铍对牙龈卟啉单胞菌菌毛基因型的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.30.010

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (30): 4816-4822.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.30.010

• 生物材料基础实验 basic experiments of biomaterials • 上一篇下一篇

铍对牙龈卟啉单胞菌菌毛基因型的影响

黄睿¹，李庆艳²，林华³，郭巍⁴，高宁³

1四川大学华西口腔医学院，四川省成都市 610041
2四川省肿瘤医院口腔科，四川省成都市 610000
3四川大学华西口腔医学院修复科，四川省成都市 610041
4北京市瑞尔齿科，北京市 100000

修回日期:2014-04-20 出版日期:2014-07-16 发布日期:2014-08-08
通讯作者: 高宁，博士，教授，四川大学华西口腔医学院修复科，四川省成都市 610041
作者简介:黄睿，女，1986年生，重庆市人，汉族，四川大学华西口腔医学院在读硕士，主要从事口腔修复学方面研究。
基金资助:
四川省科技厅支持项目(2008SG0023)

Influence of beryllium ions on genotype of Porphyromonas gingivalis fimbriae gene cluster

Huang Rui¹, Li Qing-yan², Lin Hua³, Guo Wei⁴, Gao Ning³

1West China School/Hospital of Stomatology, Sichuan University, Chengdu Province, China
2Department of Stomatology, Sichuan Cancer Hospital, Chengdu 610000, Sichuan Province, China
3Department of Prosthodontics, West China School/Hospital of Stomatology, Sichuan University, Chengdu Province, China

Revised:2014-04-20 Online:2014-07-16 Published:2014-08-08
Contact: Gao Ning, M.D., Professor, Department of Prosthodontics, West China School/Hospital of Stomatology, Sichuan University, Chengdu Province, China
About author:Huang Rui, Studying for master’s degree, West China School/Hospital of Stomatology, Sichuan University, Chengdu Province, China
Supported by:
the Grant from Sichuan Science and Technology Bureau, No. 2008SG0023

摘要/Abstract

摘要：

背景：含铍合金口腔修复体在口腔湿润的环境中合金易被腐蚀、溶解而释放出铍离子，铍离子对牙周病主要致病菌——牙龈卟啉单胞菌菌毛基因型是否有影响？
目的：检测铍离子对牙龈卟啉单胞菌菌毛基因型的影响。
方法：将复苏后的牙龈卟啉单胞菌置于含铍离子浓度为10×10^-6，5×10^-6，1.25×10^-6的人工唾液中厌氧培养48 h，采用PCR扩增、测序的方法从分子水平检测铍离子对牙龈卟啉单胞菌菌毛基因型的影响。
结果与结论：在实验条件下培养后的牙龈卟啉单胞菌fimA基因出现突变现象，表现为：当铍离子浓度为5×10^-6时，DNA 217、和257位点处出现G/A套峰，与其他组测得的碱基G不同，表明此处有可疑的碱基变化，部分碱基由G转变为A；所有浓度都发现DNA 101位点处插入由7个A碱基组成的碱基(段)，目前研究尚未发现突变的发生与铍离子浓度存在直接相关关系。铍离子可影响牙龈卟啉单胞菌fimA基因发生变化，可能引起其阅读框架的移位及编码的蛋白合成异常，进而引起牙龈卟啉单胞菌黏附能力及致病力的改变。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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关键词: 生物材料, 口腔生物材料, 牙周损伤, 铍离子, 牙龈卟啉单胞菌, 菌毛, 黏附能力, 致病力, fimA分型

Abstract:

