不同脱细胞方式下所得胞外基质存在的差异

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.30.017

摘要/Abstract

摘要：

背景：比起单一或复合的生物活性分子材料，脱细胞胞外基质更接近天然生物体内的细胞外环境，在组织工程中得到越来越多的重视和应用，但脱细胞方法会影响所得胞外基质的结构和成分，目前缺少脱细胞方法对胞外基质影响的研究。
目的：分析不同脱细胞方法所得胞外基质的成分和作为修饰表面对细胞生物学效应的影响。
方法：取生长良好的第3代SD乳鼠成骨细胞，分别采用冻融法、胰酶法、去污剂法、弱碱法脱去细胞留下基质，形成4组胞外基质，通过酶联免疫吸附实验分析胞外基质的生物成分。分别在4组胞外基质表面接种成骨细胞，以常规培养的细胞为对照，进行MTT比色实验、碱性磷酸酶活性检测，对比5组成骨细胞的生物活动。
结果与结论：冻融法组胶原成分与胞体残留成分较多，去污剂法组和弱碱法组次之，胰酶法组最少。冻融法组接种第3，5，7天的细胞A值高于对照组(P < 0.05)，去污剂法组接种第3，5，7天的细胞A值低于对照组(P < 0.05)。胰酶法组接种第5，7天的细胞碱性磷酸酶活性低于对照组(P < 0.05)；弱碱法组接种第7天的细胞碱性磷酸酶活性低于对照组(P< 0.05)；去污剂法组接种第3，5，7天的细胞碱性磷酸酶活性低于对照组(P < 0.05)。表明4种方法中，冻融法脱细胞能够获得更多的胞外基质，所构建基质涂层更有利于细胞的增殖。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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关键词: 生物材料, 骨生物材料, 成骨细胞, 细胞外基质, 脱细胞方法, 胰酶法, 冻融法

Abstract:

BACKGROUND: Compared with single or composite biomolecular materials, decellulazied matrices are more biomimetic to natural ectocytic surroundings. So cell-secreted extracellular matrix is paid more and more attention in the field of tissue engineering, and the composition of these matrices are influenced by decellulezired preparation methods more or less. But there are few studies about the biological effect of different decellulazried methods on the extracellular matrix.
OBJECTIVE: To investigate the composition of cell-secreted extracellular matrices in vitro by different decellularizing methods and their effects as surface modification on cytobiological reaction.
METHODS: After the treatment of different decellularizing methods (freeze/thaw cycles, trypsin, weak alkal, detergents), the extracellular matrix was obtained and grouped into four kinds. The biological composition of the extracellular matrix was determined by ELISA assay. Then osteoblasts were seeded onto the four kinds of extracellular matrix surfaces. Cells cultured normally served as controls. The effect of extracellular matrix coatings on cell growth and differentiation were determined by MTT test and alkaline phosphatase activity test.
RESULTS AND CONCLUSION: The residual components were the most in the freeze-thaw group, followed by the detergent and weak alkal groups, and the least in the trypsin group. Compared with the control group, the absorbance value of cells were lower in the freeze-thaw and detergent groups at days 3, 5, 7 after inoculation (both P < 0.05); the alkaline phosphatase activity was lower in the trypsin group at days 5, 7 after inoculation (P < 0.05), in the weak alkal group at 7 days after inoculation (P < 0.05), and in the detergent group at days 3, 5, 7 after inoculation (P < 0.05). Therefore, we can harvest more extracellular matrices by the freeze-thaw method, and the extracellular matrix coating synthesized by the freeze-thaw method is more helpful for cell growth than others.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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Key words: osteoblasts, extracellular matrix

中图分类号:

R318

范利梅，夏荣，窦晓晨. 不同脱细胞方式下所得胞外基质存在的差异[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(30): 4863-4867.

Fan Li-mei, Xia Rong, Dou Xiao-chen . Effect of different decellularizing methods on cell-secreted extracellular matrix in vitro[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(30): 4863-4867.

图/表（结果） 3

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引言

胞外基质作为细胞自身分泌代谢的产物，含有多种生物活性分子，对细胞的生物学行为起到重要的调节作用。各种胞外基质分子(如胶原、纤连蛋白、生长因子等)的生物材料研究都已获得了较为肯定的结果^[1-11]。但是从仿生的角度，完整的胞外基质更接近天然生物体内的细胞外环境和成分，更能够参与促进组织愈合，同时具有低抗原性和可降解性，成为生物材料领域的又一热点。一方面保有组织形态的胞外基质，如脱细胞处理的真皮、血管、膀胱等作为相应组织的替代物相继开发成功，它们无论在动物实验及临床应用上都显示出了良好的应用前景^[12-21]。另一方面通过脱细胞得到的无定形胞外基质，既可以作为植入体表面改性材料，也可以作为不规则缺损的植入材料，也成为了生物材料学界备受关注的新型材料^[22-29]。

