骨髓间充质干细胞增殖分化能力可随鼠龄增长而下降

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.32.005

摘要/Abstract

摘要：

背景：骨髓间充质干细胞是理想的组织工程种子细胞来源，但是不同年龄的骨髓间充质干细胞体外增殖、分化特点有很大差异，有关年龄与骨髓间充质干细数量的关系目前尚缺少系统研究。
目的：观察不同鼠龄大鼠骨髓间充质干细胞诱导分化活性的差异。
方法：通过全骨髓贴壁培养法，体外分离、纯化、扩增SD大鼠骨髓间充质干细胞，倒置相差显微镜观察形态学特点，流式细胞仪检测细胞表面标记，体外诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞、成软骨细胞分化并鉴定。取第3代2，4，6，8，12周龄和10，12月龄大鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导1，2，3周，采用酶联免疫法检测骨钙素含量。
结果与结论：体外培养的骨髓间充质干细胞为贴壁生长，长梭形成纤维细胞样细胞，可增殖形成克隆；流式细胞仪分析骨髓间充质干细胞CD29、CD90表达阳性，CD45表达阴性，CD44部分表达；经成骨分化诱导，细胞碱性磷酸酶染色阳性，茜素红染色阳性；经成软骨分化诱导，阿利辛蓝染色阳性，可见通过全骨髓贴壁法可成功地从大鼠骨髓中分离出骨髓间充质干细胞。通过不同鼠龄骨髓间充质干细胞诱导成骨分化后骨钙素含量测定得出骨髓间充质干细胞增殖分化能力随鼠龄的增长而下降。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 鼠龄, 骨髓间充质干细胞, SD大鼠, 鉴定, 诱导, 分化

Abstract:

BACKGROUND: Bone marrow mesenchymal stem cells are ideal as tissue engineering seed cells, but the proliferation and differentiation of mesenchymal stem cells in vitro is very different at different ages. Moreover, there are few reports on the association between age and the number of bone marrow mesenchymal stem cells.
OBJECTIVE: To observe the difference in differentiation ability of bone marrow mesenchymal stem cells from rats at different ages.
METHODS: We isolated, purified and amplified the mesenchymal stem cells from rat bone marrow in vitro by the whole bone marrow adherent culture; observed the morphological characteristics of mesenchymal stem cells under an inverted phase contrast microscope; detected cell surface markers by flow cytometer. Then, mesenchymal stem cells were induced in vitro into osteoblasts and chondroblasts and verified. Passage 3 cells from rats at ages of 2, 4, 6, 8, 12 weeks and 10, 12 months were subjected to osteogenic induction at weeks 1, 2, 3. ELISA was used to determine osteocalcin content.
RESULTS AND CONCLUSION: Bone marrow mesenchymal stem cells cultured in vitro were adherent and exhibited a fibroblast-like spindle shape. In vitro, cells proliferated quickly to form colonies. Flow cytometry showed that the cells were positive for CD29, CD90, but negative for CD45, and partially expressed CD44. After osteogenic induction, cells were positive for alkaline phosphatase staining and alizarin red staining; after chondrogenic induction, cells were positive for alcian blue staining. Mesenchymal stem cells could be isolated and cultured by the method of bone marrow adherent culture in vitro. However, bone marrow mesenchymal stem cells from rats at different ages exhibit decreased proliferation and differentiation abilities with the increase of age through determination of osteocalcin content.

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Key words: bone marrow, mesenchymal stem cells, rats, Sprague-Dawley, osteocalcin

中图分类号:

R394.2

崔新涛，陶树清. 骨髓间充质干细胞增殖分化能力可随鼠龄增长而下降[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(32): 5108-5113.

Cui Xin-tao, Tao Shu-qing. Bone marrow mesenchymal stem cells from Sprague-Dawley rats: aging inhibits cell proliferation and differentiation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(32): 5108-5113.

