芍药苷对白色念珠菌生物膜的作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.25.018

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (25): 4038-4042.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.25.018

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芍药苷对白色念珠菌生物膜的作用

王殿明¹，王健平¹，杨景云²，张慧明²，刘淑红³

1佳木斯大学附属口腔医院，黑龙江省佳木斯市　154003；2佳木斯大学基础医学院，黑龙江省佳木斯市 154007；3黑龙江省林业卫生学校，黑龙江省佳木斯市 154007

收稿日期:2014-04-07 出版日期:2014-06-18 发布日期:2014-06-18
通讯作者: 王健平，教授，主任医师，硕士生导师，佳木斯大学附属口腔医院，黑龙江省佳木斯市　154003
作者简介:王殿明，男，1984年生，在读硕士，主要从事口腔生态研究。

Paeoniflorin effects on Candida albicans biofilms

Wang Dian-ming¹, Wang Jian-ping¹, Yang Jing-yun², Zhang Hui-ming², Liu Shu-hong³

1The Affiliated Stomatological Hospital of Jiamusi University, Jiamusi 154003, Heilongjiang Province, China; 2School of Basic Medical Sciences, Jiamusi University, Jiamusi 154007, Heilongjiang Province, China; 3Heilongjiang Province Forestry Health School, Jiamusi 154007, Heilongjiang Province, China

Received:2014-04-07 Online:2014-06-18 Published:2014-06-18
Contact: Wang Jian-ping, Professor, Chief physician, Master’s supervisor, the Affiliated Stomatological Hospital of Jiamusi University, Jiamusi 154003, Heilongjiang Province, China
About author:Wang Dian-ming, Studying for master’s degree, the Affiliated Stomatological Hospital of Jiamusi University, Jiamusi 154003, Heilongjiang Province, China

摘要/Abstract

摘要：

背景：研究证实中药赤芍有效成分对白色念珠菌有较好的抑制作用，但其单体芍药苷对白色念珠菌生物膜是否有抑制作用未见报道。
目的：观察芍药苷对体外白色念珠菌生物膜的影响。
方法：用RPMI-1640分别按2倍稀释法制备5个浓度梯度(4，2，1，0.5，0.25 g/L)的芍药苷溶液。用RPMI-1640稀释洗必泰为5个浓度梯度(2%，1%，0.5%，0.25%，0.125%)。采用琼脂扩散法检测不同浓度梯度芍药苷或洗必泰对白色念珠菌的抑菌直径。MTT法检测不同浓度洗必泰或芍药苷对白色念珠菌细胞黏附的作用，以及对白色念珠菌生物膜的抑制作用，并且利用激光共聚焦扫描显微镜和死菌活菌荧光染色技术相结合方法观察常态及药物作用下的白色念珠菌生物膜。
结果与结论：洗必泰与芍药苷均有抑菌能力，抑菌环直径与药物浓度呈正相关；除2 g/L芍药苷组与1%，2%洗必泰组抑菌环直径无差异外，其余组间两两比较差异均有显著性意义。不同质量浓度芍药苷对白色念珠菌的细胞黏附都具有抑制作用，对白色念珠菌生物膜也具有抑制作用，且抑制率与药物质量浓度呈正相关。观察48 h时常态生物膜结构中大部分是活菌，有少量死菌存在；随芍药苷质量浓度改变白色念珠菌生物膜中死菌比例不断增高，其抑菌活性相对弱于洗必泰。表明芍药苷对体外白色念珠菌生物膜有较明显的抑制作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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关键词: 生物材料, 口腔生物材料, 芍药苷, 白色念珠菌, 生物膜, 激光共聚焦扫描显微镜

Abstract:

