不同氧环境中破骨细胞特异性基因的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.29.018

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (29): 4695-4700.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.29.018

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不同氧环境中破骨细胞特异性基因的表达

梁静，周琦，魏立，胡方琼，王君

上海骨与关节病损重点实验室，上海市伤骨科研究所，上海瑞金医院，上海交通大学医学院，上海市 200025

修回日期:2014-06-12 出版日期:2014-07-09 发布日期:2014-07-09
通讯作者: 王君，主管技师，上海骨与关节病损重点实验室，上海市伤骨科研究所，上海瑞金医院，上海交通大学医学院，上海市 200025
作者简介:梁静，女，1979年生，汉族，山东省泰安市人，2005年上海第二医科大学毕业，硕士，主管技师，主要从事骨系细胞培养。
基金资助:
上海市卫生局青年基金(20114Y135)

Specific gene expression of osteoclasts under different oxygen tension

Liang Jing, Zhou Qi, Wei Li, Hu Fang-qiong, Wang Jun

Shanghai Key Laboratory for Bone and Joint Diseases, Shanghai Institute of Orthopaedics and Traumatology, Shanghai Ruijin Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200025, China

Revised:2014-06-12 Online:2014-07-09 Published:2014-07-09
Contact: Wang Jun, Senior technologist, Shanghai Key Laboratory for Bone and Joint Diseases, Shanghai Institute of Orthopaedics and Traumatology, Shanghai Ruijin Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200025, China
About author:Liang Jing, Master, Senior technologist, Shanghai Key Laboratory for Bone and Joint Diseases, Shanghai Institute of Orthopaedics and Traumatology, Shanghai Ruijin Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200025, China
Supported by:
the Shanghai Municipal Health Bureau Project for Youths, No. 20114Y135

摘要/Abstract

摘要：

背景：课题组以往研究证实，氧浓度过低乃至处于低氧时(体积分数2%O₂)，破骨前体细胞的增殖及破骨细胞的分化和功能都受到抑制，但体外培养的破骨细胞在不同氧环境下的基因表达未见有相关报道。

目的：实验拟观察不同氧环境下破骨细胞各特异性基因的表达规律，探寻氧环境改变影响破骨细胞分化的表达机制。

方法：将破骨前体细胞株经质量浓度均为10 μg/L的核因子κB受体活化因子配体和巨噬细胞集落刺激因子联合诱导成为成熟的破骨细胞，然后分别置于常氧、组织氧、低氧(体积分数20%，7%，2%)条件下培养，用抗酒石酸酸性磷酸酶染色检测破骨细胞形成的变化，并分别在培养第1-7天收集细胞，通过定量PCR方法检测核因子κB受体活化因子，肿瘤坏死因子受体相关因子6，抗酒石酸酸性磷酸酶，组织蛋白酶K基因mRNA的表达。

结果与结论：低氧条件下抗酒石酸酸性磷酸酶阳性的破骨细胞数显著低于组织氧和常氧培养时形成的抗酒石酸酸性磷酸酶阳性细胞数(P < 0.05)。不同氧环境下，破骨细胞中核因子κB受体活化因子mRNA的表达无明显改变，组织氧和常氧培养下肿瘤坏死因子受体相关因子6 mRNA的表达在培养第5天最高(P < 0.05)。随着氧浓度的降低，抗酒石酸酸性磷酸酶和组织蛋白酶K mRNA表达时间延后，组织氧培养条件下此2者的表达可以保持在最高水平。结果证实，与常氧和低氧条件相比，破骨细胞在组织氧培养条件下培养时更易促进其分化，从而维持其活性和功能。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 骨组织构建, 破骨细胞, 抗酒石酸酸性磷酸酶, 联合诱导, 肿瘤坏死因子受体相关因子6, 巨噬细胞集落刺激因子, 氧浓度, 核因子κB受体活化因子, 组织蛋白酶K

Abstract:

BACKGROUND: Preliminary studies of our research group have confirmed that the proliferation of preosteoclasts and the differentiation and function of osteoclasts could be inhibited when they were cultured in lower oxygen tension even hypoxia (2% O₂), but the gene expression of osteoclasts cultured in vitro have not been reported.

