人端粒酶反转录酶基因转染人胚胎大脑皮质神经元的凋亡

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.29.011

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (29): 4653-4657.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.29.011

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人端粒酶反转录酶基因转染人胚胎大脑皮质神经元的凋亡

吴灵芝¹，李水彬¹，成钢卫¹，汪华侨²，孔令平³

¹中山大学附属梅州医院神经内二科，广东省梅州市 514031；²中山大学中山医学院解剖学教研室脑研究室，广东省广州市 510080；³广州医科大学卫生职业技术学院，广东省广州市 510925

修回日期:2014-06-07 出版日期:2014-07-09 发布日期:2014-07-09
通讯作者: 孔令平，博士，副教授，广州医科大学卫生职业技术学院，广东省广州市 510925
作者简介:吴灵芝，女，1981年生，山东省滨州市人，汉族，硕士，主治医师，主要从事中枢神经退行性病变基础方面的研究。
基金资助:
广东省教育厅科技创新项目(2012KJCX0089)

Apoptosis of human embryonic cerebral cortex neurons transfected with human telomerase reverse transcriptase

Wu Ling-zhi¹, Li Shui-bin¹, Cheng Gang-wei¹, Wang Hua-qiao², Kong Ling-ping³

¹Second Department of Neurology, Meizhou Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 514031, Guangdong Province, China; ²Department of Anatomy and Brain Research, Zhongshan School of Medicine, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China; ³School of Health Vocational Technology, Guangzhou Medical University, Guangzhou 510925, Guangdong Province, China

Revised:2014-06-07 Online:2014-07-09 Published:2014-07-09
Contact: Kong Ling-ping, M.D., Associate professor, School of Health Vocational Technology, Guangzhou Medical University, Guangzhou 510925, Guangdong Province, China
About author:Wu Ling-zhi, Master, Attending physician, Second Department of Neurology, Meizhou Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 514031, Guangdong Province, China
Supported by:
Science and Technology Innovation Foundation of Guangdong Provincial Education Bureau, No. 2012KJCX0089

摘要/Abstract

摘要：

背景：人端粒酶反转录酶重组腺病毒转染原代培养的人胚胎大脑皮质神经元，可以促进细胞生存，抑制凋亡。

目的：观察人端粒酶反转录酶对β淀粉样蛋白(amyloid β-protein，Aβ)诱导人胚胎大脑皮质神经元凋亡的影响。

方法：人胚胎大脑皮质神经元原代培养后，分为3组：对照组、Aβ₂₅_-₃₅组和人端粒酶反转录酶组。Aβ₂₅_-₃₅组和人端粒酶反转录酶组细胞在培养144 h后，用Aβ₂₅_-₃₅5 μmol/L干预24 h。人端粒酶反转录酶组在Aβ₂₅_-₃₅5 μmol/L干预72 h进行人端粒酶反转录酶基因转染。

结果与结论：原代培养的人胚胎大脑皮质神经元培养7 d后，出现凋亡细胞，而Aβ_25-35干预后使凋亡细胞数量增加，而人端粒酶反转录酶可防止Aβ_25-35诱导的人胚胎大脑皮质神经元的凋亡。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 组织工程, 干细胞, 胚胎干细胞, 人端粒酶催化亚基, 诱导, 人胚胎大脑皮质神经元, 阿尔茨海默病, 凋亡, 端粒酶, 反转录酶, 转染

Abstract:

BACKGROUND: Human telomerase reverse transcriptase recombinant adenovirus transfection could promote the survival and inhibit the apoptosis of primary cultured human embryonic cerebral cortex neurons.

OBJECTIVE: To observe the effects of human telomerase reverse transcriptase on the apoptosis of human embryonic cerebral cortex neurons induced by amyloid β-protein invention.

METHODS: Primary cultured cerebral cortex neurons of human embryo were divided into three groups, namely control group, amyloid β-protein (25-35) group, and human telomerase reverse transcriptase group. Except the control group, the cells were cultured for 144 hours and intervened with 5 μmol/L amyloid β-protein (25-35) for 24 hours. Furthermore, the cells in human telomerase reverse transcriptase group were transfected with human telomerase reverse transcriptase group at 72 hours after intervention of 5 μmol/L amyloid β-protein (25-35).

RESULTS AND CONCLUSION: After human embryonic cerebral cortex neurons were cultured for 7 days, the apoptotic cells were found in three groups. The apoptosis of neurons was obviously increased after intervention of amyloid β-protein (25-35). Human telomerase reverse transcriptase transfection could prevent the apoptosis of human embryonic cerebral cortex neurons induced by amyloid β-protein (25-35).

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Key words: cerebral cortex, apoptosis, telomerase, telomerase-binding proteins, transfection

中图分类号:

R318

吴灵芝，李水彬，成钢卫，汪华侨，孔令平. 人端粒酶反转录酶基因转染人胚胎大脑皮质神经元的凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(29): 4653-4657.

Wu Ling-zhi, Li Shui-bin, Cheng Gang-wei, Wang Hua-qiao, Kong Ling-ping. Apoptosis of human embryonic cerebral cortex neurons transfected with human telomerase reverse transcriptase[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(29): 4653-4657.

