蛇床子素可促进体外培养神经干细胞的增殖

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.32.017

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (32): 5184-5189.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.32.017

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蛇床子素可促进体外培养神经干细胞的增殖

姚璎珈，胡昱，李少恒，教亚男，孔亮，陶震宇，杨静娴

辽宁中医药大学，辽宁省大连市 116600

收稿日期:2014-07-18 出版日期:2014-08-06 发布日期:2014-09-18
通讯作者: 杨静娴，教授，博士生导师，辽宁中医药大学，辽宁省大连市 116600
作者简介:姚璎珈，女，1990年生，辽宁省沈阳市人，满族，辽宁中医药大学在读硕士，主要从事神经干细胞修复与再生研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81173580)；国家自然科学基金资助对外交流与合作项目(81210108050)

Osthole promotes the proliferation of neural stem cells in vitro

Yao Ying-jia, Hu Yu, Li Shao-heng, Jiao Ya-nan, Kong Liang, Tao Zhen-yu, Yang Jing-xian

Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Dalian 116600, Liaoning Province, China

Received:2014-07-18 Online:2014-08-06 Published:2014-09-18
Contact: Yang Jing-xian, Professor, Doctoral supervisor, Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Dalian 116600, Liaoning Province, China
About author:Yao Ying-jia, Studying for master’s degree, Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Dalian 116600, Liaoning Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81173580; Projects of International Cooperation and Exchanges NSFC, No. 81210108050

摘要/Abstract

摘要：

背景：神经干细胞具有自我更新和多向分化潜能，但正常情况下，神经干细胞数目太少，且大部分处于静息状态，促进其增殖是神经干细胞治疗神经退行性疾病的关键。
目的：观察蛇床子素对体外培养的神经干细胞增殖作用的影响，分析其促进增殖能力的作用机制。
方法：体外培养神经干细胞，在增殖培养基中培养至第3代，加入不同浓度的蛇床子素 (10，50和100 μmol/L)作用24 h用CCK-8法检测细胞活力，再培养3，5，7 d后测量神经球半径，用免疫荧光组化法计数Ki67阳性细胞数目；再培养3 d后利用RT-PCR技术检测神经干细胞中Notch 1、Hes 1和 Mash 1基因表达的情况。
结果与结论：与正常组比较，50，100 μmol/L的蛇床子素具有明显促进神经干细胞增殖能力的作用，100 μmol/L作用最为显著，可引起Notch 1基因、Hes 1基因上调表达，对Mash 1基因基本无影响，说明蛇床子素对体外培养的神经干细胞具有促进增殖作用，其作用机制可能与激活Notch信号通路上的Notch 1、Hes 1基因有关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 培养, 神经干细胞, 鉴定, 增殖, 蛇床子素, Notch信号通路, Notch 1, Hes 1, Mash 1, 阿尔茨海默病, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Neural stem cells have self-renewal and multidirectional differentiation potential, but under normal circumstances, the number of neural stem cells is less, and most cells are in the resting state. Thus, to promote the proliferation of neural stem cells is the key to the treatment of neurodegenerative diseases.
OBJECTIVE: To investigate the effects of osthole on the proliferation of neural stem cells cultured in vitro, and to analyze its mechanism underlying promoting the proliferation.
METHODS: Neural stem cells were cultured in vitro, and passage 3 cells were cultured with different concentrations of osthole(10, 50 and 100 μmol/L). After 24 hours, cell vitality was determined by cell counting kit-8. After 3, 5, 7 days of further culture, the radius of neurospheres was measured, and Ki67-positive cells were counted by immunofluorescence staining. Meanwhile, after 3 days of further culture, the gene expression of Notch 1, Hes 1 and Mash 1 in neural stem cells was detected by RT-PCR.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control group, 50, 100 μmol/L osthole could obviously promote the proliferation ability of neural stem cells. 100 μmol/L osthole had the most significant effect and increased the expression of Notch 1 gene, Hes 1 gene, but it had no effect on Mash 1 gene. These results suggest that osthole can promote proliferation of neural stem cells cultured in vitro and its mechanism may be associated with activation of Notch 1 gene and Hes 1 gene in Notch signaling pathway.

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Key words: neural stem cells, heracleum, cell proliferation, signal transduction

中图分类号:

R394.2

姚璎珈，胡昱，李少恒，教亚男，孔亮，陶震宇，杨静娴. 蛇床子素可促进体外培养神经干细胞的增殖[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(32): 5184-5189.

Yao Ying-jia, Hu Yu, Li Shao-heng, Jiao Ya-nan, Kong Liang, Tao Zhen-yu, Yang Jing-xian. Osthole promotes the proliferation of neural stem cells in vitro[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(32): 5184-5189.

