正常成人粒细胞集落刺激因子动员外周血内皮祖细胞的生物学特性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.32.018

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (32): 5190-5196.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.32.018

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

正常成人粒细胞集落刺激因子动员外周血内皮祖细胞的生物学特性

白丽萍¹，赵志红1，陈冲¹，王金焕²，王振玲²，赵智刚²

1天津医科大学肿瘤医院检验科，国家肿瘤临床医学研究中心；天津市“肿瘤防治”重点实验室，天津市 300060；2天津医科大学肿瘤医院血液肿瘤科，天津市 300060

收稿日期:2014-07-17 出版日期:2014-08-06 发布日期:2014-09-18
通讯作者: 白丽萍，副主任技师，天津医科大学肿瘤医院检验科，国家肿瘤临床医学研究中心；天津市“肿瘤防治”重点实验室，天津市 300060
作者简介:白丽萍，女，1966年生，天津市人，汉族，副主任技师，主要从事干细胞生物学研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助(81172833)

Biological characteristics of endothelial progenitor cells derived from granulocyte colony-stimulating factor mobilized peripheral blood

Bai Li-ping¹, Zhao Zhi-hong¹, Chen Chong¹, Wang Jin-huan², Wang Zhen-ling², Zhao Zhi-gang²

1Department of Laboratory, Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital, National Clinical Research Center for Cancer, Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy, Tianjin 300060, China; 2Department of Hematology and Oncology, Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital, Tianjin 300060, China

Received:2014-07-17 Online:2014-08-06 Published:2014-09-18
Contact: Bai Li-ping, Department of Laboratory, Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital, National Clinical Research Center for Cancer, Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy, Tianjin 300060, China
About author:Bai Li-ping, Associate chief technician, Department of Laboratory, Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital, National Clinical Research Center for Cancer, Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy, Tianjin 300060, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81172833

摘要/Abstract

摘要：

背景：内皮祖细胞具有很好的临床应用前景，特别是作为种子细胞参与组织工程血管构建及疾病治疗。
目的：观察粒细胞集落刺激因子动员的外周血中内皮祖细胞的生物学特性。
方法：获取粒细胞集落刺激因子动员正常人的外周血单个核细胞，同时获取8例正常成人外周血单个核细胞作为对照。将获取的细胞接种在预铺纤维连接蛋白的培养皿中进行体外培养。FACS和免疫组化法检测获取细胞的免疫表型；采用MTT比色法和黏附能力测定实验检测内皮祖细胞的增殖和黏附能力；实时定量PCR检测血管形成相关细胞因子的表达；荧光标记的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-acLDL)吞噬实验鉴定内皮功能；将获取的细胞接种在含有血管内皮细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的基底膜胶中诱导血管生成。
结果与结论：动员后外周血和未动员外周血内皮祖细胞具有相似的细胞形态和免疫表型，FACS和免疫组化检测结果显示上述两种内皮祖细胞都表达内皮细胞特异性抗原CD34、CD31、FLK-1、ve-Cadherin、vWF和CD133。内皮细胞生长因子和基质细胞衍生因子1在动员后外周血内皮祖细胞中的表达水平增加；两种来源的内皮祖细胞都具有吞噬Dil-acLDL和在体外诱导血管生成的能力。但是，动员的外周血中内皮祖细胞的数量和增殖能力明显强于未动员外周血中的内皮祖细胞。结果可见动员后的外周血中可以分离出具有内皮祖细胞特性的细胞群体，该群体具有体外诱导血管生成的能力；与未动员的外周血内皮祖细胞相比，动员后外周血内皮祖细胞数量明显增加并具有更好的增殖能力。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