图/表（结果） 2

2.1 骨髓间充质干细胞的形态学观察

2.1.1 原代培养原代培养细胞刚接种时，培养瓶中有大量悬浮细胞，未贴壁的细胞逐渐坏死破碎，在换液过程中逐步被清除。原代培养12 h后细胞开始贴壁。24 h后部分细胞开始贴壁伸展变形，刚贴壁的细胞单个排列，呈圆形或多角形，胞体透亮折光性强(图1A)。72 h后呈纺锤形或梭形，附壁铺伸细胞数量增多，呈多个散在分布的细胞集落(图1B)。6 d后见贴壁生长的细胞数量明显增多，细胞形态出现较大变化，可见成纤维样细胞散布于培养瓶底，并有多个集落形成，细胞围绕中心呈漩涡状排列(图1C)。9 d后集落逐渐增多，此后逐渐增大，并融合为单层(图1D)。当培养至12 d时，细胞已大部分融合，长满瓶底，细胞呈长梭形(成纤维样外观)，有些呈交叉重叠生长(图1E)。

2.1.2 传代培养原代细胞培养12-14 d后，消化传代，传代细胞贴壁较快，刚传代的细胞悬浮于培养液中，圆形，核透亮，“满天星”样分布(图2A)。2 h后细胞开始贴壁，细胞形态由圆形向梭形转化。4 h后可见明显的贴壁细胞散在分布。24 h见贴壁细胞呈单层生长，伸展为短梭形、长梭形。原代培养局部区域存在少许小而圆的细胞，传代后消失(图2B)。3-5 d细胞长满培养瓶底，形态为成纤维细胞样，排列整齐有序(图2C)。第3代以后，细胞形态趋于一致。传代细胞可连续传7-10代，细胞形状基本相同。但随着传代次数增多，细胞逐渐老化，表现为：细胞增殖速度明显减慢，胞浆中出现空泡及颗粒样物质，细胞碎片增多，细胞形态变为扁平，失去贴壁能力，从培养瓶底脱落。

2.2 骨髓间充质干细胞的表面抗原鉴定骨髓间充质干细胞的表面抗原鉴定结果CD29、CD90表达阳性，CD44部分表达，CD45表达阴性(图3)。

2.3 诱导分化能力

2.3.1 成骨诱导分化诱导约7 d时细胞呈多角形，胞质内细胞颗粒增多；10 d时胞质内充满颗粒，细胞呈集落样生长，细胞间可见钙质沉积；15 d时细胞结节中心的细胞逐渐融合失去细胞结构，钙结节形成明显，19 d时经茜素红染色呈红色结节(图4A)。

2.3.2 成软骨诱导分化诱导过程中，细胞团直径会有所增大，表面会变得光滑并呈胶质状。诱导19 d时经阿利辛蓝染色呈淡蓝色(图4B)。

2.3.3 碱性磷酸酶染色诱导1，3，7，10 d后染色呈阴性，第16天后染色呈阳性(图4C，D)。

2.4 骨钙素定量检测从表1中可以看出不同鼠龄骨髓间充质干细胞的骨钙素水平之间存在差异，2周龄，4周龄组的骨钙素水平明显高于其他组。2，4周龄组与12周龄组之间比较差异无显著性意义(P > 0.05)，2，4周龄组与10月龄组之间比较差异有显著性意义(P < 0.05)，2，4周龄组与12月龄组之间比较差异非常显著性意义(P < 0.01)。

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引言

早在1867年，德国病理学家Cohnheim在研究伤口愈合过程时，首先提出骨髓中有骨髓基质细胞存在的观点。他向动物静脉内注射一种不溶性染料analine，然后在肢体远端造成损伤。结果可见伤口愈合部位有含染料的细胞，这些细胞包括炎症细胞和纤维母细胞，后者与细纤维的合成有关。Cohnheim认为这些细胞来自血液，亦即来自骨髓。骨髓间充干细胞最初是由Friedenstein等^[1]发现的一类易于贴附于塑料培养板表面的成纤维细胞样细胞，具有很强的自我更新和多向分化潜能。在一定诱导条件下，可以向成骨细胞、成软骨细胞、成肌细胞、肌腱细胞、脂肪细胞以及基质细胞等中胚层细胞分化，同时，还可以向外胚层的神经元细胞和内胚层的肝卵圆性细胞分化^[2]。该细胞来源广泛、体外分离培养较容易、免疫排斥反应弱，外源基因易于导入和表达，而成为基因治疗潜在的靶细胞^[3]。

