实验组、对照组植骨区平均密度分别为(1 043.95±123.09)，(1 387.77±194.96) HU，组间比较差异有显著性意义(P < 0.05)；实验组、对照组植骨区平均面积分别为(16.38±2.91)，(26.48±3.44) mm2，组间比较差异有显著性意义(P < 0.05)，说明实验组牙本质颗粒较对照组吸收快。
2.4   两组植骨区组织形态学观察结果   由于切片甲苯胺蓝染色后放置时间过长，有些褪色，但并不影响结果观察。对硬组织磨片的观察可见，两组植骨区的牙本质颗粒均呈虫蚀样吸收，实验组吸收程度较对照组明显，两组牙本质颗粒周围均可见新生的编织骨，呈网格状，新生骨组织包绕牙本质颗粒并与基骨紧密连接，实验组新生骨多于对照组，对照组牙本质颗粒周围有较多的纤维组织，两组植骨区均未见炎症细胞浸润，见图4。



2.5   两组植骨区组织学测量和统计学分析   术后3个月，实验组和对照组的新骨生成率分别为(41.91±4.66)%和(30.80±5.31)%，组间比较差异有显著性意义(P < 0.05)，说明在相同时间内，部分脱矿牙本质颗粒的新骨生成量多于未脱矿牙本质颗粒。术后3个月，实验组和对照组的牙本质颗粒所占面积比率分别为(12.41±6.76)%和(20.66±2.34)%，组间比较差异有显著性意义(P < 0.05)，说明未脱矿牙本质颗粒吸收较慢，有利于维持空间。
2.6   牙本质颗粒的组织相容性   由动物实验的大体观察与组织学观察结果可知，部分脱矿牙本质颗粒与未脱矿牙本质颗粒均具有良好的组织相容性。

种植义齿修复以其不损伤邻牙、使用方便、舒适性好、稳定性高等优势，逐渐被越来越多的患者所接受。不同患者牙齿缺失的原因不尽相同，很多患者因为牙周病、根尖病、创伤、肿瘤等原因造成颌面部骨组织的不同程度缺损。骨组织工程的3个基本组成部分是：①促进宿主细胞在植入部位附着、迁移和增殖的骨传导支架；②骨诱导蛋白或生长因子，刺激骨祖细胞分化并合成矿化骨基质；③能够合成骨组织的成骨细胞[1]，其中寻找一种理想的支架材料是骨组织工程的主要目标之一。如何有效使用植骨材料修复各类骨缺损，已经成为当前的研究热点。

目前临床应用的骨移植材料都各具优缺点。自体骨因其来源于自身，具有良好的生物相容性及成骨性能，在临床上一直被认为是骨移植材料的“金标准”，但仍存在着增加取骨创伤、供体供应有限、供区感染、移植后不可避免的骨吸收等问题[2-4]。其他植骨材料如同种异体骨、异种骨、人工合成骨，虽然也可以用来修复骨组织缺损，但是在不同方面存在着局限性，例如价格昂贵、存在着免疫排斥反应、自身缺乏骨诱导能力等[5]。

牙本质颗粒因其来源广泛、价格低廉、制备简便，逐渐引起临床医生和学者的重视。牙齿和骨的成分类似，并且都起源于神经嵴[6-7]。研究表明，未脱矿牙本质衍生的无机矿物质作为一种独特的支架材料，可以促进骨髓间充质干细胞的成骨分化能力，不仅无细胞毒性，而且具有良好的生物相容性和骨传导性[8]。但由于未脱矿牙本质颗粒的生长因子包裹在羟基磷灰石晶体里，释放缓慢，所以颗粒吸收慢，新骨形成的速度也慢。目前常用的牙本质改性增效的方法为脱矿处理。经酸性溶液处理后的脱矿牙本质基质，生长因子释放加快，骨传导和骨诱导作用提高。牙本质衍生的脱矿牙本质基质于1967年首次被报道，研究发现脱矿牙本质植入骨缺损后会诱导成骨，而不是诱导牙本质形成[9]。脱矿后，牙本质小管增大，释放胶原纤维和碱性蛋白，这些蛋白可以促进血管生成和骨形成[10]。因此，脱矿牙本质基质具有骨诱导作用[11-12]。REIS-FILHO等[13]报道脱矿牙本质基质对骨祖细胞具有趋化特性，在骨重塑过程中被吸收，并可以通过刺激血管内皮生长因子的表达加速骨修复和血管形成，表明脱矿牙本质基质具有骨诱导、骨传导的潜力。但是完全脱矿牙本质颗粒制作过程复杂，酸性试剂与牙本质颗粒的长时间接触还会损伤其中的非胶原蛋白等物质，从而影响新骨的形成[14]。