全文链接：

关键词: 干细胞, 培养, 内皮祖细胞, 粒细胞集落刺激因子, 动员, 外周血, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Endothelial progenitor cells have good prospects for clinical application; especially as seed cells, they are involved in construction of tissue engineered blood vessels and disease treatment.
OBJECTIVE: To investigate the biological characteristics of endothelial progenitor cells derived from granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) mobilized peripheral blood.
METHODS: Mononuclear cells from G-CSF mobilized peripheral blood (n=9) and normal adult peripheral blood (n=8) were obtained and cultured in expanded medium. The immunophenotype of endothelial progenitor cells was investigated by FACS and immunohistochemistry. Real-time PCR was used to detect the expression of different cytokines. Proliferation and adhesion ability of endothelial progenitor cells were detected by MTT assay and adhesion assay. Moreover, the abilities of vasculogenesis in vitro and Dil-labeled acetylated low density lipoprotein uptake were detected. The acquired cells were seeded onto the basilar membrane gel containing vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor to induce angiogenesis.
RESULTS AND CONCLUSION: Endothelial progenitor cells derived from G-CSF mobilized peripheral blood were similar to those from normal adult peripheral blood in phenotype and morphology. FACSs and immunohistochemistry showed that endothelial progenitor cells were positive for endothelial cell markers, such as CD31, vWF, CD34, FLK-1, VE-Cadherin and CD133. In addition, the expression of vascular endothelial growth factor and stromal cell-derived factor 1 were significantly increased in G-CSF mobilized endothelial progenitor cells. Moreover, endothelial progenitor cells derived from two sources possessed the abilities of angiogenesis in vitro and Dil-labeled acetylated low density lipoprotein uptake. But, the number and the proliferation ability of endothelial progenitor cells derived from G-CSF mobilized peripheral blood were better than that of endothelial progenitor cells derived from normal adult peripheral blood. These findings indicate that there is a population of cells with characteristics of endothelial progenitor cells in G-CSF mobilized peripheral blood. They possess the abilities of vasculogenesis in vitro. Moreover, compared to endothelial progenitor cells derived from normal adult peripheral blood, we could obtain more endothelial progenitor cells in G-CSF mobilized peripheral blood and those cells show better proliferation ability.

全文链接：

Key words: endothelial cells, granulocyte colony-stimulating factor, hematopoietic stem cell mobilization

中图分类号:

R394.2

白丽萍，赵志红，陈冲，王金焕，王振玲，赵智刚. 正常成人粒细胞集落刺激因子动员外周血内皮祖细胞的生物学特性[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(32): 5190-5196.

Bai Li-ping, Zhao Zhi-hong, Chen Chong, Wang Jin-huan, Wang Zhen-ling, Zhao Zhi-gang. Biological characteristics of endothelial progenitor cells derived from granulocyte colony-stimulating factor mobilized peripheral blood[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(32): 5190-5196.

图/表（结果） 2

2.1 内皮祖细胞的鉴定和形态学特点于倒置显微镜下观察，原代培养的贴壁细胞形态表现为梭形或多边形，胞浆丰富，核仁明显，呈不规则排列生长。传代后细胞形态不发生改变，当细胞融合后呈“铺路卵石样”。通过共聚焦显微镜观察，UEA-Ⅰ和DiLDL双染色阳性的细胞被认为是正在分化的内皮祖细胞，实验从粒细胞集落刺激因子动员的外周血和对照组(正常成人外周血)中都培养出内皮祖细胞(图1)。

通过对原代培养细胞的计数结果显示粒细胞集落刺激因子动员的外周血中内皮祖细胞的数量[(102.0±2.6)/视野(×200)]明显高于正常成人外周血中的内皮祖细胞[(59.0± 5.1)/视野(×200)，P < 0.01]。

粒细胞集落刺激因子动员的外周血中获取的内皮祖细胞可以在体外稳定培养6-8代，随后细胞增殖减慢，细胞形态变大，胞浆中颗粒增多，呈现老化状态；而正常成人外周血中的内皮祖细胞最多在体外培养5代，然后细胞呈现老化状态。

2.2 内皮祖细胞的免疫表型通过流式细胞仪检测内皮祖细胞的免疫表型，发现原代获取的内皮祖细胞表达CD31、FLK-1、VE-Cadherin、vWF和CD133。随着细胞传代，CD31和vWF的表达逐渐增加，而CD133的表达下降，从第3代起，已经检测不出CD133的表达。免疫组化法检测结果也显示获取的内皮祖细胞表达CD31、FLK-1、VE-Cadherin和vWF(图2)。