1987年，Owen等研究证实贴壁的各个细胞集落，称为成纤维细胞样集落形成单位(CFU-F)，进而推测不同的集落形成单位为分化程度不同的细胞集落，以成骨分化的标志物——碱性磷酸磷酸酶水平为标准，他认为多数(75%)的集落形成单位正处于分化早期的干细胞阶段。1988年，Mamiatopoulos等首次报道鼠骨髓基质细胞在体外培养能形成钙化的骨样组织，经X射线衍射分析确定形成的钙化物具有羟基磷灰石结构，证明体外培养骨髓基质具有成骨能力。1989年，Benakyahu等将骨髓基质细胞体外培养获得具有典型的成骨细胞特性的细胞：①具有较高的碱性磷酸磷酸酶活性。②只产生Ⅰ型胶原。③在条件培养液中可以产生矿化的细胞外基质。1991年，Caplan总结多年的研究成果及其他研究组的结论，提出如同骨髓中存在造血干细胞以维持整个造血系统的新陈代谢一样，肌肉骨骼系统中也必然存在间充质干细胞以维持其代谢及创伤修复。1994年，Bruder等提出利用自体骨髓间充质干细胞修复肌肉骨骼系统的组织缺损。目前这一设想正越来越多地受到人们的关注与重视^[4-8]。

基于上述研究，本实验对不同鼠龄SD大鼠骨髓间充质干细胞进行培养及鉴定，对比研究其分化活性，为将骨髓间充质干细胞用作组织工程种子细胞提供良好的理论和实验基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：细胞学体外对比观察实验。

时间及地点：实验于2010年6月至2011年7月在哈尔滨医科大学附属第二医院实验室完成。

材料：

实验动物与分组：选取2，4，6，8，12周龄和10，12月龄纯系SD大鼠各15只。实验动物由哈尔滨医科大学实验动物中心提供，实验过程中对动物处理均符合动物伦理学标准。

主要仪器：SW-CJ-2FD洁净工作台(苏净安泰)，研究级倒置显微镜(Olympus公司)，冷冻离心机(Eppendorf公司)，二氧化碳孵箱(Nuaire公司)，冷冻离心机(Eppendorf公司)。

主要试剂：DMEM低糖、DMEM高糖培养基、胎牛血清(Hyclone公司)，Hanks液、胰酶细胞消化液(Beyotime公司)，带滤膜25 cm²培养瓶(Greiner公司)，成骨诱导分化完全培养基、成软骨诱导分化完全培养基(Cyagen公司)。

实验方法：

骨髓间充质干细胞的体外分离：颈椎脱臼法处死SD大鼠，无菌条件下切开皮肤、皮下，分离股骨，置于体积分数为75%乙醇中浸泡约1 min，Hank’s液洗涤，除去软组织，咬骨钳咬去股骨近远端骨骺，用大号针头在骨端的生长面开一个小孔，换干净针头，用注射器吸10 mL DMEM-LG培养基，插入小孔冲出骨髓于离心管中，吹打成骨髓细胞悬液。将骨髓细胞悬液离心(1 500 r/min离心5 min)，弃上清及脂肪层。加入5 mL含体积分数为10%胎牛血清的DMEM-LG培养液，混匀。按照1∶1的比例将上述细胞悬液缓慢滴加到密度为1.073 g/mL的Percoll分离液中，1 500 r/min离心30 min。离心后管内容物分为3层：上层为血小板，中间为Percoll分离液，底层为红细胞和多核白细胞。在上、中层液体界面处可见到乳白色云雾状的单个核细胞层。