图/表（结果） 3

参考文献

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引言

神经干细胞是神经系统的先祖细胞，具有自我更新和多向分化的特性，可以分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞^[1]。体外培养中发现，神经干细胞可在丝裂原的作用下维持其增殖状态^[2]。但在正常情况下，脑内神经干细胞数目太少，且大部分处于静息状态^[3]，所以面对较难解决的神经退行性疾病，例如阿尔茨海默病，则可从促进神经干细胞增殖方面入手，研究和解决神经损伤疾病和神经功能缺失的问题。

根据查阅文献，发现许多中药均被不同程度作用于干细胞的研究，例如白藜芦醇可保护神经干细胞氧糖剥夺损伤^[4]，川芎嗪用于保护谷氨酸损害的神经元^[5]，在APP转基因小鼠神经干细胞诱导分化过程中，五味子酮可以明显降低Tau蛋白在396、262位点的磷酸化水平，减轻神经元损伤，但其磷酸化程度并未达到阴性细胞水平^[6]。通过本实验室对独活的研究结果，以及独活补肾益精的药理作用，认为独活活性单体成分蛇床子素在治疗阿尔茨海默病中具有明显的优势。

中药独活为伞形科植物重齿毛当归(Angelica pubescens Maxim.f. Biserrata Shan et Yuan)的干燥根^[7]，始载于《神农本草经》，具有祛风除湿、通痹止痛之功^[8]，效尤善补肾，化痰祛疲^[9]。现代药理学研究报道，独活具有解痉、抗菌^[10]、抑制细胞氧化损伤^[11]、抑制脑细胞凋亡的作用^[12]。所以实验选择独活活性单体成分蛇床子素，考察其对体外培养的神经干细胞增殖的影响，并通过Notch 1、Hes 1和 Mash 1基因的mRNA表达变化情况来初步探讨其影响神经干细胞增殖的机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：细胞学体外观察。

时间及地点：实验于2014年3至6月在大连生物医药研发中心F303实验室完成。

材料：

实验动物：新生2 d的昆明种小鼠乳鼠，购自大连医科大学实验动物中心，许可证：SCXK(辽)：2008-0002。

实验方法：

蛇床子素溶液配制：取0.002 44 mg的蛇床子素，溶于50 μL二甲基亚砜，再溶于950 μL的完全培养基，配制浓度为10 mmol/L的母液，再根据实验要求稀释成工作浓度。

神经干细胞培养：取新生2 d内的乳鼠，浸泡在体积分数为75%乙醇中5 min，取出乳鼠，将其固定在手术台上，用手术剪和镊子取出海马区，PBS清洗后，用镊子将海马区置于含有PBS的EP管内，用剪刀将海马区剪成糜糊状，置于离心机内离心。弃掉上清后，加入胰酶消化15 min，加入培养基终止消化，再次离心。弃掉上清后，加入完全培养基(DMEM/F12+2%B27+0.2 μg/L表皮生长因子+ 0.2 μg/L碱性成纤维细胞生长因子+1%P/S)，过筛网，并用针棒研磨，取出含有细胞的完全培养基后，再次离心。弃掉上清后，加入增殖培养基，以1×10⁹ L^-¹的浓度接种于24孔板内，放置在体积分数为5%CO₂培养箱中开始培养^[13]。

蛇床子素促进体外培养神经干细胞增殖实验所需的实验试剂和仪器：
试剂与仪器	来源
蛇床子素	中国药检所
DMEM/F12培养基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶(0.25%Trypsin)、双抗(100 U/mL青霉素+100 mg/L链霉素，P/S)	Gibco公司
碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子	Peptide公司
TRIzol试剂、B27	Invitrogen公司
二甲基亚砜	Sigma公司
CCK-8试剂盒	Dojindo公司
Nestin抗体	Millipore公司
FITC标记驴抗大鼠IgG抗体、Cy3标记驴抗兔子IgG抗体	Jackson公司
Ki67试剂	北京博奥森公司
RNAeas，DEPC，Triton X-100试剂	Amresco公司
RevertAid^TM First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒、PCR Master Mix Kit试剂盒	Thermo公司
24孔培养板	Cyagen公司
倒置荧光生物显微镜	日本尼康公司
超低温冰箱	青岛海尔股份有限公司
CO₂培养箱	Nuaire公司
紫外-可见光分光光度计	上海元析仪器有限公司
酶标仪	深圳迈瑞生物电子股份有限公司
凝胶成像仪	上海天能科技有限公司
水平核酸电泳仪	Bio-Rad公司
PCR仪	杭州朗基科学仪器有限公司