BACKGROUND: In oral warm and moisture circumstance, alloy which contains Be is easily to be eroded to release Be2+. But there is still no research focusing on beryllium influence on genotype of Porphyromonas gingivalis fimbriae gene cluster.
OBJECTIVE: To investigate Be2+ effect on genotype of Porphyromonas gingivalis fimbriae gene cluster.
METHODS: The revived Porphyromonas gingivalis was resuscitated for 48 hours in the anaerobic culture medium with different concentration of Be²⁺ (10×10^-6, 5×10^-6, 1.25×10^-6). Through PCR amplification and sequencing, we investigated the effects of Be2+ on genotypes of Porphyromonas gingivalis fimbriae gene cluster.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) When Be2+ concentration was 5×10-6, we found the peak of 217 and 257 sites on DNA sequence expressing G/A overlap peak, different from G single peak of the other groups, suggesting the suspicious bases changes, part of the single base G mutated into A. (2) On all concentrations, we found a base group composed of seven A bases was inserted into the 101 site of DNA sequence. Up to now, there is no direct contacts of the mutations occurring to Be2+ concentration. Changes of gene may lead to the shifting of the reading frame, the abnormal synthesis of proteins, the change of Porphyromonas gingivalis fimA gene toxicity, and lastly the unbalance of the micro-ecological environment.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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Key words: beryllium, Porphyromonas gingivalis, fimbriae, bacterial, pathogenicity

中图分类号:

R318

黄睿，李庆艳，林华，郭巍，高宁. 铍对牙龈卟啉单胞菌菌毛基因型的影响[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(30): 4816-4822.

Huang Rui, Li Qing-yan, Lin Hua, Guo Wei, Gao Ning. Influence of beryllium ions on genotype of Porphyromonas gingivalis fimbriae gene cluster[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(30): 4816-4822.

图/表（结果） 3

2.1 牙龈卟啉单胞菌基因组DNA的纯度 紫外分光光度计测得A-D组牙龈卟啉单胞菌ATCC33277基因组DNA在260 λm处吸光度值分别是1.197，1.224，1.212和1.206，在280 λm处吸光度值分别为0.650，0.674，0.670，0.664，A₂₆₀/A₂₈₀分别等于1.84，1.82，1.81，1.82，说明所提取的DNA纯度较高。1%琼脂糖凝胶电泳结果显示，DNA成明亮区带，无散开及拖尾现象，说明提取的DNA纯度较高，抽提过程中没有发生降解(图2)。

2.2 菌毛基因fimA PCR扩增产物 1%琼脂糖凝胶电泳结果显示，菌毛基因fimA PCR扩增产物为单一、明亮扩增带。图3中左侧条带为分子量marker，右侧4个条带左起分别为实验组A、B、C组和对照组D组的fimA基因。

2.3 菌毛基因fimA测序及结果分析 实验组fimA基因测序结果分析见图4(加粗部分表示突变碱基，----表示插入碱基)。突变处fimA基因正向测序图谱见图5。

fimA测序图谱显示测序背景噪声低，杂峰干扰少，说明细菌无污染，测序结果准确。

由fimA测序结果可知，fimA基因突变集中于5’端(图4)。考虑到测序前端受荧光干扰，序列可能有差异，特对测序图谱进行检验(图5A，B)。结果表明在fimA 5’端有9个碱基与菌毛基因fimA，Genbank序号D17795碱基不同，未发现碱基缺失。提示此区域可能为fimA基因的高突变区，对Be²⁺的影响反应明显。当Be²⁺浓度为5×10^-⁶时，DNA 217、和257位点处出现G/A套峰，与其他组测得的碱基G不同，表明此处有可疑的碱基变化，部分碱基由G转变为A。当Be²⁺浓度为10×10^-⁶、5×10^-⁶、1.25×10^-⁶时，测序分析结果中DNA 101位点处插入由7个A碱基组成碱基(段)，表明此处为突变敏感区。除此之外，未发现实验组与菌毛基因fimA基因序列的差异。

2.4 与基因库中提供的序列比较 经序列对比分析可知，牙龈卟啉单胞菌经过5次连续传代培养，阳性对照组fimA基因未检测出DNA序列的变化，表明无外界影响因子，短时间内细菌的序列未发生可检出的变化。在fimA的其他区域，测定的序列与阳性对照组及Genbank报道的序列相一致，这表明其他区域相对保守，不易受外界因素影响而改变。