骨髓间充质干细胞的体外培养：

原代培养：将分离后收获的有核细胞加入DMEM培养液5 mL(含体积分数为15%胎牛血清)，制成单细胞悬液，以3×10⁵/cm²接种于25 cm²培养瓶内，置于37 ℃，体积分数为5%CO₂，饱和湿度条件下的培养箱中培养，3 d后首次半量换液，将未贴壁的细胞全部弃掉，以后每3-5 d全量换液1次。

传代培养：待原代培养细胞生长铺满至瓶底约80%融合时，用0.25%胰蛋白酶消化液消化贴壁细胞1 min，见细胞回缩，形态变圆，间隙增大时，立即倒掉消化液终止消化。加入DMEM培养液5 mL(含体积分数为15%胎牛血清)，吹打制成细胞悬液，按1∶2传代培养(即1瓶细胞消化后分装2瓶继续培养)，第1次传代后的细胞称为P1代细胞。以后传代的细胞依次称为P2、P3……代细胞。

细胞形态观察：每天在倒置显微镜下观察原代和传代骨髓间充质干细胞的生长情况及形态特征，并适时拍照。

流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞的表面标志：取P3代骨髓间充质干细胞用胰酶消化，PBS重新悬浮后，调整细胞浓度为1×10⁶/cm²，取100 μL细胞悬液与CD34 APC、CD44FITC、CD45PE-Cy5、CD29FITC、CD90PE单抗室温避光孵育20 min后，用流式细胞仪检测。

骨髓间充质干细胞的诱导分化：细胞于P10代进行分化诱导。待细胞达到80%-90%融合时，消化。一部分细胞用于软骨分化，另一部分细胞接种至6孔板。将细胞接种于6孔板中，加入2 mL/孔的鼠骨髓间充质干细胞完全培养基，放入37 ℃，体积分数为5% CO₂孵箱中培养。待细胞贴壁生长至适宜密度时再进行成骨成软骨诱导。

成骨诱导：待细胞达到70%-80%融合时，吸去旧培养液，加入2 mL/孔的成骨诱导分化完全培养基(L-DMEM培养液、体积分数为10%胎牛血清、0.1 μmol/L地塞米松、10 mmol/L β-磷酸甘油和50 μmol/L抗坏血酸磷酸钠)。每 3 d换液，直至可观察到明显钙结节。第1次换液后细胞活力下降，细胞状态变差，继续换液。第4次换液后细胞出现了较少的钙结节，细胞较为扁平。第5次换液后细胞钙结节变多，对其进行染色。19 d后，镜下观察分化情况已较为稳定，进行茜素红染色。

茜素红染色：小心轻缓倒去培养夜，加入PBS轻缓漂洗。加体积分数为10%中性甲醛固定30 min。加入约1 mL茜素红覆盖孔底，染色5 min左右。吸去染液，加入PBS轻缓漂洗。显微镜下观察，拍照。

成软骨诱导：细胞消化离心后，去上清液，按7.5×10⁸ L^-1的量加入软骨诱导基础液(含有转化生长因子β的无血清培养基)重悬细胞，然后1 500 r/min离心5 min。去上清，按5.0×10⁸ L^{-1的量加入软骨诱导分化完全培养液(含体积分数为10%的胎牛血清、L-DMEM培养液、0.1 μmol/L地塞米松、110 μg/L转化生长因子β、50 μmol/L抗坏血酸磷酸钠)重悬细胞。吸取500 μL细胞悬液(既2.5×10⁵个细胞)转入15 mL离心管中，1 500 r/min离心5 min。离心后不可摇动或吹打细胞团，小心地将离心管盖拧松，以便于气体交换。放入37 ℃，体积分数为5%CO₂中孵育(注意：24 h内不要摇动细胞团)。每两三天换新鲜的软骨诱导分化完全培养液，每管0.5 mL，换液后轻弹细胞团使其能脱壁漂浮。拧松管盖，放入37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱中继续诱导。诱导过程中，细胞团直径会有所增大，表面会变得光滑并呈胶质状；诱导19 d后，细胞团直径已增至约2 mm，送做石蜡切片。}