免疫光化学法鉴定神经干细胞：以每孔5×10⁸ L^-¹细胞浓度接种于96孔板，每孔体积为100 μL，培养24 h后，每孔加入40 g/L多聚甲醛固定，室温下用1%Triton X-100透化30 min，PBS清洗，再加入用1%BSA稀释的Nestin抗体和Ki67抗体，4 ℃孵育过夜。第2天吸去一抗，PBS清洗，分别加入FITC标记羊抗大鼠IgG和Cy3标记驴抗兔IgG二抗，室温孵育1 h，PBS清洗，再用DAPI染核15 min，PBS清洗后吸净培养孔内的液体，滴加少量抗荧光淬灭封片液，盖上盖玻片。置于倒置荧光显微镜下观察染色情况，重复拍照3次。

CCK-8法检测神经干细胞的增殖能力：将培养的神经干细胞打散为单个神经干细胞，以每孔100 μL的体积加入96孔板中，培养至第3天，蛇床子素组(10，50，100 μmol/L)加入不同浓度蛇床子素后继续培养24 h，正常组不加蛇床子素继续培养24 h。然后向每孔加入10 μL CCK-8溶液，将96孔板放在培养箱内继续培养4 h，用酶标仪测波长为450 nm处的吸光度，重复3次。

测量神经干细胞球半径：传代培养神经干细胞至第3代，将神经干细胞打散为单个细胞后，各组用10，50，100 μmol/L的蛇床子素作用24 h，再换成完全培养基培养，正常组正常培养，待培养至第3，5，7天分别拍照记录，再用ImageJ软件计量神经干细胞球半径。

RT-PCR检测Notch通路上的Notch 1、Hes 1和 Mash 1基因表达：将培养的神经干细胞打散为单个神经干细胞，培养于6孔板内，接种细胞浓度为1×10¹⁰ L^-¹，培养至第3天，蛇床子素组(10，50，100 μmol/L)加入不同浓度蛇床子素后继续培养24 h，正常组不加蛇床子素继续培养24 h，再培养3 d后离心弃去培养基^[14]。

提取总RNA：每孔加入1 mL TRIzol，吹打数次，冰浴5 min。每管内加入0.2 mL预冷的氯仿，剧烈振摇15 s，冰浴5 min，4 ℃离心，12 000 r/min，10 min。吸取上层水相，加入0.5 mL预冷的异丙醇，冰浴10 min，4 ℃离心，12 000 r/min，10 min。弃上清，加入体积分数为75%灭酶乙醇，吹打，4 ℃离心，7 500 r/min，5 min。自然风干10 min后溶于0.01%DEPC水，吹打，备用。

纯度及浓度测定：取RNA样品10 μL稀释至200 μL，用紫外分光光度计检测波长260 nm和280 nm处吸光度(A_{260，A₂₈₀)，纯度=A₂₆₀/A₂₈₀，浓度=A₂₆₀×稀释倍数× 40 μg/mL。}

cDNA合成：①将总RNA 3 μg，Olige (dT)₁₈ primer 1 μL加入EP管内，然后加nuclease-free Water至12 μL。根据说明书，在65 ℃孵育5 min，冰上冷却。②再加入4 μL 5×Reaction Buffer，1 μL RiboLock RNase Inhibitor (20 U/μL)，2 μL 10 mmol/L dNTP Mix，1 μL RevertAid M-MuL V RT(200 U/μL)，总体积至20 μL，轻轻混匀，然后42 ℃孵育60 min，最后70 ℃加热5 min终止反应。③加入Notch 1、Hes 1、Mash 1和内参β-actin引物，按下列反应体系分别进行PCR扩增：25 μL DreamTaq^TM Green PCR Master Mix(2X)，1.5 μL Forward primer，1.5 μL Reverse primer，2 μL Template DNA，20 μL nuclease- free Water，总体积为50 μL。以上步骤在冰上操作。④然后在95 ℃预变性2 min，1个循环；95 ℃变性，30 s，Notch 1、Hes 1、Mash 1和β-actin的退火温度分别为55.3 ℃、56.3 ℃、55℃和53 ℃，各30 s，72 ℃延伸，1 min，35个循环；最后延伸10 min，1个循环。用ImageJ图像分析软件对条带进行吸光度扫描，结果用相对吸光度表示，相对吸光度=吸光度_目的基因/吸光度_β-actin。

主要观察指标：①神经干细胞特异性标志物Nestin的表达，Ki-67免疫荧光染色阳性细胞数目。②对照组和蛇床子素组(10，50，100 μmol/L)神经干细胞球半径，细胞增殖活力。③RT-PCR检测Notch 1、Hes 1和Mash 1 mRNA的表达水平。