KOGA等[15]的研究表明，部分脱矿(脱矿程度约为70%)牙本质颗粒表现出了优越的骨再生能力，相比未脱矿组和完全脱矿组诱导出了更多的新骨。但有关部分脱矿牙本质颗粒成骨效果的动物实验研究较少，此次实验通过建立犬的上颌窦提升骨缺损修复的动物模型，旨在比较部分脱矿牙本质颗粒与未脱矿牙本质颗粒的成骨效果，为其临床应用提供参考依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

1.1   设计   随机对照动物实验，组间比较采用t检验。
1.2   时间及地点   实验于2018年6月至2019年11月在大连医科大学完成。
1.3   材料   收集临床上患者因正畸减数、牙周病而拔除的患牙以及无功能的智齿(由大连医科大学口腔医学院附属口腔医院提供)，供者对实验知情同意。
1.3.1   实验动物   健康雄性比格犬5只，体质量约8 kg，由大连医科大学实验动物中心提供并喂养，许可证号：SCXK(辽)2018-0007。动物实验获得大连医科大学实验动物中心伦理委员会批准，伦理审批号码(AEE18085)。
1.3.2   仪器及试剂   常规无菌手术器械及用品：手术刀柄、刀片、止血钳、一次性注射器、组织镊、骨膜剥离器、单面骨凿等，由大连医科大学口腔医学院提供并进行消毒；EXAKT300CP切片机(德国EXAKT公司)；OLYMPUS SZX16体式显微镜、OLYMPUS BX43光学显微镜 (日本OLYMPUS公司)；陆眠宁(长春农牧兽医研究所)；鹿醒宁、利多卡因(长春农牧兽医研究所)；硝酸(佛山市南海双氯化工有限公司)；甲苯胺蓝染色剂(上海碧云天生物技术有限公司)。
1.4   实验方法   

1.4.1   牙本质颗粒的制备  

未脱矿牙本质颗粒：收集牙齿，用打磨机去除牙釉质、牙骨质、牙髓，保留牙本质。将牙本质用骨磨敲碎，经筛子过滤为直径0.5-1.0 mm的颗粒，经过蒸馏水煮沸2 h，体积分数75%乙醇消毒、生理盐水反复荡洗，备用。

部分脱矿牙本质颗粒：煮沸后，将直径0.5-1.0 mm的牙本质颗粒浸泡在硝酸中10 min，体积分数75%乙醇消毒、生理盐水反复荡洗，备用。
1.4.2   实验动物分组   将5只比格犬的10个上颌窦抽签法随机分为2组，制备上颌窦开窗提升骨缺损模型，实验组植入部分脱矿异种牙本质颗粒，对照组植入未脱矿异种牙本质颗粒，每组5个上颌窦。
1.4.3   上颌窦开窗提升骨缺损模型   用陆眠宁0.07-0.1 mL/kg肌肉注射麻醉实验犬后，以仰卧位将其固定于手术台上，消毒铺巾。在上颌第一磨牙颊腭侧，用2%利多卡因按0.2 mL/kg进行浸润麻醉，沿着腭侧龈缘切开，翻开全厚黏骨膜瓣，充分暴露术区骨面，用小球钻打磨的方法在腭侧骨板制备直径8-10  mm的骨窗，在距离窦底约1 mm 时，用单面骨凿敲击去除窦底骨片，剥离提升窦底黏膜，提升高度4 mm左右，以同样的方法完成对侧上颌窦底提升。每个骨缺损植入牙本质颗粒约0.5 cm3，实验组植入部分脱矿牙本质颗粒，对照组植入未脱矿牙本质颗粒，见图1。牙龈骨膜瓣复位，严密缝合创口。手术结束后，肌肉注射鹿醒宁促进实验犬苏醒，0.08 mL/kg青霉素预防感染1周，每日以生理盐水冲洗伤口，术后7 d拆线。