粒细胞集落刺激因子动员的外周血和对照组(正常成人外周血)中获取的内皮祖细胞具有相似的免疫表型。

2.3 内皮祖细胞的增殖和黏附能力采用MTT比色法检测了不同来源外周血内皮祖细胞的增殖能力，结果显示粒细胞集落刺激因子动员的外周血中获取的内皮祖细胞增殖能力明显强于正常成人外周血内皮祖细胞的增殖能力(0.84±0.03 vs. 0.47±0.04，P < 0.05)。

另外，还检测了不同来源外周血内皮祖细胞的黏附能力，结果显示粒细胞集落刺激因子动员的外周血中获取的内皮祖细胞，与正常成人外周血内皮祖细胞具有相似的黏附能力[(96.32±5.61)/视野(×200) vs. (104.12±2.68)/视野(×200)，P > 0.05]。

2.4 内皮祖细胞表达细胞因子采用实时定量PCR检测不同来源内皮祖细胞表达血管内皮细胞生长因子、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和基质细胞衍生因子1的能力。结果显示不同来源外周血内皮祖细胞表达相似的表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子；而血管内皮细胞生长因子和基质细胞衍生因子1在动员后外周血内皮祖细胞中表达明显高于正常成人外周血内皮祖细胞(P < 0.05，图3)。
2.5 内皮祖细胞体外诱导血管生成能力将不同来源的内皮祖细胞接种在Matrigel胶中，并加入含血管内皮细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的M199培养基进行诱导，结果显示：24 h之内细胞开始迁移，两三天后细胞迁移并聚集成立体球样结构。随后，以此球为中心向四周发出毛细血管样结构，并逐渐延长，通常诱导5-7 d逐渐形成相互交连的血管样结构(图4)。为进一步证明体外血管样结构形成过程是否与血管生成有关，在形成血管样结构之前，即诱导后第1天加入抗血管生成剂苏拉明，结果显示：三维培养体系未见管样结构形成(图4)。

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引言

材料方法

设计：对比观察实验。

时间及地点：实验于2012年7月至2013年4月在天津医科大学肿瘤医院实验中心完成。

材料：

标本资料：9例正常成人为造血干细胞移植供者(26-37岁，平均32岁)，接受粒细胞集落刺激因子(惠尔血，日本麒麟公司)600 μg/d，第5天采集外周血；对照组为8例正常成人(15-35岁，平均26岁)。

正常成人粒细胞集落刺激因子动员外周血内皮祖细胞实验主要试剂：
试剂	来源
细胞培养液M199	GibcoBRL公司
抗体FLK-1，CD31，CD133，vWF, VE-Cadherin	Santa Cruz公司
FITC标记荆豆凝集素Ⅰ(FITC-UEA-Ⅰ)、Matrigel胶、纤连蛋白、碱性成纤维细胞生长因子、二苯基四氮唑溴盐(MTT)	Sigma公司
苏拉明	ALEXIS BiochemicalsAlexis公司
内皮细胞生长因子、胰岛素样生长因子1	PeproTech公司
Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-acLDL)	MolecularProbe公司
SYBR试剂盒	Applied Biosystems公司

实验方法：

分离和培养外周血来源的内皮祖细胞：将获取的外周血用Ficoll分离液(密度1.077 g/cm³)分离单个核细胞。然后将细胞以5×10⁹ L^-¹的浓度接种在提前包埋了人纤维连接蛋白的直径为3.5 cm的培养皿中培养。在体积分数5%的CO₂、 37 ℃培养箱内孵育。每3 d更换培养基。当细胞融合约70%时，用0.25%的胰酶消化并以1∶1比例传代。

内皮祖细胞的鉴定：将细胞以5×10⁹ L^-¹的浓度接种在预铺玻片的35 mm培养皿中，玻片预先用纤连蛋白包埋；培养7 d后，加入4 mg/L乙酰化低密度脂蛋白(Dil-acLDL)及10 mg/L FITC标记荆豆凝集素Ⅰ(FITC-UEA-Ⅰ)；激光共聚焦显微镜下观察并照相(UEA-Ⅰ和DiLDL双染色阳性的细胞为正在分化的内皮祖细胞)。