基因序列：
基因名称	类别	序列	bp值	DNA解链温度(℃)
Notch 1	上游下游	TCG TGT GTC AAG CTG ATG AGG A GTT GGC AGC TAC AGG TCA CAA	81	60.3 62.3
Hes 1	上游下游	GCA GAC ATT CTG GAA ATG ACT GTG A GAG TGC GCA CCT CGG TGT TTA	181	61.3 64.0
Mash 1	上游下游	AAG AGC TGC TGG ACT TTA CCA ACT G ATT TGA CGT CGT TGG CGA GA	122	62.3 60.0
β-actin	上游下游	GGG AAA TCG TGC GTG ACA T TCA GGA GGA GCA ATG ATC TTG	385	58.0 58.3

统计学分析：由第一作者用Graphpad Prism软件分析，数据以x(_)±s表示，计量资料采用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

阿尔茨海默病是一种严重的中枢神经退行性疾病，公认的特征性病理改变为：β样淀粉样蛋白的沉积并形成细胞外老年斑。另外，微管相关蛋白tau异常过度磷酸化，形成双股螺旋细丝，最终在脑内产生大量神经元纤维缠结以及神经元丢失、体积变小、突触丢失也是其病理表现^[15]。阿尔茨海默病的主要临床表现为：认知功能出现障碍、失用、失认、视觉空间、抽象思维技能损害等。近年来，随着中国人口老龄化的到来，阿尔茨海默病的发病率逐年上升，越来越引起人们的关注。中医认为阿尔茨海默病的病因为肾虚髓亏，痰饮阻滞，五脏失调，脑髓丢失。《本草纲目》中有记载“蛇床子味辛苦，性温功能入肾补命，祛风燥湿”，本实验根据其发病机制，精在下藏于肾，在上聚于脑，结合独活补肾益精的药理作用，推断出独活活性单体蛇床子素可能具有促进神经干细胞增殖的作用。通过实验，观察蛇床子素作用后可促进神经干细胞球半径变大，可增加Ki67阳性细胞数目，显示出蛇床子素确实具有促进神经干细胞增殖的作用。

神经干细胞的自我维持和增殖功能是受一种相邻细胞间介导的信号途径：Notch信号途径的调控。研究证实Notch信号通路在神经干细胞完成自我更新和分化的过程中发挥着非常重要的作用^[16-17]。刘菲菲等^[18]无菌条件下取SD大鼠胚胎端脑，无血清悬浮培养，形成第2代神经球后，将神经球消化成单细胞，分为神经球悬浮培养和单层贴壁培养，结果表明单层贴壁培养的神经干细胞更利于分化为神经元，脑源性神经生长因子为40 μg/L时能诱导出更高比例的神经元，脑源性神经生长因子可以诱导MASH1在神经干细胞分化过程中表达明显上升。尚红记等^[19]研究表明外源性碱性成纤维细胞生长因子对放射诱导的C17.2神经干细胞凋亡有抑制作用，Notch信号通路阻断剂DAPT促进辐射后神经干细胞的凋亡，碱性成纤维细胞生长因子抑制DAPT凋亡的作用，碱性成纤维细胞生长因子对放射诱导的神经干细胞的保护作用可能与Notch信号通路有关。龙海波^[20]认为大鼠损伤脊髓提取液在体外能够上调神经干细胞Notch1和Hes1 mRNA的表达水平；损伤脊髓提取液可能通过激活Notch信号通路参与对神经干细胞的增殖调控，主要是通过上调Notch1和Hes1的表达来实现的。蛇床子素能够促进神经干细胞的增殖，其可能与调控Notch 1、Hes 1、Mash 1的基因有关。实验检测了蛇床子素对神经干细胞的Notch通路的影响，Notch通路激活后，上调其效应物Hes 1，接受上游转录因子刺激后发生转录，激活的Hes基因可以维持神经干细胞状态，促进其增殖^[21-22]。Mash 1、Hes1均属于bHLH基因家族，Mash 1在神经干细胞增殖和分化中，被认为是促进分化基因，而Hes 1则是抑制分化基因^[23]。本实验利用RT-PCR技术，检测了神经干细胞中的Notch 1、Hes 1、Mash 1 mRNA的表达。结果显示与对照组比较，100 μmol/L组作用后可明显上调Notch 1，Hes 1，对Mash 1无明显的改变，这揭示蛇床子素可能是通过上调Notch 1、Hes 1来促进神经干细胞增殖的作用，即与Notch通路有关，为治疗阿尔茨海默病提供新的治疗依据。

总之，本实验通过体外培养和鉴定神经干细胞，用蛇床子素作用后，直接观察其促进神经干细胞的增殖作用，用RT-PCR技术检测出其增殖作用可能与激活Notch信号通路有关，为进一步研究促进增殖作用机制奠定基础。

蛇床子素可促进体外培养神经干细胞的增殖

Osthole promotes the proliferation of neural stem cells in vitro

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