脱细胞胞外基质是通过脱出组织细胞的方法得到完整的胞外基质，最大程度保留了其生物活性，去除组织的移植免疫原性。常用到的脱细胞方法有机械法、酶消化法、化学去垢剂法等，这些方法或多或少会影响胞外基质的生物性能，但是目前对脱细胞方法的研究多集中在组织器官的脱细胞处理及其形态学和生物力学分析^[30-40]，缺少探讨这些脱细胞方法对所得无定形胞外基质生物学效应的直接影响。实验采用不同方法脱细胞，分析所得胞外基质的成分，并将所得的胞外基质作为生物反应表面接种细胞，观察其上细胞的生物行为，从而评估各种构建方式，为进一步筛选高效、安全的脱细胞方法提供依据。

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材料方法

设计：细胞-材料学体外对照观察实验。

时间及地点：于2013年7至12月在安徽医科大学口腔医学院中央与地方共建口腔医学中心实验室完成。

材料：SPF级SD乳鼠由安徽省实验动物中心提供。

实验方法：

成骨细胞的培养：采用改良组织块法培养成骨细胞^[41-45]，取2只新生1-3 d SD乳鼠断颈处死，放入体积分数75%乙醇中浸泡消毒5 min，无菌操作取下颅盖骨组织，除去附着的血管及结缔组织，用Hank液清洗3次，剪成 1 mm³大小的碎块。用0.25%胰蛋白酶在37 ℃条件下消化20 min；中止消化后用弯吸管吸取碎骨片，均匀接种于25 mL的培养瓶中，翻转培养瓶在体积分数5% CO₂的培养箱中孵育二三小时，转正培养瓶并加入含有体积分数20%小牛血清的高糖DMEM培养液后继续培养，3 d后换液，7-10 d后待细胞融合成单层后再传代培养。取第3代细胞用DMEM培养液将成骨细胞浓度调整为1×10⁸L^-¹，取1 mL/孔接种与多个24孔板中，培养三四天直至细胞长满表面，待用。

胞外基质表面的分组构建：①冻融法组：取3板上述成骨细胞，吸出长满成骨细胞培养板中的培养液，0.01 mol/L PBS漂洗3次后，反复快速冻融3次，PBS漂洗3次，备用。②胰酶组：取3板上述成骨细胞，吸出长满成骨细胞培养板中的培养液，0.01 mol/L PBS漂洗3次后，每孔加入300 μL胰酶20 min，加入培养基中和，吸出培养基，PBS漂洗3次，备用。③去污剂法组：取3板上述成骨细胞，吸出长满成骨细胞培养板中的培养液，0.01 mol/L PBS漂洗3次后，每孔加入500 μL 0.1% TritonX-100，4 ℃过夜，PBS漂洗3次，备用。④弱碱法组：取3板上述成骨细胞，吸出长满成骨细胞培养板中的培养液，0.01 mol/L PBS漂洗3次后，每孔加入500 μL 20 mmol/L氨水，4 ℃过夜，PBS漂洗3次，备用。

ELISA检测胞外基质成分：4组胞外基质各取3孔，吸出培养液，PBS漂洗3次，每孔加入1∶500Ⅰ型胶原(collagen typeⅠ)一抗500 μL，4 ℃过夜。弃孔内溶液，PBS漂洗3次，每孔加入1∶500二抗在37 ℃孵育1 h。弃孔内溶液，PBS漂洗3次，加入新鲜配制TAB 500 μL，室温下显色10 min，弃孔内溶液，蒸馏水漂洗3次，酶标仪 450 nm波长测定吸光度值。

细胞接种：取生长良好的第3代成骨细胞，用DMEM培养液将细胞浓度调整为5×10⁷ L^-¹，以500 μL/孔接种于各组胞外基质和空白24孔板(对照组)。

主要观察指标：

碱性磷酸酶活性检测：接种后第1，3，5，7天，从各组3孔中吸取培养液30 μL，置入另一块96孔板中，用碱性磷酸酶检测试剂盒进行测定吸光度值。

MTT检测：在接种后第1，3，5，7天，从每组各取3孔，PBS漂洗3次，每孔加入500 μL培养液和50 μL MTT底物，继续培养4 h，吸除培养液，每孔加入500 μL溶解液，继续培养20 min，振荡3 min，每孔取出150 μL加入96孔板，用酶标仪以490 nm波长测吸光度值。