图/表（结果） 2

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引言

材料方法

设计：细胞学对比观察。

时间及地点：实验于2012年2月至2013年2月在中山大学中山医学院解剖学实验室完成。

材料：药物流产的人胚胎，胎龄12-15周，共28例，来自广州市空军医院、广州药学院第一附属医院和广州市妇幼保健院妇产科。要求胎儿产出时头颅完整，无长时间剧烈脑出血，其父母无遗传性神经系统疾病，无肝炎、艾滋等血液传染病。实验获得的产妇及家属的知情同意并得到中山大学附属梅州医院医学伦理学委员会批准。

方法：

人胚胎大脑皮质神经元的原代培养：胚胎引出后立即置于4 ℃冰箱，尽量无菌操作。4 ℃ D-Hank’s液中运输至无菌操作台。常规消毒，剪开头皮，换无菌眼科镊将脑组织自枕骨大孔处取出至预冷的DMEM/F12培养液，剥除脑膜和血管组织，取海马区神经元。DMEM/F12培养液中漂洗3遍。剪碎，加30 mL 0.25%的胰蛋白酶37 ℃消化 15-25 min，隔5 min振荡1次。加入终止液终止消化，混匀，1 000 r/min离心10 min。沉淀加入分散液，吹打均匀，分装成2个15 mL的离心管，用Paster管吹打至组织分散成单个细胞，总吹打次数小于20次。每管加入沉淀液8 mL， 37 ℃水浴垂直静置15 min，使组织块充分沉淀。取2管上清置于50 mL离心管中，1 000 r/min离心10 min。沉淀加入种植培养液吹打成单细胞悬液。细胞计数，接种，以 1×10⁸ L^-¹的细胞浓度接种于多聚赖氨酸包被(工作浓度 100 mg/L)的96孔板。以1×10⁹ L^-¹的细胞浓度接种于六孔板，37 ℃，体积分数5%CO₂条件下培养。3-5 h后补加足够培养基。24 h后将培养液全部换成无血清培养液。以后每隔两三天半量换液1次。

人胚胎神经元分组培养：神经元分为3组：对照组、Aβ₂₅_-₃₅组和人端粒酶反转录酶组。每组设3个平行孔。3组细胞均以1.0×10⁵/孔的细胞浓度接种于96孔板中。Aβ₂₅_-₃₅组和人端粒酶反转录酶组细胞在培养144 h后，用Aβ₂₅_-₃₅5 μmol/L干预细胞，干预时间为24 h。人端粒酶反转录酶组在Aβ₂₅_-₃₅5 μmol/L干预72 h进行人端粒酶反转录酶基因转染。

重组腺病毒转染人胚胎神经元：

重组腺病毒的制备：pCI-Neo-hTERT质粒由中山大学生化教研室周俊宜教授惠赠。参考作者所在实验组既往研究^[24]，以pSU-CMV为腺病毒载体，将hTERT基因与其连接，将连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，得到pSU-CMV-hTERT质粒后，将其与人血清5型腺病毒骨架质粒共转染293细胞，通过病毒的同源重组，得到携带hTERT基因调控的非增殖型腺病毒(pSU-CMV-hTERT)。

最佳感染复数的确定：以带有报告基因绿色荧光蛋白的对照病毒为参照，观察最佳感染复数。细胞以1×10⁵/孔的细胞浓度接种96孔板。每孔培养液加至100 μL。对照病毒是表达报告基因绿色荧光蛋白的腺病毒，在转染几小时后就有绿色荧光蛋白的表达，72 h达到高峰。以对照病毒作为摸索最佳感染复数的参照，设立感染滴度梯度以确立最佳感染复数，分别以25，50，75，100倍细胞数目的病毒数来感染细胞，观察细胞生长状态，72 h后荧光显微镜下观察并计算转染率。

重组腺病毒转染神经元：转染时机选择在细胞培养 72 h后，将培养液吸出，用DMEM洗1遍，加入无血清，无双抗的DMEM培养液，分别加入病毒转染，96孔板每孔终体积100 μL，六孔板每孔1 000 μL，放回培养箱中培养，每隔15 min摇晃一次，1 h后将含病毒的培液吸出，重新加入完全无血清培养液，继续培养。实验组和对照组分别以含人端粒酶反转录酶目的基因腺病毒及表达绿色荧光蛋白的对照腺病毒感染神经元，最佳感染复数均为50。未转染组用DMEM培养液代替病毒液。