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引言

材料方法

设计：观察性实验。

时间及地点：于2013年6月至2014年3月在四川大学华西口腔医学院国家重点实验室完成。

材料：

实验中应用的仪器设备：超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)；Millipore纯水器(Millipore，法国)；PCR扩增仪(BIO-RAD C1000型，美国)；CrystalSpec比浊仪(Becton Dickinson，美国)；UV凝胶图像自动分析仪(UVI，英国)；凝胶电泳仪(BIO-RAD，美国)；紫外可见分光光度计(上海第三分析仪器厂752C型)；台式高速冷冻离心机(Jouan MR1812型，法国)；厌氧培养箱(浙江义乌冷冻机总厂 DY-II型)；1000，100 μL微量可调式移液器(Eppendorf，德国)。

实验中应用的主要试剂：牛心脑浸液培养基(BHI，Oxoid，英国)；牛心脑浸液辅助琼脂平板(BHI-S，Oxoid，英国)；牛血清白蛋白(BSA，Amresco，美国)；Pfu DNA聚合酶(北京赛百盛基因技术有限公司)；dNTP(北京赛百盛基因技术有限公司)；基因组小量抽提试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司)；PCR引物(上海捷倍思公司合成)；其他试剂均为国产分析纯或进口分装。

人工唾液：含KCl 2.4 g、K₂HPO₄ 1.4 g、Ca₃(PO₄)₂ 0.6 g、K₂SO₄ 0.9 g、Na₂SO₄ 0.9 g、牛血清白蛋白5.0 g、去离子水100 mL，以NaOH调节pH值为6.9-7.1。

实验方法：

菌株的复苏及鉴定：将牙龈卟啉单胞菌ATCC33277冻干菌株(四川大学华西口腔医学院国家重点实验室提供)接种于BHI平板，厌氧培养48 h(37 ℃、体积分数80%N₂、体积分数10%CO₂、体积分数10%H₂)。形态学检查为纯培养物，再接种于BHI-S琼脂平板上厌氧培养48 h，经形态学及生化试验鉴定为纯培养物后纳入实验。

分离扩增单个菌落：采用划线法分离单个菌落。挑取单菌落接种于BHI血平板上，厌氧培养(37 ℃、体积分数80%N₂、体积分数10%CO₂、体积分数10%H₂)48 h，传代增菌。

牙龈卟啉单胞菌悬液的配制：无菌接种环刮取平板上的细菌，乳化、分散至BHI液体培养基中，用CrystalSpec^TM菌液浓度分光光度仪比浊，制成浊度为1×10⁸ CFU/mL的菌悬液(CFU即colony forming unit，菌落形成单位)，用BHI液体培养基稀释成1×10⁶ CFU/mL的实验菌液。在牙龈卟啉单胞菌菌悬液中加入无菌hemin-VitK₁，备用。

细菌传代培养：模拟诱变剂引发细菌突变分离结构基因点突变的方法，将细菌在含Be²⁺环境中连续传代培养。具体方法如下：①将BeSO₄•4H₂O溶于人工唾液中，配成含Be²⁺浓度为20×10^-⁶、10×10^-⁶、2.5×10^-⁶共3个浓度梯度的溶液。取4个2 mL Eppendorf管，每管加入含hemin-VitK₁的BHI菌悬液0.5 mL。实验组随即选取3管分为A组、B组、C组，分别加入含Be²⁺浓度为20×10^-⁶、10×10^-⁶及2.5×10^-⁶的人工唾液各0.5 mL，使Be²⁺终浓度分别为10×10^-⁶、5×10^-⁶、1.25×10^-⁶；阳性对照组标记为D组，加不含Be²⁺的人工唾液0.5 mL。厌氧培养(37 ℃、体积分数80%N₂、体积分数10%CO₂、体积分数10%H₂)48 h。②将样本离心(4 ℃、13 000 r/min离心4 min)，弃上清。按①中方法加入培养基和人工唾液，厌氧培养48 h。依此法重复传代5次后PBS冲洗3次，备用。