1.5   主要观察指标   

大体观察：术后密切观察植骨区愈合情况，有无红肿、溢脓等感染、排斥症状。术后3个月，麻醉后处死实验犬，暴露植骨区，观察骨缺损修复状态和牙本质颗粒的吸收情况，探诊检查牙本质颗粒的质地、动度，有无纤维包裹等。

锥形束CT检测：观察植骨区的密度和牙本质颗粒体积变化情况。使用锥形束CT中的ROI及AREA功能进行测量。每个标本选取3个截面，对植骨区的密度和面积进行测量，取平均值。

组织学观察：切取植骨区的组织标本，分别进行标号，每个标本体积为2 cm×1.5 cm×1.5 cm，放入体积分数10%中性甲醛溶液中固定，树脂包埋后制作硬组织磨片，切片厚度控制在70 μm，甲苯胺蓝染色，光学显微镜下观察新骨生成量和牙本质颗粒的变化情况。在每块标本的不同部位选取5张切片，每张切片随机选取5个视野进行拍照，使用Image J软件分析图片，计算新骨生成率及牙本质颗粒面积比率。

新骨生成率=视野中新生骨的面积/视野的总面积×100%

牙本质颗粒面积比率=剩余牙本质颗粒所占面积/视野总面积×100%
1.6   统计学分析   将所得实验数据利用SPSS 17.0软件进行处理，计量资料用x±s表示，进行t检验，P < 0.05提示差异有显著性意义。该文统计学方法已经大连医科大学生物统计学专家审核。

口腔种植治疗因其舒适美观、适用范围广、不损伤邻牙等优点，被越来越多的患者所接受，已成为牙列缺损和牙列缺失的最佳修复方式。但是临床上由于肿瘤、创伤、长时间缺牙未修复和晚期牙周病等原因，常常导致牙槽骨骨量不足，需要采用骨增量技术恢复缺失的骨量，为种植治疗的成功打下坚实的基础。

临床上常用的骨移植材料有自体骨、同种异体骨、异种骨和人工合成骨等。自体骨无免疫排斥反应，具有骨生成性、骨传导性、骨诱导性，是骨移植材料的“金标准”，但是存在二次损伤的弊端，可能造成供区感染、疼痛、麻木等并发症。同种异体骨存在免疫排斥的风险，而且其骨诱导作用会受到储存和灭菌技术的影响[16]。目前使用广泛的异种骨为无机牛骨，具有骨传导性好、来源广泛和组织反应低等优点，然而牛源性生物材料可能会给患者带来病毒传播的风险[17]，而且其在生物体内降解缓慢[18]。人工骨移植材料多由磷酸三钙和羟基磷灰石合成，其结构和化学性质与生物体内的磷灰石类似，具有良好的生物相容性，但是不具有骨诱导能力[19]。