流式细胞仪鉴定细胞的表型：用间接免疫荧光法检测内皮祖细胞的免疫表型。一抗为小鼠抗人的单克隆抗体CD31、CD133、VE-Calhesin、vWF和FLK1。细胞用洗液洗过后，加入FITC标记的二抗4 ℃孵育30 min。细胞洗2次，并悬浮在500 μL的PBS中，置于冰上待流式细胞仪检测。

免疫组织化学检测内皮细胞特异性表面标记：细胞爬片上细胞达到50%融合后，用40 g/L多聚甲醛固定30 min；应用免疫组织化学试剂盒检测CD31和vWF的表达，具体步骤参照试剂盒说明书；免疫荧光试剂盒检测FLK-1和VE-Cadherin的表达，具体步骤参照文献[11]。

MTT法检测内皮祖细胞的增殖能力：将5×10³细胞接种到包被有人纤维连接蛋白96孔培养板，37 ℃常规培养 5 d；每孔加10 μL MTT(5 g/L)，37 ℃培养4 h；弃上清液，加入二甲基亚砜(150 μL/孔)，于微量振荡器充分振荡 10 min；酶标仪检测，在波长490 nm下检测吸光度。

内皮祖细胞黏附能力的检测：将1×10⁵细胞接种到包被有人纤维连接蛋白3.5 cm培养皿中；37 ℃培养30 min，弃去上清；倒置显微镜下计数贴壁细胞(计数15个随机选择的200倍视野中的贴壁细胞)。

外周血内皮祖细胞的体外诱导血管生成：Matrigel三维体系培养，4 ℃包被96孔板，每孔加50 μL，37 ℃聚合 20 min。为诱导外周血内皮祖细胞的血管新生，1×10³个细胞接种在Matrigel胶上进行诱导。分化培养液为M199，其中含有体积分数为10%胎牛血清，50 μg/L血管内皮细胞生长因子，2 g/L成纤维细胞生长因子，1 g/L胰岛素样生长因子1，100 U/mL的青霉素和100 mg/L链霉素。为了进一步明确是否有血管生成，0.01%的血管形成抑制药苏拉明(Suramin)分别在诱导后1 d和8 d加入诱导分化体系中。

实时定量PCR检测细胞因子的表达：Trizol法提取细胞总RNA，以1%普通琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA质量，并测定RNA浓度及纯度。将细胞总RNA反转录为cDNA，再以cDNA为模板进行real-time PCR反应。反转录反应体系中含RT-引物0.5 μL，5×PrimeScript^TM缓冲液2 μL，PrimeScript^TM RT酶混合液0.5 μL，以RNase-free H₂O补充至10 μL，37 ℃、15 min，85 ℃、5 s反转录为cDNA，稀释4倍备用。以cDNA模板2 μL，SYBR Green实时定量PCR试剂盒检测血管内皮细胞生长因子、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和基质细胞衍生因子1的表达，具体操作参见试剂盒说明书。采用ABI 7300 Real Time PCR System进行PCR扩增及结果分析。2^-^ΔΔ^Ct法对相关基因进行相对定量。

主要观察指标：①外周血内皮祖细胞形态特征。②外周血内皮祖细胞增殖、黏附和表型特点。③外周血内皮祖细胞中细胞因子的表达。④外周血内皮祖细胞在体外诱导血管生成的能力。

统计学分析：采用SPSS 11.0软件进行统计分析，实验数据用x(_)±s表示，组间比较应用t 检验或者方差分析。

实时定量PCR引物：
血管内皮细胞生长因子	正义引物反义引物	AAT GCT TTC TCC GCT CTG AA GCT TCC TAC AGC ACA GCA GA
表皮生长因子	正义引物反义引物	TCT GGG TCA ATC CGA GAG AT TCG AGA GAA GCG AGA GAA GC
碱性成纤维细胞生长因子	正义引物反义引物	TTC ATA GCA AGG TAC CGG TTG AGA AGA GCG ACC CAC ACG
基质细胞衍生因子1	正义引物反义引物	TTT CAG ATG CTT GAC GTT GG GCG CTC TGC ATC AGT GAC