BACKGROUND: Studies have confirmed that the active ingredients of Paeonia lactiflora Pall. have better inhibitory effects on Candida albicans, but its monomer paeoniflorin has not been reported whether it can inhibit Candida albicans biofilm.
OBJECTIVE: To observe the effect of paeoniflorin on Candida albicans biofilm in vitro.
METHODS: Paeoniflorin solution at different concentrations of 4, 2, 1, 0.5, 0.25 g/L was prepared using RPMI-1640 according to 2-fold dilution method. Chlorhexidine was diluted with RPMI-1640 to different concentrations, including 2%, 1%, 0.5%, 0.25%, 0.125%. We compared the effects of different concentrations of chlorhexidine and paeoniflorin on diameter of Candida albicans by agar diffusion method. MTT assay was used to detect the effect of different concentrations of chlorhexidine or paeoniflorin on the cell adhesion of Candida albicans as well as their inhibitory effects on Candida albicans biofilms. Confocal laser scanning microscope and LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kits were combined to observe the changes of Candida albicans biofilms under normal or intervention conditions.
RESULTS AND CONCLUSION: Both chlorhexidine and paeoniflorin possessed bacteriostatic ability, and their bacteriostatic ring diameters were positively correlated with drug concentrations. Significant differences in the bacteriostatic ring diameter were observed between chlorhexidine and paeoniflorin, except between 2 g/L paeoniflorin and 1%, 2% chlorhexidine. Paeoniflorin at different concentration could inhibit cell adhesion of Candida albicans as well as inhibit Candida albicans biofilm. The inhibition rate was also positively correlated with
drug concentrations. Under normal conditions, most of bacteria in the biofilms were alive, and there was a small amount of dead bacteria after 48 hours. After intervention with paeoniflorin, the proportion of dead bacteria in the biofilms was increasing along with the concentrations of paeoniflorin. Compared with the chlorhexidine, paeoniflorin showed a lower bacteriostatic activity. These findings indicate that paeoniflorin has an obvious inhibitory action in Candida albicans biofilms in vitro.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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Key words: biocompatible materials, Candida albicans, biofilms, drugs, Chinese herbal

中图分类号:

R318

王殿明，王健平，杨景云，张慧明，刘淑红. 芍药苷对白色念珠菌生物膜的作用[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(25): 4038-4042.

Wang Dian-ming, Wang Jian-ping, Yang Jing-yun, Zhang Hui-ming, Liu Shu-hong. Paeoniflorin effects on Candida albicans biofilms[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(25): 4038-4042.

图/表（结果） 2

参考文献

引言

白色念珠菌是口腔的正常菌群之一，在正常情况下其与口腔中的其他正常微生物一起维持口腔中的生态平衡^[1-2]，当大量应用抗生素控制细菌繁殖时，对抗生素不敏感的白色念珠菌乘机大量生长，破坏口腔微生态系平衡，进而出现菌群失调，导致口腔白色念珠菌生物膜相关感染频繁出现，患者真菌感染发病率明显增高，各大医药厂商不断推出新的抗真菌药物，这样一来产生的不利影响是耐药性菌株不断地被筛选，耐药性菌株大量增加。由于唑类抗真菌药如氟康唑与伊曲康唑等临床效果较好，成为医生的首选药物，而广泛应用是耐药性菌株大量增加另一个重要原因。附着在根管内壁的生物膜被称之为根管生物膜，是根尖周炎的主要致病因素。有文献报道称白色念珠菌作为感染根管内真菌的主要组成部分，被认为是导致根管治疗失败的原因之一^[3-4]，以生物膜形式存在的微生物可降低抗菌药物的敏感性，甚至产生耐药性，这也是临床上与生物膜形成相关感染性疾病难以治疗的原因之一。近年来，随着广谱抗生素及免疫制剂广泛应用，耐药菌株逐年上升，真菌感染呈明显上升趋势，并伴随并发症的发生。传统中药具有作用持久，毒性小等特点，所以从天然药物中即中药中开发利用新的根管抗菌药物具有非常广阔的前景，因此从中药中寻找抗白色念珠菌生物膜的新药无疑是一个新的选择。以往研究报道中药赤芍有效成分对白色念珠菌有较好的抑制作用，但其单体芍药苷白色念珠菌生物膜是否有抑制作用未见报道。实验观察芍药苷对白色念珠菌生物膜的抑菌作用，探讨其在口腔生态失调中的意义，为芍药苷治疗白色念珠菌引起的难治性根管感染和根尖周炎提供新途径。

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材料方法

设计：对比观察实验。

材料：白色念珠菌ATCC90028，购自中国医学科学院微生物研究所；芍药苷(国药试剂产品编号SM212806)；醋酸洗必泰(锦州九泰制药有限公司)。

试剂：MTT DMSO PI FDA ( Sigma 公司)；YPD液体培养基(蛋白胨20 g/L)，(酵母提取物10 g/L)，(葡萄糖 20 g/L) 、沙堡琼脂培养基(蛋白胨10 g/L)，(葡萄糖40 g/L)、(琼脂20 g/L)、 RPMI-1640(GIBICO 公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)。

仪器：MultiskanMK3 全自动多功能酶标仪(Thermo Scientific，美国) ；激光共聚焦显微镜(U-TB190型日本Olympus 公司)。

试剂配制：①MTT溶液制备：用0.22 μm的滤器以pH 7.2的PBS配制5 g/L的MTT，过滤除菌分装后避光保存于 4 ℃冰箱中。②白色念珠菌菌液的制备：将冻存的标准白色念珠菌菌株进行复苏，并立刻接种到沙堡琼脂培养基上，37 ℃恒温培养箱中培养48 h。在无菌超净工作台上将单菌落接种在YPD液体培养基中，37 ℃恒温培养箱过夜培养12 h，将冻存的菌株解冻接种于沙氏培养，收集菌体后以pH 7.2的PBS冲洗3遍，血细胞计数板计数后，以RPMI-1640培养液稀释，将菌悬液浓度调整为1×10⁹L^-¹。标准菌悬液制备好之后立即应用到实验中。