OBJECTIVE: To examine the effect of oxygen tension on specific gene expression of osteoclasts in vitro and explore the mechanism of osteoclast differentiation influenced by oxygen tension.

METHODS: The preosteoclasts were induced with 10 μg/L macrophage colony stimulating facto and 10 μg/L soluble receptor activator of nuclear factor-κB ligand into mature osteoclasts. Then the osteoclasts were cultured in normoxia, tissue oxygen and hypoxia (20%, 7%, 2% O₂) respectively. Cells were then stained for tartarate-resistant acid phosphatase to assess osteoclastic formation. Cells were collected at 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 days after culture respectively. The soluble receptor activator of nuclear factor-κB ligand, tumor necrosis factor receptor-associated factor 6, tartarate-resistant acid phosphatase, and cathepsin K mRNA expression levels were determined using real-time quantitative PCR.

RESULTS AND CONCLUSION: The number of osteoclasts positive for tartarate-resistant acid phosphatase in the hypoxia was significantly lower than that in the tissue oxygen and normoxia (P < 0.05). Under different oxygen tension, the mRNA expression levels of soluble receptor activator of nuclear factor-κB ligand in osteoclasts maintained unchanged. The mRNA expression levels of tumor necrosis factor receptor-associated factor 6 reached the peak at

5 days after culture in tissue oxygen and normoxia (P < 0.05). The mRNA expression time of tartarate-resistant acid phosphatase and Cathepsin K were delayed accompanied by decreased oxygen tension, but the maximum were maintained in tissue oxygen. Compared with normoxia and hypoxia, osteoclasts cultured in tissue oxygen are more prone to differentiate and maintain the activity and functions.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Key words: osteoclasts, bone absorption, osteoporosis, tissue engineering

中图分类号:

R318

梁静，周琦，魏立，胡方琼，王君. 不同氧环境中破骨细胞特异性基因的表达[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(29): 4695-4700.

Liang Jing, Zhou Qi, Wei Li, Hu Fang-qiong, Wang Jun. Specific gene expression of osteoclasts under different oxygen tension[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(29): 4695-4700.

图/表（结果） 2

2.1 MOCP5诱导培养过程中的形态变化 破骨细胞前体细胞株MOCP5在诱导培养的第3天即可见细胞开始融合的现象，随培养生长时间延长，融合细胞胞体逐渐增大，似成串的葡萄，呈圆形或方形，胞膜出现伪足样突起而呈煎蛋样，小的融合细胞可以继续融合成更大的多核细胞，细胞内可见3至几十个细胞核，遍布胞体；抗酒石酸酸性磷酸酶染色阳性，酶活性物质位于胞浆内，见图1。骨髓来源的破骨前体细胞诱导得来的破骨细胞的胞核则集中于胞体中央或沿胞膜排列。

2.2 不同氧环境下破骨细胞前体细胞经诱导形成的抗酒石酸酸性磷酸酶阳性细胞数的变化 MOCP5经诱导培养至第6天^[8]，在体积分数20%，7%，2%O₂环境下，抗酒石酸酸性磷酸酶阳性细胞数分别为每100倍视野下(23.8±1.64)，(34.8±3.42)，(3.5±1.0)个，3组差异有显著性意义(P < 0.05)，体积分数7%O₂培养下形成的破骨细胞较常氧培养增加，而2%O₂培养下形成的破骨细胞较常氧培养减少。提示，体积分数2%O₂环境下破骨细胞前体细胞分化成熟为破骨细胞的数量明显少于体积分数7%O₂和20%O₂。见图2、图3A。