统计学分析：采用SPSS 20.0进行统计分析，多组比较采用方差分析，两组比较采用t 检验。

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讨论

胞外基质是由生物自组装的水凝胶体系，混合有多种生物分子，它作为细胞分泌代谢的产物，同时也对细胞生物学行为起到重要的调节作用，细胞与细胞外基质相互作用，相互依存，相互影响，有利于保持细胞特定的形态、代谢、增殖、分化、迁移及信息传递。基于此，许多学者都会选用胞外基质中的各种生物分子进行修复缺损和材料改良等研究。然而比起单一或复合的生物活性分子材料，理论上完整的胞外基质更接近天然的生物体内的细胞外环境，最大程度保留了其生物活性，因此在组织工程中得到越来越多的重视和应用。

脱细胞基质的研究出现在20世纪90年代初，是通过脱出组织细胞的方法去除组织的移植免疫原性。其研究多见于脱细胞处理的真皮、血管、膀胱等组织和器官，作为相应组织的替代物和支架材料，显示出了良好的应用前景。而由目标细胞产生的无定形胞外基质，既可以作为植入体表面改性材料，也作为不规则缺损的植入材料，近年来成为生物材料领域的又一热点。人们希望在去除胞外基质免疫原性的同时最大程度保留其生物活性，诱导周围细胞生长和组织愈合。不可忽略的是脱细胞方法或多或少会影响所得胞外基质的结构和成分，然而目前对脱细胞方法的研究多集中在对组织器官的脱细胞处理及其形态学和生物力学分析，缺少研究这些脱细

胞方法对所得胞外基质生物效应的直接影响。因此实验着重以脱细胞方法作为研究方向，采用目前国内外常用的主要脱细胞方法(冻融法、酶消化法、化学去垢剂法、弱碱法)构建无组织形态的胞外基质表面，测定所得胞外基质成分的差异，观察细胞在不同组别表面的生物行为，分析不同脱细胞方法的生物效应，初步探讨脱细胞基质的优化构建，为筛选高效和安全的脱细胞方法提供依据。

肌动蛋白是胞体的重要成分；Ⅰ型胶原是成骨细胞分泌的胞外基质的主要成分之一。实验中ELISA法标识并定量检测脱细胞后的基质化表面所含胞体成分肌动蛋白和Ⅰ型胶原，来分析不同方法的去除细胞胞体和保留基质成分的能力。结果显示，冻融法组所留的胶原成分较多，但胞体残留成分也相应较多；去污剂法组和弱碱法组次之，胰酶法组最少。

MTT比色实验是一种检测细胞存活和生长的方法，以吸光度值反映活细胞的增殖情况。而在评估种植体材料的生物活性时，一个重要指标就是观察材料是否有利于细胞的增殖。实验结果表明各组增长趋势相似，到第3，5，7天，各组表面的细胞增殖出现显著性差异。与对照组比较，冻融法组的细胞增殖较多，在第3，5，7天出现显著性差异，这可能是因为冻融法能获得更多的胞外基质，其中含有较多促进细胞黏附和生长的物质，如胶原、生长因子等。而在第3，5，7天，去污剂法组胞外基质表面的细胞增殖数均低于对照组，这提示TritonX-100脱细胞后可能残留一定程度的细胞毒性，不利于细胞的增殖。

碱性磷酸酶是成骨细胞分化和功能成熟的主要特征酶之一，对碱性磷酸酶活性的检测是鉴定成骨细胞和评价其功能活性的重要指针之一。研究中，在接种后第1，3，5天，各组的碱性磷酸酶活性出现显著性差异，但在第7天这种显著性差异消失，这可能提示随着接种时间的延长，不同脱细胞方法对碱性磷酸酶活性的影响力的差异变得越来越小。与对照组比较时，除冻融法组以外，其余各组的碱性磷酸酶活性在不同时间点都不同程度地低于对照组，不利于成骨活性的维持。

同时在实际制备过程中，每种脱细胞方法都各有特点和局限性，如冻融组的胞外基质表面对水流等外力的抵抗力减弱，易剥脱漂浮，在操作过程中可能会发生胞外基质成分的丢失；而胰酶的脱细胞效果受到时间、温度，甚至细胞数量的影响，效力过强可能会破坏胞外基质的黏附成分，较弱又无法脱去细胞，使用较难掌控；TritonX-100和氨水处理后虽较易获得稳定的基质表面，但可能残留细胞毒性作用。

上述结果证实物理冻融法能够更好地保留胞外基质成分和活性，构建方法对胞外基质这类生物材料的生物学效应产生不可忽视的影响。要获得比较理想的脱细胞效果，并能最大程度地保存原有的结构和功能以适合组织工程及临床治疗的需要，需要对不同脱细胞方法进行甄选，有时甚至需要几种脱细胞方法的联合应用。如何根据临床应用的实际需求，在获得胞外基质时合理运用脱细胞方法还有待进一步的探索。

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