阿利辛蓝染色：按如下步骤脱蜡：二甲苯Ⅰ 10 min → 二甲苯Ⅱ 5 min →体积分数为100%乙醇Ⅰ 5 min→体积分数为100%乙醇Ⅱ 5 min→体积分数为95%乙醇Ⅰ 5 min →体积分数为95%乙醇Ⅱ 5 min→体积分数为85%乙醇 3 min→体积分数为75%乙醇 2 min→蒸馏水冲洗1 min。滴加1%阿利辛蓝染色液染色30 min。染色后用自来水轻轻冲洗2 min，然后用蒸馏水稍稍冲洗，晾干后在显微镜下观察染色情况。镜下可见细胞间有淡蓝色着色。

碱性磷酸酶染色：将细胞接种至6孔板，细胞贴壁约70%汇合后，加入间质干细胞成骨诱导液(包括地塞米松、β-磷酸甘油和抗坏血酸)，分别于诱导1，3，7，10，16 d进行染色。用适当的洗涤液(1×PBS)洗涤3-5次，每次 3-5 min。用中性甲醇固定30 min，固定后用洗涤液洗涤3-5次。配制碱性磷酸酶染色工作液。洗涤最后一次后，去除洗涤液，加入适量染色液，确保能充分覆盖样品。室温避光5-30 min或更长时间(24 h)，直至显色至预期深度。去除染色工作，用蒸馏水洗涤一两次终止显色反应。显色反应终止后，拍照。

放免骨钙素定量检测：取第3代骨髓间充质干细胞以1×10⁶ L^-¹细胞浓度接种于6孔培养板，加入成骨诱导培养基，每两三天根据培养基颜色换液。分别于培养1，2，3周，取1×10⁶L^-¹细胞1 mL按大鼠骨钙素Elisa试剂盒操作步骤用免疫法定量检测骨钙素含量。

统计学分析：将原始数据录入Excel表后建立数据库，应用 SPSS 18.0医用统计软件包进行数据统计学处理。采用 ANOVA 方差分析并进行方差齐性检验；结果以x(_)±s表示，并计算P 值，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

3.1 骨髓间充质干细胞诱导成骨及成软骨细胞分化的研究情况

3.1.1 向成骨细胞方向骨髓间充质干细胞在体外较容易获得大量扩增并可向成骨分化，是目前骨组织工程最常用的种子细胞^[8]。但迄今为止骨髓间充质干细胞向成骨细胞的诱导尚未形成统一和标准的方法。许多研究表明，地塞米松、甘油磷酸钠和维生素C是向成骨细胞分化和体外成骨的必要条件，低浓度地塞米松对骨髓间充质干细胞成骨分化有促进作用^[9]。而β-甘油磷酸钠能为骨髓间充质干细胞提供磷酸盐，维生素C可刺激Ⅰ型胶原的合成^[10]。糖皮质激素对成骨分化既有促进，又有抑制作用，它依赖于使用的剂量、作用的时间、细胞所处的阶段和细胞的种类，它对成骨细胞的作用到目前为止尚不十分清楚^[11]。Jäger等^[9]的研究证实地塞米松/抗坏血酸/磷酸甘油和骨形成蛋白2在细胞的增生和分化过程中起着重要作用。最近还有其他诱导因子的报道，Xu等^[12]报道细胞外高迁移率蛋白1触发了间充质干细胞向成骨细胞方向分化。

3.1.2 向成软骨细胞方向常规方法为在含有转化生长因子β的无血清培养液中，采用离心沉淀式培养法可以诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化。Mackay等^[13]准备聚己内酯和聚丙交酯乙交酯混合薄片，在该支架材料中培养的人骨髓间充质干细胞被发现有成软骨潜能。Pelaez等^[14]证实无限制循环压缩可以促进琼脂糖基质中人骨髓间充质干细胞向成软骨细胞方向分化。