提取细菌基因组DNA：采用基因组小量抽提试剂盒提取牙龈卟啉单胞菌DNA，操作步骤同说明书。取部分DNA进行纯度鉴定，其余置-20 ℃冰箱冷冻作为模板DNA保存备用。

DNA纯度鉴定：

紫外光吸收法：取DNA溶液50 μL，用蒸馏水稀释至 5 mL。以TE作空白对照。

电泳鉴定：取DNA样品5 μL加上样缓冲液2 μL，在1%琼脂糖凝胶中进行水平板微型电泳(100 V，30 min)，观察提取的基因组DNA的纯度。

设计并合成引物：Fujuanra及Shi等已完成了fimA基因的测序工作。本实验使用NCBI开发的Entrez系统检索Genbank核酸数据库，搜索牙龈卟啉单胞菌ATCC33277 fimA基因全序列。按引物设计原则设计特异性PCR引物，并送交上海捷倍思公司合成。

菌毛基因fimA，Genbank序号D17795(图1)。PCR引物序列为：fimA(sense)：5’-CTG AAC GAA CTG CGA CGC TAT ATG CA-3’，fimA(antisense)：5’-GTT TTT TAG TCG TTT GAC GGG TCG AT-3’。

菌毛基因PCR扩增：①菌毛基因的PCR扩增：在PCR扩增仪上进行，模板DNA为牙龈卟啉单胞菌ATCC33277染色体DNA。②扩增反应体系：反应总体积100 μL，其中DNA模板14 μL，10×buffer 12.5 μL，2.5 mmol/L MgCl₂ 10.5 μL，250 μmol/L dNTP 3 μL，ddH₂O 55 μL ，Pfu DNA聚合酶1 μL，10 μmol/L上下游引物各4 μL。③扩增条件：预变性94 ℃ 2 min，变性94 ℃ 10 s，退火55 ℃ 30 s，延伸至72 ℃ 2 min，30个循环，末次延伸72 ℃ 10 min，4 ℃保存。采用未经Be²⁺处理的标准株作为阳性对照，去离子水作为阴性对照。

扩增产物的检测：取扩增产物5 μL，与含2 μL上样缓冲液混合后上样，以λDNA/Hind Ⅲ为分子量参照物，在1%琼脂糖凝胶中进行水平板微型电泳(100 V，50 min)，UV凝胶图像自动分析仪上检测PCR产物。

回收PCR产物、测序：电泳检测PCR产物为明亮的单一条带，无杂带。切胶回收纯化PCR产物。由上海生工生物工程技术服务有限公司完成PCR产物正、反向测序。

测序结果分析：检验所测序列，正反向已测通。通过互连网在美国国立卫生研究院(www.ncbi.com)采用Blast 2Sequence软件比较实验组和阳性对照组牙龈卟啉单胞菌fimA基因碱基序列上的差异，并将结果与Genbank中报道的基因序列相对比。

测序时由于荧光染料的干扰，测序结果在引物3’端后面的10-30个碱基不一定能够准确判读。因此在利用计算机软件比较的基础上，再根据已知序列信息及测序图作出判断，并记录碱基发生变化的区域及数目。

主要观察指标：铍离子对牙龈卟啉单胞菌菌毛基因型的影响。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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讨论

3.1 Be²⁺对牙龈卟啉单胞菌菌毛基因fimA的影响 本实验结果表明，在含一定浓度Be²⁺的环境中连续传代培养的牙龈卟啉单胞菌发生碱基序列的变化。fimA基因出现基因突变，主要表现为点突变和碱基(段)插入，其中菌毛基因(fimA)5’端为较敏感的区域。

