阳还五汤处理后的骨骼肌图像肌纤维水肿、变性、炎性细胞浸润相对依达拉奉组和空白对照组明显减轻，说明补阳还五汤能够改善肢体缺血再灌注后骨骼肌损伤程度。

综上所述，补阳还五汤对大鼠断肢再植术后肢体缺血再灌注损伤具有明显的保护作用，能增强超氧化物歧化酶活性，有效清除再灌注损伤后自由基的产生，抑制炎性因子的释放，抑制骨骼肌细胞的凋亡，达到对缺血再灌注损伤骨骼肌的保护作用。

本课题的不足在于目前尚无疗效确切的单味西药作为临床对照；没有对再植后成活肢体的功能进行评定，补阳还五汤在术后肢体功能重建中的保护、修复作用尚需进一步研究。

断肢再植后肢体缺血再灌注损伤模型大鼠与补阳还五汤的干预影响

Effect of Bu Yang Huan Wu Decoction on ischemia reperfusion injury after limb replantation in rats

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