近年来，牙本质颗粒由于具有良好的生物相容性、生物可吸收性和成本效益等优点，受到越来越多的学者关注。牙体组织由牙釉质、牙本质、牙骨质、牙髓构成，其中牙本质是牙齿的主要组成成分。研究表明牙本质由70%无机物和20%有机物组成，无机物的主要成分为磷灰石晶体，与骨组织相似，是一种类似骨骼的矿化组织[20-21]；有机物中18%是胶原蛋白，主要是Ⅰ型胶原蛋白，其余为非胶原蛋白，含有多种生长因子，包括骨形态发生蛋白、转化生长因子β、碱性成纤维细胞生长因子和血小板衍生生长因子等[22]。骨形态发生蛋白是一种水溶性分子质量相对较低的蛋白质，由于人体内体液流动的原因，把骨形态发生蛋白直接植入体内时其很难在局部保留足够长的时间。牙本质基质可作为支持骨再生的支架，也可以作为重组人骨形态发生蛋白载体，具有骨传导和骨诱导作用[23-24]。相比于其他的人工合成骨移植支架材料，牙本质含有的活性成分较多，可以将未成熟的间叶细胞诱导分化为成骨细胞[25]。研究表明，牙本质的骨诱导作用不仅来源于非胶原蛋白，还来源于牙本质基质蛋白1、牙本质涎磷蛋白、骨钙素、骨桥蛋白、碱性磷酸酶以及一些特殊的转录因子[26]。其中，牙本质基质蛋白1在胚胎发育期间主要在成骨细胞中表达，对骨和牙本质的矿化起着重要作用。在矿化组织中，牙本质基质蛋白1以蛋白水解片段的形式存在，牙本质基质蛋白1的水解过程对牙本质、牙骨质和颌骨的形成和矿化至关重要，并在骨和软骨的发育中发挥关键作用[27]。骨桥蛋白是一种多功能蛋白，通过促进成骨细胞和破骨细胞活性在骨重塑中发挥作用[28]。

KIM等[29]将牙本质颗粒作为引导骨再生的植骨材料应用于临床，术后3-6个月观察发现，牙本质颗粒逐渐吸收并被新生骨所取代，显现出良好的骨再生效果。课题组前期研究也证实了未脱矿自体牙本质颗粒在骨组织缺损修复中的作用和临床效果[30-31]，美中不足的是自体牙齿来源有限，而且未脱矿牙本质颗粒降解缓慢，诱导新骨生成的速度较慢，这种情况并不能满足临床的植骨需求。

相比于自体牙，异体牙的来源广泛，但是其在移植过程中可能会有感染及免疫排斥的风险。研究证实，牙本质中的牙本质细胞突起及脂类可能引起免疫排斥反应。目前常用煮沸、煅烧、冷冻、脱矿等方法处理异体牙本质颗粒[32]。煮沸法是利用高温使酶失去活性，从而避免可能导致的免疫排斥反应，异丙醇可以去除牙本质中的脂类物质而降低其抗原性[33]。赵彬彬等[34]将未脱矿异种牙本质颗粒分别经过煮沸2 h、异丙醇脱脂处理2 h后植入大鼠颅骨表面，结果也证实了牙本质颗粒经煮沸和异丙醇处理后的抗原性较弱，具有良好的生物相容性和骨传导性。此次实验使用经过煮沸法处理的牙本质颗粒，结果未见免疫排斥反应和炎症细胞浸润。