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讨论

既往研究证实在骨髓、外周血、胎儿肝脏和脐血中存在内皮祖细胞^[12-16]。但是诸多因素限制了上述来源内皮祖细胞的应用。例如胎儿肝脏和脐血中含有较多数量的内皮祖细胞，但是胎儿肝脏和脐血来源非常有限，而且从中获取的内皮祖细胞为异体来源细胞，可能存在排斥反应；骨髓中也有相当数量的内皮祖细胞，但是获取临床应用所需数量的内皮祖细胞，则需要获取大量骨髓，给供者带来痛苦和不便。外周血中内皮祖细胞数量稀少，采集足够数量的内皮祖细胞在技术上比较困难。因此寻找到一种易于获取内皮祖细胞的方法则可以促进其临床应用。

既往外周血造血干细胞移植的经验证实通过细胞因子的动员，大量造血干细胞可以由骨髓进入外周血，然后可以通过单个核细胞采集的方法获取足够数量的CD34⁺造血干细胞进行移植^[17-20]。CD34是造血干细胞和内皮祖细胞的共同表面标志，因此可以通过细胞因子动员的方法从外周血获得较多的内皮祖细胞，从而促进其临床应用。

虽然Gehling等^[21]和Takahashi等^[22]都从粒细胞集落刺激因子动员的外周血中分离到内皮祖细胞，但是他们的研究并没有系统阐明粒细胞集落刺激因子的动员效果和获取的内皮祖细胞的生物学特性。本实验获取了粒细胞集落刺激因子动员的外周血中的内皮祖细胞，并同正常成人外周血内皮祖细胞进行比较。发现粒细胞集落刺激因子动员的外周血中的内皮祖细胞在细胞数量和增殖方面明显强于未动员外周血获取的内皮祖细胞，而且保持了内皮祖细胞的功能，如ac-LDLd的摄取和血管生成能力。说明通过此方法可以得到足够数量的内皮祖细胞用于临床治疗或组织工程血管的构建。而且自体外周血来源的内皮祖细胞不存在排异反应，所以是非常理想的种子细胞来源。

虽然内皮祖细胞已经成为干细胞领域的研究热点之一，但是时至今日仍未发现能将内皮祖细胞与造血细胞和成熟内皮细胞完全区分开的特异性细胞表面标志。例如，CD34，VEGFR2和CD133在造血干细胞和内皮祖细胞上都表达，而CD34、vWF、Tie1、Tie2、VE-Cadherin又都在内皮祖细胞和成熟内皮细胞上表达^[23-30]。最初，CD34⁺细胞被认为是造血干细胞和内皮祖细胞的共同祖先细胞，因此人们利用CD34来分选、富集内皮祖细胞；随后的研究发现，在血管内皮生长因子的诱导下CD34^-CD14⁺细胞可表达vWF、VE-cadherin等，并可在体外形成三维管状结构，体内参与缺血肢体的血管再生^[31]。这一结果敦促学者们开始寻找新的内皮祖细胞表面标志，Asahara等发现CD34⁺和VEGFR2⁺细胞移植到后肢缺血的小鼠体内，移植后细胞可以在缺血部位新生血管，从而改善缺血后肢的毛细血管密度、血流灌注及坏死程度，而CD34^-组和FLK1^-组新生血管化现象则不明显。该研究提示内皮祖细胞应是CD34⁺ FLK1⁺细胞。CD133相对特异的表达于内皮祖细胞上，随着细胞分化成熟，CD133表达下降，成熟内皮细胞则不表达CD133。目前许多学者将CD34，FLK1，CD133作为相对特异的标记组合来筛选内皮祖细胞，但是这一组合仍然存在不足，因为最近研究分别从CD34^-、CD133^-和FLK1^-的细胞中分离出具有内皮祖细胞特性的细胞群体^[32-35]。