实验方法：

实验分组：实验共分4组，实验组、洗必泰组、阴性对照组与空白对照组。实验组芍药苷经DMSO(<3%)助溶后，用RPMI-1640分别按2倍稀释法制备5个浓度梯度：4，2，1，0.5，0.25 g/L，观察芍药苷对白色念珠菌的抑制。洗必泰组将母液用RPMI-1640稀释成5个浓度梯度：2%，1%，0.5%，0.25%，0.125%^[5]，观察洗必泰对白色念珠菌的抑制。阴性对照组观察RPMI-1640对白色念珠菌的抑制^[5]。空白对照组仅加入RPMI-1640培养液^[5]，无白色念珠菌。

抑菌环检测芍药苷在沙堡琼脂培养基平皿上的抑菌能力：①加菌液：利用微量加样器将1×10⁹L^-1的标准菌液 100 μL分别加入沙堡琼脂培养基中。②菌液定植：用20 cm的无菌玻璃棒涂匀，37 ℃恒温培养箱培养1 h。③打孔封底：以1 mL规格的TIP头在沙堡琼脂培养基上打5孔，利用琼脂封底，室温等待琼脂凝固。④加药培养：用微量加样器取出不同梯度浓度药液各100 μL分别加入各小孔中，放入37 ℃恒温培养箱中培养24 h。⑤测量：不同浓度药物对白色念珠菌产生的抑菌环直径利用游标卡尺在深色背景下测量，为取平均值每孔测量3次。⑥结果计算：平行实验10组，取平均值，结果以x(_)±s表示。

芍药苷抗白色念珠菌黏附作用的测定：将100 μL 浓度为1×10⁹L^-¹的菌液加入96孔板，第1-10孔加入按2倍稀释浓度梯度的芍药苷各100 μL，第11，12 孔给予RPMI-1640 培养液100 μL，设第11孔为阴性对照孔，12 孔为空白对照孔，37 ℃分别培养60，90，120 min，弃去培养基及浮菌，用PBS 冲洗3 次，将20 μL 5 g/L MTT加入各孔，37 ℃避光孵育4 h，弃去含MTT的培养基，PBS洗涤3次，加入150 μL DMSO振荡15 min，使结晶充分溶解，全自动酶标仪A_{490 nm}波长检测吸度光值。每组设8个复孔，重复3次。

不同质量浓度芍药苷对48h白色念珠菌生物膜的作用：将100 μL浓度为1×10⁹L^-1的菌液接种于96孔细胞培养板中，37 ℃分别培养48 h，弃去培养基及浮菌，用PBS冲洗3次，实验组每孔加入100 μL梯度芍药苷溶液，设阴性对照孔、空白对照孔，MTT法测量各孔在490 nm波长处的A值。每组设8个复孔，重复3次取平均值。

抑菌率计算公式如下：抑菌率=(阴性对照孔A值-实验组A值) /(阴性对照孔A值-空白对照孔A值)×100%。

FDA/PI荧光染色方法及激光共聚焦扫描显微镜观察不同质量浓度芍药苷对48 h白色念珠菌生物膜的作用：将 100 μL浓度为1×10⁹L^-¹的菌液接种于24孔细胞培养板中，培养基1 500 μL，37 ℃培养48 h形成生物膜，去除孔内培养基，PBS冲洗浮游菌，加入500 μL芍药苷溶液或洗必泰，37 ℃培养48 h，弃去残液，PBS冲洗3次去除浮游菌，在暗箱中FDA-PI染料(体积配比为1∶1)染色孵育25 min，于激光共聚焦显微镜下观察，观察条件为Ai激光(514 nm/488 nm)，He Ne激光(543 nm)^[6]。在激光共聚焦显微镜下死菌被碘化丙啶(PI)染色呈红色，活菌被FDA染色呈绿色。实验分阴性对照组、洗必泰组、实验组，每组4个平行样，3次实验。

主要观察指标：不同质量浓度洗必泰或芍药苷对白色念珠菌细胞黏附的作用，以及对白色念珠菌生物膜的抑制作用。

统计学分析：全部数据采用SPSS 17.0统计软件处理。实验重复3次，计量资料用x(_)±s表示，各组及组间比较用方差分析检验，若数据不满足方差齐性则采用Tamhance t′检验。