TUNEL法测定人神经元凋亡：将细胞培养板从培养箱中取出立即置于冰上，将细胞培养液吸出，预冷的PBS洗2遍，新制备的40 g/L多聚甲醛溶液(pH 7.4)冰上固定1 h。PBS洗3次，每次3-5 min，用阻断剂(体积分数3%H₂O₂甲醇溶液)室温孵育15-20 min，阻断内源性过氧化物酶。PBS洗3次，每次3-5 min。用通透液(0.1%Triton X-100的0.1%的柠檬酸钠)冰上孵育10 min。PBS洗3遍，每遍3-5 min，用滤纸洗干样品上多余的水分。滴加50 μL的TUNEL反应混合溶液(5 μL酶溶液和45 μL标记液组成)，在湿盒内 37 ℃避光孵育60 min。后PBS洗4遍，每遍3-5 min。加入PA转化液-辣根过氧化物酶标记的抗荧光素抗体盒内 37 ℃孵育30 min。PBS洗4遍，每遍3-5 min。滴加DAB显色液，室温孵育10 min。PBS充分漂洗，苏木精复染 3 min，蒸馏水充分漂洗后光学显微镜下观察结果。凋亡的细胞核呈棕色或棕黄色着色，细胞核固缩成一个或多个染色体团块，或形成凋亡小体，不规则大小不一致。而正常细胞的细胞核有苏木精复染成淡蓝色，相对较大，形态大小较为一致。在400倍显微镜下用对细胞凋亡染色切片进行凋亡细胞计数，计细胞核呈棕黄色的TUNEL阳性细胞数量和全部细胞数量，以两者百分比为凋亡指数。各组随机抽取15个不相重复的视野计算各视野的凋亡指数，并计算平均值，得到各组的凋亡指数。

主要观察指标：人端粒酶反转录酶基因转染后人胚胎神经元凋亡水平。

统计学分析：数据以x(_)±s表示，采用SPSS 17.0统计软件(美国SPSS公司)进行统计学分析，采用独立样本的t 检验。比较两组均数的不同，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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讨论

凋亡是真核细胞常见的死亡形式，它是多细胞有机体为维持自身稳态而进行的生理性自杀过程^[25-27]。当细胞发生凋亡时，在胞核和胞质结构上常出现特征性改变，如质膜的快速突起发泡，钙依赖性核酸内切酶激活引起的DNA断裂以及细胞核的解体及凋亡小体形成等^[28-29]。研究凋亡细胞的方法有很多，主要有电镜观察凋亡小体和一些特殊染色方法^[30-33]，如丫啶橙、Fenlgen、Hoechst等染色区分凋亡细胞与坏死。因为凋亡细胞DNA在核酸电泳时出现特征性“梯形结构”，因此核酸电泳是目前大多数实验室广泛采用检测细胞凋亡的方法。但是核酸电泳时的“梯形结构”很难作到定量检测，只有当凋亡细胞达到一定量后才可出现，因此有碍于培养细胞中凋亡细胞检测的临床实用性研究。流式细胞术可很方便地检测培养细胞中的凋亡细胞数，呈现亚二倍体核型峰的特征，但是不能对单个或低水平的凋亡细胞进行测定^[34-35]。TUNEL法是新近发展起来的一种新技术，其基本原理是TdT以非模板依赖方式催化DNA游离3’羟基末端核苷酸多聚化，再在相应的显色系统和合适的底物存在下产生颜色反应^[36]。其特点是在细胞凋亡的早期,即细胞体积尚未有可见的变化而DNA已经出现断裂时即可检出；不需特殊仪器，在普通光学显微镜下即可观察，简便易行，易于基层实验室使用。作者即利用TUNEL法在细胞水平来检测神经元的凋亡。

Aβ、自由基以及兴奋性氨基酸等均为凋亡诱导因子，bcl-2等基因的表达可起到抗凋亡的作用。Aβ可通过诱导凋亡相关基因，如Bcl-2，Bax，p53等改变及改变Caspase酶活性^[37]。促进自由基产生，干扰细胞离子平衡、改变线粒体膜电位并影响其功能、激活核转录因子等多种途径诱发凋亡；聚集的Aβ与APP等跨膜受体既在细胞表面亦在分泌途径相互作用、相互交联，导致信号转导通路的抑制或反常激活(如细胞内基质一酪氨酸磷酸化发生变化)，从而启动死亡程序^[38]。

研究表明，Aβ必须聚集成β片层折叠结构时，才能诱导细胞凋亡^[39]。Aβ从可溶性状态转换为纤维聚集状态时，与全长APP及神经元膜蛋白的结合明显增加，纤维状的Aβ毒性亦明显增强；相反，Aβ呈无定形状态时，不与APP结合，Aβ亦缺乏毒性。“老化”的Aβ呈聚集状态，其毒性增强，故实验采用“老化”状态的Aβ。

实验结果显示，在神经元生长的过程中有不同程度的凋亡，且总的凋亡率随培养时间的延长而升高。Aβ₂₅_-₃₅干预后细胞凋亡明显增多；而人端粒酶反转录酶能减少细胞的凋亡。说明人端粒酶反转录酶转染后，能对Aβ干预造成的神经元凋亡起到一定程度的保护作用。

综上，实验结果表明Aβ₂₅_-35干预可以引起神经元的凋亡；人端粒酶反转录酶可防止Aβ₂₅_-35诱导的人胚胎大脑皮质神经元的凋亡。这为进一步探索人端粒酶反转录酶对阿尔茨海默病的保护作用奠定基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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