2.3 体积分数20%O₂时MOCP5各基因表达的时间变化 在MOCP5的诱导分化过程中，RANK基因的表达没有明显改变；肿瘤坏死因子受体相关因子6表达逐渐增加，培养第5天最高；抗酒石酸酸性磷酸酶培养第3天表达最高，后逐渐下降；组织蛋白酶K开始表达逐渐增加，到培养第5天最高，后逐渐下降。见图3B。

2.4 体积分数7%O₂时MOCP5各基因表达的时间变化 在MOCP5的诱导分化过程中，RANK基因的表达没有明显变化；肿瘤坏死因子受体相关因子6培养第5天表达最高，其他时间基本一致；抗酒石酸酸性磷酸酶表达逐渐升高，并在培养3-5 d保持在一定水平，至培养第7天表达最高；组织蛋白酶K表达逐渐升高，至培养第4天开始保持在一定水平至培养第7天。见图3C。

2.5 体积分数2%O₂时MOCP5各基因表达的时间变化 在MOCP5的诱导分化过程中，RANK基因的表达没有明显变化；肿瘤坏死因子受体相关因子6培养第3天表达最高，后逐渐下降；抗酒石酸酸性磷酸酶和组织蛋白酶K表达均是逐渐升高，至培养第7天表达最高。见图3D。

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引言

随着社会老龄化的加剧，骨质疏松在老年男性和女性中的患病率逐年升高。破骨细胞是骨重建过程中参与骨吸收的主要功能细胞，体外破骨细胞样细胞的培养及相关研究是骨质疏松疾病发病机制的研究基础。老年人骨髓中、缺乏血管的脂肪组织、炎症或感染组织、关节炎的关节、肿瘤、损伤、糖尿病的缺血肢体及骨折部位，氧分压都是很低的。虽然，很多报道提出低氧是破骨细胞形成和骨吸收的重要刺激因素，无论在猫科动物^[1]、鼠类^[2-3]、还是人类单核细胞^[4]，低氧均可促进破骨细胞分化，具体机制不明^[5]。而且有实验证实破骨细胞经长期低氧(体积分数2%)培养，数目和吸收功能均较常氧条件下(体积分数20%)增强，低氧条件明显促进了破骨细胞的分化^[1-2]。Knowles 等^[4]研究表明长期置于体积分数2%O₂环境完全抑制了破骨细胞的形成，但细胞在低氧-再灌注的培养条件下比普通培养会产生更多的破骨细胞。Nomura等^[6]的培养体系中体积分数3%，5%，10% O₂条件下产生了大量的破骨细胞，而体积分数1% O₂完全抑制了破骨细胞形成。

由于细胞来源的不同(大鼠、小鼠、人)，低氧条件的创造(人工培养瓶内充氮气平衡得到低氧和低氧培养箱的使用)^[1-2]，氧浓度的差异(体积分数1%-20%)、破骨细胞的诱导方法(不同浓度、不同公司的诱导剂核因子κB受体活化因子配体和巨噬细胞集落刺激因子)以及低氧干预的时间、低氧干预时破骨细胞的状态等实验条件、实验设计的不同，得到了不同的实验结果。已经证实，氧浓度过低乃至处于低氧时(体积分数2%)，破骨前体细胞的增殖及破骨细胞的分化和功能都受到抑制，而在接近骨髓环境的氧浓度下(体积分数7%)小鼠骨髓来源的经核因子κB受体活化因子配体和巨噬细胞集落刺激因子诱导的破骨细胞的分化和吸收功能更强^[7]。氧环境不但对肿瘤细胞、神经细胞的生存、功能起重要作用，对破骨前体细胞的增殖、破骨细胞的分化和功能也起重要作用。但是，体外培养的破骨细胞在不同氧环境下的特异性基因表达的规律未见有相关报道，探讨不同氧环境下破骨细胞特异性基因表达的变化有利于发现氧环境是通过何种机制影响破骨细胞的存活、分化和功能的，并为以后研究氧环境对破骨细胞的作用提供线索。