脱矿是牙本质改性的一种方法，其使用酸性溶液对牙本质进行处理，将牙本质中的无机物部分或全部去除，暴露更多的胶原纤维，以提高牙本质基质的成骨活性。有文献表明，牙本质经脱矿处理后第4周就开始进行骨诱导，而未脱矿牙本质在第8周才进行骨诱导，其差异的可能原因是，脱矿牙本质中的骨形态发生蛋白因为无机物的去除释放加快，新骨形成的速度也加快[35]。有文献报道在电镜下观察，脱矿后的牙本质小管会变宽，内部的活性生长因子更容易释放出来，而且基质中的胶原作为支架成网状暴露，更有利于成骨细胞的黏附[36-39]。REDDI[40]研究对比了脱钙骨基质和非脱钙骨基质的骨诱导能力，发现脱钙骨基质具有更强的骨诱导能力。一些基础动物研究表明，脱矿牙本质基质不仅具有生物相容性，而且具有骨诱导性，类似于脱矿骨基质[41-42]。但这些研究大多使用了完全脱矿牙本质基质，材料制备时间较长，在大多数使用完全脱矿牙本质基质的临床研究中，牙本质完全脱矿大约需要12 h，过程复杂，使得牙本质颗粒的制作与种植手术无法同期进行。脱矿程度不同，牙本质颗粒的吸收速率也不同，在相同时间内的新骨生成率也不同。理想的骨移植材料改建过程应该是支架材料的吸收与新骨形成相平衡。MINAMIZATO等[43]自体部分脱矿牙本质基质在牙槽骨再生的应用研究中，将400-800 μm的牙本质颗粒放入pH=1的2%硝酸溶液中脱矿10 min，用于上颌窦外提升植骨，移植前整个加工时间是40 min，显著减少了椅旁操作时间，3个月后用X射线评估骨生成量，术后相对于术前平均骨高度增加了8.7 mm，组织学检查显示自体部分脱矿牙本质基质被新形成的骨包围，提示自体部分脱矿牙本质基质可能具有骨诱导性。KOGA等[15]将牙齿研磨成不同颗粒大小，分别为200，500，1 000 μm；然后用2%的HNO3溶液进行处理，根据脱矿情况分为未脱矿、部分脱矿(脱矿程度约为70%)、完全脱矿的牙本质颗粒组，分别植入大鼠颅骨缺损中，在1，2个月时观察发现，颗粒大小1 000 μm部分脱矿(脱矿程度约为70%)牙本质颗粒表现出了优越的骨再生能力，诱导出了更多的新骨，而未脱矿组和完全脱矿组都未诱导出更多的新骨。究其原因，可能是因为部分脱矿牙本质颗粒更易于骨细胞的附着，并且部分脱矿牙本质颗粒的吸收与新骨形成之间达到了较好的平衡。此次实验将部分脱矿异种牙本质颗粒(脱矿程度约70%)与未脱矿异种牙本质颗粒分别用于上颌窦提升植骨手术中，不论锥形束CT表现还是组织学观察显示，在相同时间内，部分脱矿牙本质颗粒的成骨效果优于未脱矿牙本质颗粒，显示出部分脱矿牙本质颗粒良好的骨诱导性及成骨效果，这与KOGA等研究结果一致。

此次实验采用比格犬的上颌窦提升植骨作为研究模型，原因是上颌窦血运丰富，而且窦腔的空间密闭，可以为植骨后的愈合和骨再生提供一个稳定的环境。上颌窦提升可分为经外侧壁开窗上颌窦底提升和穿牙槽嵴顶上颌窦底提升，此次实验采用的是比格犬上颌窦外侧壁开窗植骨手术。因犬的上颌窦颊侧有大的血管穿通走行，所以此次实验采取从腭侧入路进行上颌窦侧壁开窗。

综上所述，此次实验证实，未脱矿和部分脱矿牙本质颗粒均可以作为骨移植替代材料用于骨缺损的修复，部分脱矿牙本质颗粒的成骨效果要优于未脱矿牙本质颗粒，提示部分脱矿牙本质颗粒具有更好的成骨性能。但在相同时间内，未脱矿牙本质颗粒吸收少，具有良好的空间维持能力。因此，临床上应根据骨缺损的部位、形态以及治疗需要选择适合的骨移植材料。牙本质颗粒的成骨潜能使之有望成为新型骨移植替代材料，但是关于其颗粒大小、脱钙程度的控制还需要进一步研究。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

文题释义：
部分脱矿牙本质颗粒：将人牙齿去除牙釉质、牙骨质和牙髓后，研磨成直径为0.5-1.0 mm的颗粒，然后经过脱钙、脱脂、消毒、灭菌处理，可以作为修复颌骨缺损的骨移植材料，其成分与骨组织类似，含有丰富的钙磷等无机物和各种生长因子，其中的胶原成分是细胞再生的优良载体。部分脱钙处理可以使颗粒表面的胶原充分暴露，促进生长因子释放，有利于细胞的附着，加速骨组织再生。
成骨性能：是评价骨移植替代材料在骨缺损修复重建和骨组织再生中的能效指标。理想的骨移植材料应具有骨生成性、骨诱导性及骨传导性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

该文研究的是骨移植替代材料部分脱矿的异种牙本质颗粒，相对于其他骨移植材料而言，牙本质颗粒具有来源广泛、价格低廉、制备简便的优点。部分脱矿的牙本质颗粒吸收与新骨的形成之间存在着平衡，相对于未脱矿的牙本质颗粒和完全脱矿的牙本质颗粒而言，相同时间内其具有较高的成骨活性，所以此次实验将其作为研究对象，从而为临床牙本质颗粒的应用提供参考。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程