由于内皮祖细胞表面标志和来源的复杂性，很难通过表型检测来鉴别内皮祖细胞。在本研究中，通过细胞形态、增殖能力、细胞功能及表面标志等方面来检测获取的细胞是否具有内皮祖细胞的特征。结果显示：①粒细胞集落刺激因子动员后外周血中的贴壁细胞，在倒置显微镜下呈现为梭形或多边形，胞浆丰富，核仁明显，呈不规则排列生长。传代后细胞形态不发生改变，当细胞融合后形态呈“铺路卵石样”。该细胞可以在体外稳定培养6-8代，随后细胞增殖减慢，细胞形态变大，胞浆中颗粒增多，呈现老化状态。②既往研究证实UEA-Ⅰ和DiLDL双染色阳性的细胞是正在分化的内皮祖细胞。通过共聚焦显微镜观察到：粒细胞集落刺激因子动员的外周血和对照组(正常成人外周血)中都存在UEA-Ⅰ和DiLDL双染色阳性的细胞，随着细胞的传代，UEA-Ⅰ和DiLDL双染色阳性细胞逐渐减少。③获取的细胞具有ac-LDL摄取能力，对ac-LDL的摄取能力是内皮细胞特异性功能之一。④应用流式细胞仪检测内皮祖细胞系列表面标志，即VEGFR2、CD133、vWF、CD31、VE-Cadherin。结果显示上述表面标志均为阳性。随着细胞传代，VEGFR2、vWF、CD31的表达增加，而CD133从第3代起就检测不到，说明在体外培养过程中，细胞逐渐发生分化。⑤动员与未动员外周血内皮祖细胞表达相似的表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子；而血管内皮细胞生长因子和基质细胞衍生因子1在动员后外周血内皮祖细胞中表达明显高于正常成人外周血内皮祖细胞，提示动员后外周血内皮祖细胞具有更好的增殖及归巢能力。综合上述实验结果，可以认为在粒细胞集落刺激因子动员的外周血中存在具有内皮祖细胞特性的细胞群体。

内皮祖细胞的另一功能是参与血管生成和血管新生。传统认为血管生成只存在于胚胎发育阶段，而血管新生在胚胎和成体都存在。随着内皮祖细胞研究的深入，发现在出生后不仅存在着血管新生，也存在着依赖于内皮祖细胞的出生后血管发生。内皮祖细胞的这一功能决定了其在临床治疗(比如对冠心病、肿瘤性和创伤性疾病的治疗)和组织工程化血管的构建中发挥重要的作用^[36-37]。因此，通过血管生成实验一方面可以进一步证实获取的细胞是具有内皮祖细胞特性的细胞群体，另一方面可以阐明该细胞群体具有很好的临床应用前景。本研究结果显示血管内皮细胞生长因子和基质细胞衍生因子1在动员后外周血内皮祖细胞中表达明显高于动员前外周血内皮祖细胞；进而，将获取的细胞接种在细胞外基质胶上，通过血管内皮细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子诱导来观察血管生成情况。结果显示外周血来源的细胞在三维诱导培养体系Matrigel中迁移、聚集，最后形成立体血管丛。该结果说明粒细胞集落刺激因子动员外周血来源的内皮祖细胞具有很好血管生成作用，可以作为临床治疗和组织工程中的种子细胞来源。

综上所述，从粒细胞集落刺激因子动员的外周血和正常成人外周血中获取了具有内皮祖细胞生物学特性的细胞群体，与未用粒细胞集落刺激因子的外周血获取的内皮祖细胞相比，应用粒细胞集落刺激因子可以动员更多内皮祖细胞进入外周血，而且粒细胞集落刺激因子动员的外周血来源的内皮祖细胞具有更好的增殖能力。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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正常成人粒细胞集落刺激因子动员外周血内皮祖细胞的生物学特性

Biological characteristics of endothelial progenitor cells derived from granulocyte colony-stimulating factor mobilized peripheral blood

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