本次实验以破骨前体细胞株MOCP5为研究对象，研究了不同体积分数20%，7%、2%O₂的培养条件对破骨细胞的分化的影响，并进一步观察破骨细胞在不同氧环境下各特异性基因的表达规律，继续探讨氧环境改变对破骨细胞分化和功能的影响。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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材料方法

设计：细胞形态学和生物学特性实验。

时间及地点：于2012年12月至2013年6月在上海市伤骨科研究所完成。

材料：

细胞：破骨细胞前体细胞株MOCP5由原哈佛大学牙医医院Forsyth研究所李亦平教授赠送。

实验方法：

破骨细胞前体细胞MOCP5的诱导培养：实验用的是破骨前体细胞株MOCP5。配制诱导条件培养液^[8-9]，α-MEM培养液中含质量浓度10 μg/L巨噬细胞集落刺激因子、质量浓度10 μg/L核因子κB受体活化因子配体、体积分数10%胎牛血清、青霉素100 U/mL、链霉素100 U/mL，稀释细胞成悬液，以5×10⁸ L^-¹的细胞浓度接种于6孔板，置于37 ℃、体积分数5%CO₂、饱和湿度的培养箱常规培养。MOCP5接种24 h后，分别在体积分数20%，7%，2%O₂(N₂平衡)培养箱中继续培养，隔天换诱导条件培养液，共培养7 d后进行后续试验，实验重复3次。

抗酒石酸酸性磷酸酶染色：细胞培养6 d，取出染色，吸除培养液，温去离子水洗细胞后，在室温下用固定液(体积分数26%柠檬酸盐溶液、66%丙酮、8%甲醛溶液)固定30 s，去离子水冲洗，加抗酒石酸酸性磷酸酶染色液，置于37 ℃避光1 h，用去离子水冲洗，显微镜观察。抗酒石酸酸性磷酸酶阳性且细胞核多于3个的多核细胞认定为成熟破骨细胞。

细胞收集和反转录PCR：分别在第1-7天收集各组细胞抽提RNA，并进行反转录。取RNA 2 μg，随机引物1 μL，加水至12 μL，70 ℃ 5 min置于冰上；5×反应缓冲液4 μL，10 mmol/L dNTP 2 μL，RNase抑制剂0.5 μL，加水至 19 μL，25 ℃ 5 min；反转录酶(M-MLV)1 μL，42 ℃ 1 h，70 ℃ 10 min，置于冰上终止反应。

定量PCR反应：SYBR Green I荧光标记法在Real-time PCR扩增仪行PCR扩增反应，各基因(RANK、肿瘤坏死因子受体相关因子6、抗酒石酸酸性磷酸酶和组织蛋白酶K)引物见表1，反应条件均为预变性94 ℃ 5 min―变性94 ℃ 30 s―退火55 ℃ 30 s―延伸72 ℃ 20 s― 90 ℃ 10 s―熔解曲线，共40个循环。实验可以得到样本目的基因到达设定阈值时所经历的循环数即Ct值。目的基因的量为2^-^△△Ct，△△Ct =(Ct_目的基因-Ct_管家基因)_实验组-(Ct_目的基因- Ct_管家基因)_对照组，表示的是实验组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数。

主要观察指标：①MOCP5诱导培养过程中的形态变化。②不同氧环境下破骨细胞前体细胞经诱导形成的抗酒石酸酸性磷酸酶阳性细胞数的变化。③不同氧浓度下各基因表达的时间变化。

统计学分析：计量资料用x(_)±s表示，用Excel软件统计学分析处理，组间数据差异比较用配对t 检验，P ≤ 0.05被认为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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讨论