3.2 骨髓间充质干细胞分化能力的研究情况骨髓间充质干细胞是最好的组织工程种子细胞来源，但是不同年龄的骨髓间充质干细胞体外的增殖、分化特点有很大差异，有关年龄与骨髓间充质干细数量的关系目前尚缺少系统研究。

3.3 不同鼠龄骨髓间充质干细胞诱导分化能力的差别骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能已经被体内外实验所验证。骨髓间充质干细胞在体外不同分化条件的诱导下，可以形成成骨细胞、软骨细胞或脂肪细胞，并且克隆以后的细胞具有类似的分化特性，充分证明骨髓间充质干细胞是多潜能干细胞。血清骨钙素亦称为骨γ-羧基谷氨酸蛋白，是由成熟成骨细胞、成牙本质细胞和肥大的软骨细胞特异合成和分泌的，占骨基质非胶原蛋白的15%-20%，是成骨细胞分化的晚期标志物。研究认为骨钙素在骨矿化过程中起作用，但目前研究表明，骨钙素可能通过负反馈的机制在骨重建的过程中发生作用。不同月龄段骨髓间充质干细胞的骨钙素浓度之间存在的差异，2周龄组骨髓间充质干细胞骨钙素浓度较其他鼠龄组高，差异有显著性意义。提示不同鼠龄大鼠骨髓间充质干细胞诱导分化能力存在差别。即鼠龄越小，其骨髓间充质干细胞活性越高。

3.4 骨髓间充质干细胞诱导分化相关问题

3.4.1 高细胞密度培养对骨髓间充质干细胞分化的影响选用骨髓间充质干细胞作为种子细胞时，通常先将其诱导成软骨细胞的表现型。目前认为，离心处理使之聚集成团是骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的必要条件，因为细胞团块便于自分泌与旁分泌作用，更符合软骨生长的要求^[15]。Johnston等率先在体外诱导成年哺乳类骨髓间充质干细胞分化生成软骨获得成功。有研究表明在含有转化生长因子β的无血清培养基中采用离心沉淀式培养法可以刺激骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化^[16]。近几年来，不同种属来源的骨髓间充质干细胞接种于多种支架材料，在体外构建组织工程软骨获得成功。将人骨髓间充质干细胞接种于明胶海绵，在含有转化生长因子β3(10 mg/L)的化学限定培养基中培养21 d生成了软骨组织，观察表明细胞的接种密度影响细胞产生细胞外基质(硫酸糖胺多糖及Ⅱ型胶原)的能力，以12×10⁹ L^-1的浓度最为有效^[9]。

3.4.2 生长因子对骨髓间充质干细胞分化的影响研究发现软骨内含有许多细胞因子及其受体，并且表明这些细胞因子通过自分泌和旁分泌这两种基本方式来调节软骨的生成。生长因子对细胞的作用不是单一的过程，是一种网络式的调节，生长因子对细胞作用的量效关系、时效关系、细胞因子之间的相互作用及反馈调节尚需进一步研究。合理有效的利用细胞生长因子能在体外促进骨髓间充质干细胞的增殖、分化，表达软骨细胞表型，在软骨组织工程中有着不可替代的作用。

结论：①实验通过全骨髓贴壁法成功的从鼠骨髓中分离出骨髓间充质干细胞，在体外进行了骨髓间充质干细胞的培养、扩增和传代。并且通过形态学观察，流式细胞仪鉴定，成骨诱导分化、成软骨诱导分化及相关监测指标证实所分离培养细胞为骨髓间充质干细胞。②通过不同鼠龄骨髓间充质干细胞诱导成骨分化后骨钙素含量测定得出骨髓间充质干细胞增殖分化能力随鼠龄的增长而下降。