由于细菌属于原核细胞型微生物，细菌染色体含有核蛋白，不含组蛋白，基因结构连续，无内含子^[10]。细菌的形态结构、代谢活动及毒力和抗原性等都是以生化活动为基础的^[11]，而生化活动又主要是通过一系列酶实现的^[12]。因此从某种意义上讲，细菌的大多数变异都是生化变异或酶活性变异。上述变化易引起阅读框架的移位，导致蛋白合成的异常，继之引起细菌功能的改变。fimA基因编码细菌菌毛，而P.gingivalis菌毛是菌体表面卷曲的丝状蛋白附属器，该菌通过其主要黏附因子菌毛蛋白A黏附并入侵牙龈上皮细胞^[13]，与P.gingivalis的毒力密切相关；同时，fimA是P.gingivalis的表面抗原成分，具有良好的免疫反应性^[14-16]。

此外，还有研究表明菌毛基因的差异可导致细菌表面结构的差异，从而导致致病力的差异。可以推测，受Be²⁺作用，牙龈卟啉单胞菌fimA基因发生的改变可导致该菌黏附能力与致病力改变。但牙龈卟啉单胞菌根据其fimA基因基因型的不同可分为6型(Ⅰ-Ⅴ和Ib)，本实验对象P.g ATCC 33277为Ⅰ型，因此，本实验检测到的基因变化是否会发生在各型菌株中尚需进一步实验证实。

生物体有3种DNA修复机制：DNA聚合酶校正、甲基化介导的错配修复和G-A错配修复。在DNA复制过程中核苷酸错误掺入大多数可被细胞修复。当一个错误信息被整合入DNA，复制和修复间的竞争会决定该错误是否能够成为可遗传变异^[17-18]。因此，本实验中检测到的基因变化是否能够遗传而成为细菌稳定的性状尚需进一步实验证实。

3.2 提高扩增效能的手段 为确保测序结果的准确性，在进行实验前，先采用划线法分离并扩增单菌落，以保证传代的细菌来自于单克隆^[19]，有效避免多克隆的细菌PCR产物使测序中出现较多套峰，提高背景噪声的缺点。

由于已有明确证据表明Be²⁺有强致癌性和致突变性^[20-22]，为防止引物区突变而影响PCR扩增过程，本实验选用Pfu DNA聚合酶增强扩增效能^[23]。Pfu DNA聚合酶具有独特的3’-5’外切核酸酶活性，能修正错配碱基，从而保证DNA扩增的高保真度。需要注意的是，Pfu DNA聚合酶在没有dNTP时，能够降解模板DNA，因此应最后将该酶加入到反应体系中。

引物与模板的退火温度由引物的长度及GC含量决定，降低退火温度可以提高扩增的产量^[24]。考虑到Be²⁺作用后引物区若发生突变会影响引物与DNA模板的结合，因此本实验选择较低的退火温度(55 ℃)，以提高PCR反应的灵敏度。

3.3 存在的问题 Summers等^[25]发现当对临床病例及实验动物给以银汞合金修复缺损牙体后，可在其肠道菌群及口腔链球菌中检出有汞抗性的菌株，而当玻璃离子充填剂代替了银汞合金后，有汞抗性的菌株明显减少。这是首次在口腔中检测到具有抗汞质粒的细菌。与此相似，本实验不能排除微生物长时间处于含Be²⁺离子的环境中，也会产生对Be²⁺有抗性的菌株的可能性，该问题还有待进一步探讨和深入研究。虽然通过本实验说明受Be²⁺作用，牙龈卟啉单胞菌fimA基因发生的改变可导致该菌黏附能力与致病力改变。但是，口腔的健康需要一个平衡的口腔微生态环境，并非牙周致病菌黏附能力与致病力改变就一定对口腔

健康有利或不利。戴用义齿修复体可导致口腔微生态环境改变，因此，修复材料的抗腐蚀性、抗溶解性及非生物利用性能对于保持口腔健康显得尤为重要^[26]。否则，可能引起一些微生物的减少，另一些微生物的增加，从而打破口腔微生态平衡，导致口腔疾病的发生。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程
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