氧环境和破骨细胞存在密切联系。当组织血供减少或血供破坏会引起低氧。动脉血氧分压为95 mm Hg (1 mm Hg=0.133 kPa，12%)，静脉和毛细血管氧分压为40 mm Hg (5%)，接近空气的1/4。在正常组织中，内部间隙氧分压值为3%-9%^[10-11]。从正常志愿者得到的骨髓的氧分压为6.6%^[12-13]。低氧是某些骨骼环境的特征，包括类风湿性关节炎、病理性骨折、原发性骨肿瘤、骨转移癌、牙周炎和正畸牙移动^[3，14-18]。低氧下的破骨细胞通过糖酵解途径和线粒体ETC增加电子流，由HIF-1a介导可启动无氧糖酵解的特殊元件。这使破骨细胞产生足够的ATP来维持增强的骨吸收^[19]。Yamasaki等^[20]通过在正常氧分压(体积分数20%O₂)或高氧分压(体积分数40%O₂)下培养人CD14阳性细胞(破骨细胞前体细胞)和(或无)成骨细胞样支持细胞(Sao-4/3细胞)研究对破骨细胞生成的作用。在支持细胞存活时，高氧分压明显延长了破骨细胞前体细胞形成的周期，明显而持久的促进支持细胞产生巨噬细胞集落刺激因子。实验发现氧浓度过低(体积分数2%O₂)会抑制破骨细胞的分化和功能，体积分数7%O₂是最适合破骨细胞的发育的。本次实验中用破骨前体细胞株MOCP5经肿瘤坏死因子受体相关因子6和巨噬细胞集落刺激因子联合诱导成为成熟破骨细胞，在不同氧浓度下培养，发现低氧条件下(体积分数2%O₂)形成的抗酒石酸酸性磷酸酶阳性细胞数明显少于组织氧(体积分数7%O₂)和常氧(体积分数20%O₂)培养。不同的实验条件、细胞来源都会影响实验结果，而且由于各种细胞在分化发育的过程中会有相应的特异性基因表达，而这种特异性基因往往决定了细胞分化的方向、程度，以致影响细胞功能的发挥。所以实验通过收集不同氧浓度下，MOCP5分化成熟过程中的细胞，进一步研究了不同氧浓度下破骨细胞各特异性基因的表达规律，探讨氧分压通过何种途径影响破骨细胞的发育分化。