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讨论

目前白念珠菌是最常见的导致念珠菌病的致病菌，约76%的临床病例都与其有关^[7]，白念珠菌属真菌界一半知菌亚门一芽抱菌纲一隐球酵母目一隐球酵母科一隐球酵母属，白念珠菌能形成生物膜，生物膜由不同形态的菌体共同构成，包括酵母相、假菌丝相和菌丝相细胞^[8-10]。三唑类康氟唑抗真菌药物是临床上治疗念珠菌感染的经常用到的主要药物之一，由于抗生素的大量生使用，结果导致越来越多白色念珠菌耐药菌株的出现，对这样耐药性菌株的抑制手段有限，由于唑类药物经大部分代谢通过肝脏进行，并且对肝脏有显而易见的损伤作用，所以局限了唑类药物在临床中的使用范围。目前临床应用的抗真菌药物在高效低毒、抗菌谱和耐药性方面不能令人满意，因此，从中草药中寻找抗真菌新药用于临床或与唑类药物联合应用，弥补唑类药物治疗中的不足，已成为非常重要的研究方向^[11]。实验所采用的芍药苷属于单萜糖苷类化合物，是中国传统中药赤芍的两个主要化学成分之一^[12]，赤芍对白色念珠菌表现出强抑制活性^[13]。

目前对生物膜进行形态学研究的方法主要是使用荧光显微镜、扫描电镜、激光共聚焦显微镜观察；扫描电镜的优点是能直接观测生物膜中细胞的情况，但是需要对标本进行脱水、固定、包埋、染色等处理，这样就破坏了生物膜的完整性，导致观察结果与实际有差异。而激光共聚焦显微镜能够弥补这一不足，观察的样本不需要经过脱水的步骤，同时应用荧光技术就能观察到完整的生物膜，它可以直接对完整自然水化状态的生物膜进行研究，并可以将一定厚度的生物膜进行连续断层扫描，获得单个细胞、一群细胞或局部组织不同层面的精细图像，可做到原位、动态观察，而不会破坏生物膜的结构，可得到生物膜的三维信息；因此实验使用激光共聚焦显微镜动态观察白色念珠菌生物膜中活菌细菌数量^[14]。

实验使用的MTT是四氮唑盐减低法测定真核细胞活性的重要工具；是一种黄颜色商品名为噻唑蓝化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐的染料，MTT在活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶作用下代谢还原，不溶于水的蓝色(或蓝紫色)甲臜在细胞色素 C 的作用下生成并沉积在细胞中，二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，在通常情况下，活细胞数与甲臜产生量呈正相关，酶标仪在 490 nm处可以测定甲臜的含量。因此活细胞的数目可根据吸光值推测出。MTT 法以其快速简便，不需要特殊检测仪器，无放射性同位素，适合大批量检测的特点而得到广泛应用。实验根据 Ramage等方法，在96孔培养板上形成根管内白色珠菌生物膜的体外模型，采用 MTT法测定芍药苷对白色念珠菌黏附在根管内形成白色念珠菌生物膜的作用。

实验为观察不同浓度梯度芍药苷对白色念珠菌的药物敏感性，选用的是琼脂扩散法，即比较药物作用后含药孔抑菌直径大小和比较药物孔抑菌直径之间的大小，来观测药物的敏感性。结果显示在抑菌直径方面，2 g/L芍药苷与2%洗必泰的抑菌结果差异无显著性意义，证明在抑制白色念珠菌作用方面，2 g/L芍药苷与2%洗必泰作用相似。MTT 法测定芍药苷对白色念珠菌黏附作用影响，以及芍药苷对48 h白色念珠菌生物膜吸光值值大小的结果，说明芍药苷对白色念珠菌生物膜具有较强抑制作用。对比与阴性对照组，随着芍药苷浓度的增加及时间的延长，白色念珠菌的黏附性降低，表明芍药苷对白色念珠菌在60，90，120 min的细胞黏附具有抑制作用。另外FDA/PI荧光染色方法及CLSM 观察不同浓度芍药苷对培养48 h白色念珠菌生物膜作用的观察显示，常态生物膜中由大部分活菌和有少量死菌组成，药物浓度与白色念珠菌生物膜中的死菌比例呈正相关；与洗必泰相比，芍药苷的抑菌能力相对较弱。

生物膜的感染越来越成为临床上难以克服的问题之一，实验结果说明应用芍药苷治疗根管内感染具有一定的潜力，尤其是由白色念珠菌生物膜引起的难治性或治疗失败的根管感染，可为临床开发抑制白色念珠菌生物膜的中药制剂提供一定的参考。实验只探究了中药赤芍中主要单体对白色念珠菌生物膜的抑菌作用，未来的研究还需进一步指向中药赤芍中其他单体是否对白色念珠菌生物膜有抑制作用，并探究其药理作用及抑菌机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程
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