核因子κB受体活化因子，肿瘤坏死因子受体相关因子6，抗酒石酸酸性磷酸酶，组织蛋白酶K都是破骨细胞特异表达的基因。核因子κB受体活化因子配体和核因子κB受体活化因子结合，使肿瘤坏死因子受体相关因子6聚集在核因子κB受体活化因子的胞内结构域，接着可以激活由MAPKs，JNK，p38MAPK和ERK介导的不同的信号通路。当MAPKs信号通路激活，破骨细胞分化的主要因子活化T细胞的核因子c1(NFAT1)被激活。NFAT1的自我放大效应可以上调破骨细胞成熟的基因，如抗酒石酸酸性磷酸酶/组织蛋白酶K/MMP9，是成熟破骨细胞骨吸收时必须的基因^[21-22]。核因子κB受体活化因子除了破骨前体细胞、成熟破骨细胞和树突状细胞外，还在某些腺体及肿瘤细胞中表达，如乳腺癌细胞和前列腺癌细胞，这两种癌极易骨转移^[23]。肿瘤坏死因子受体相关因子6也参与激活转录因子kB，NFAT1和c-Fos，在破骨细胞分化中扮演重要角色^[24]。肿瘤坏死因子受体相关因子6缺乏鼠会引起严重的骨质硬化^[25]。抗酒石酸酸性磷酸酶和组织蛋白酶K是破骨细胞的标志性基因^[26]。缺乏抗酒石酸酸性磷酸酶小鼠的软骨内骨化被破坏，导致中度骨硬化；而抗酒石酸酸性磷酸酶过表达的转基因小鼠骨转换率增加，引起中度骨质疏松。这说明抗酒石酸酸性磷酸酶是正常骨发育和维持所需要的^[27]。在很多组织中都可以检测到组织蛋白酶K的mRNA，包括骨、卵巢、心脏、胎盘、肺、骨骼肌、结肠和小肠^[28]。组织蛋白酶K属于半胱氨酸肽酶家族，主要生理功能是分解Ⅰ和Ⅱ型胶原^[29]。这种酶在破骨细胞、多核细胞中高表达。组织蛋白酶K缺乏可以引起罕见的基因型疾病，即骨密质发育不全症^[30]。实验研究发现，核因子κB受体活化因子的基因表达在不同的氧浓度下没有随着诱导时间的延长出现明显变化，说明在破骨细胞的分化成熟过程中，体外提供足量的核因子κB受体活化因子时，破骨前体细胞就会产生相应的核因子κB受体活化因子与配体结合，核因子κB受体活化因子受体受氧浓度的影响较小，会保持在一定水平。郎红梅等发现在3%O₂培养时，核因子κB受体活化因子的表达随着缺氧时间的延长而表达增加^[5]。这和实验的实验结果有差异，可能和作者采用成骨细胞破骨细胞共培养体系有关，低氧同时影响了成骨细胞和破骨细胞。常氧和体积分数7%O₂时肿瘤坏死因子受体相关因子6的表达均是在第5天最高，而体积分数2%O₂时在第3天就表达最高，说明肿瘤坏死因子受体相关因子6在破骨细胞的分化成熟过程中是逐渐增加的，并且随着破骨细胞的成熟可达峰值，但氧浓度的变化影响了峰值出现的时间，可能是因为低氧状态下破骨细胞内需表达大量的肿瘤坏死因子受体相关因子6以维持细胞内信号的传导，才能促进破骨细胞的分化。抗酒石酸酸性磷酸酶和组织蛋白酶K分别是破骨细胞分化过程中早期和晚期表达的特异性基因。体积分数20%O₂培养时抗酒石酸酸性磷酸酶和组织蛋白酶K的表达培养第3天出现峰值，而在体积分数7%O₂和2%O₂培养时，抗酒石酸酸性磷酸酶和组织蛋白酶K表达逐渐增加，说明较高氧浓度可以促进破骨细胞的成熟，而在较低的氧浓度下，破骨细胞随着培养时间的延长逐渐成熟。随着氧浓度的降低，破骨细胞内特异性基因表达最高的时间逐渐后移，可能是因为氧浓度下降延长了破骨细胞的成熟时间，以保证破骨细胞的存活；但是在体积分数7%O₂时，抗酒石酸酸性磷酸酶和组织蛋白酶K表达可以维持在较高水平，说明体积分数7%O₂时破骨细胞可以保持在分化状态从而维持其活性和功能。破骨细胞特异性表达的肿瘤坏死因子受体相关因子6、抗酒石酸酸性磷酸酶和组织蛋白酶K可能都是氧感应基因。所以，常氧和低氧条件下破骨细胞的抗酒石酸酸性磷酸酶阳性细胞数均低于7%O₂，可能不是通过刺激破骨细胞受体和信号通路分子的产生，而主要是维持了破骨细胞功能基因的表达。

老年人骨组织中的氧分压降低不但会影响破骨细胞的骨吸收，同时也会影响成骨细胞的骨形成功能。本次实验提示了氧环境不同可以改变破骨细胞特异性基因的表达时间，而接近于体内骨髓环境的氧浓度(体积分数7%O₂)可以维持破骨细胞功能基因的表达。但是，老年人体内的低氧环境、不同氧浓度下成骨细胞和破骨细胞耦联关系的改变以及破骨细胞在低氧环境下的感应机制还有待于进一步研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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不同氧环境中破骨细胞特异性基因的表达

Specific gene expression of osteoclasts under different oxygen tension

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