软骨下钻孔联合软骨源性形态发生蛋白缓释系统修复膝关节软骨缺损

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.21.010

摘要/Abstract

摘要：

背景：有研究表明软骨源性形态发生蛋白等因子在诱导细胞分化、促进软骨修复过程中起到重要调节作用；软骨下钻孔治疗软骨缺损在临床已广为应用，但其与软骨源性形态发生蛋白等因子联合应用的相关研究至今少有报道。
目的：将软骨下钻孔技术与关节内注射透明质酸/软骨源性形态发生蛋白1缓释载药微球(hyaluronic acid- coated cartilage-derived morphogenetic protein-1，HA/CDMP-1)相结合，观察其对软骨缺损修复的效果，并通过与单纯钻孔组及HA/CDMP-1微球组治疗结果比较，观察两者有无协同效应。
方法：用透明质酸包被软骨源性形态发生蛋白制备缓释微球冻干保存，制备兔实验膝关节全层关节软骨缺损模型，随后将兔随机分为模型组、钻孔组、HA/CDMP-1微球组和钻孔联合HA/CDMP-1微球组，分别采用生理盐水关节腔注射，软骨缺损区钻孔，HA/CDMP-1微球关节腔注射，软骨下钻孔并HA/CDMP-1微球注射。
结果与结论：建模后8，12，16周，组织学观察结果提示，钻孔联合HA/CDMP-1微球组软骨缺损区修复组织覆盖面积明显高于其他3组(P < 0.05)；甲苯胺蓝染色和荧光定量PCR检测显示，钻孔联合HA/CDMP-1微球组修复的软骨组织中蛋白多糖和Ⅱ型胶原mRNA的表达明显高于其他3组(P < 0.01或P < 0.05)。结果证实，软骨下钻孔与关节腔内注射HA/CDMP-1联合应用修复兔膝关节软骨缺损近期疗效满意，提示两者可能发生协同作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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关键词: 生物材料, 软骨生物材料, 药物控释材料, 关节软骨, 软骨缺损, 软骨下钻孔, 软骨源性形态发生蛋白, 缓释微球

Abstract:

BACKGROUND: Cartilage-derived morphogenetic proteins have an important regulatory role in inducing cell differentiation and promoting cartilage repair. Subchondral drilling for treating cartilage defects in clinical practice has been widely used, but the related study on combined application of the cartilage-derived morphogenetic protein-1 (CDMP-1) and other factors is less.
OBJECTIVE: To combine the subchondral drilling technology with hyaluronic acid-coated CDMP-1 (HA/CDMP-1) microspheres for observation of their effects on the repair of cartilage defects, and meanwhile to compare the therapeutic effects among combination group, subchondral drilling group and HA/CDMP-1 group as well as to observe whether there is a synergistic effect.
METHODS: HA/CDMP-1 microspheres were prepared and cryopreserved. Full-thickness articular cartilage defect models were prepared in rabbits, and then the model rabbits were divided into model group (intra-articular injection of normal saline), subchondral drilling group (subchondral drilling), HA/CDMP-1 group (intra-articular injection of HA/CDMP-1), combination group (subchondral drilling+intra-articular injection of HA/CDMP-1).
RESULTS AND CONCLUSION: At 8, 12, 16 weeks after modeling, histological observations suggested that the coverage area of repair tissue was higher in the combination group than the other groups (P < 0.05). Toluidine blue staining and quantitative PCR showed that the mRNA expression of proteoglycan and type II collagen was also significantly higher than in the combination group than the other groups (P < 0.01 or P < 0.05). These findings indicate that the intra-articular injection of HA/CDMP-1 combined with subchondral drilling can promote the repair of articular cartilage damage effectively, suggesting a possible synergy between them.

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Key words: knee joint, cartilage, hyaluronic acid, bone morphogenetic proteins, rabbits

中图分类号:

R318

王浩，王伟. 软骨下钻孔联合软骨源性形态发生蛋白缓释系统修复膝关节软骨缺损[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(21): 3334-3340.

Wang Hao, Wang Wei. Repairing articular cartilage defects using subchondral drilling and cartilage-derived morphogenetic protein delivery system[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(21): 3334-3340.

图/表（结果） 5

2.1 实验动物数量分析 各组兔建模后无死亡，切口愈合良好，关节活动范围达到正常，最终48只兔均进入结果分析。

2.2 HA/CDMP-1缓释微球外观特性及体外缓释曲线变化 HA/CDMP-1缓释微球粒径大小分布均匀、形态规则，见图2A，B。大部分分布在1-10 μm范围之内，微球平均粒径为(4.50±0.06) μm。体外释放实验见药物释放速度于初期较快，其后速度逐渐平稳，给药7 d时释放可达到40%。根据图表绘制出释放曲线，见图2C。

2.3 兔及关节软骨一般形态 建模后第8周各组均可见软骨区有厚度不同的白色修复组织生成。模型组修复组织不平整，无光泽，无明显弹性，与正常软骨组织结合差。对照组钻孔组和HA/CDMP-1微球组大致相似：修复组织较平整，白色有弹性，部分有光泽，与邻近正常软骨界线模糊。钻孔联合HA/CDMP-1微球组修复组织平整，有光泽，缺损区已全部充填，弹性接近正常软骨，与临近正常软骨结合区无明显界线，见图3。建模后12周及16周各组大体观察结果与建模后第8周比无明显变化。

2.4 软骨下钻孔联合软骨源性形态发生蛋白缓释系统膝关节腔注射后兔修复软骨组织修复情况 建模后8，12，16周，一般形态观察、组织学观察、光镜检查及透射电镜观察结果显示，钻孔联合HA/CDMP-1微球组软骨缺损区修复组织覆盖面积、蛋白多糖及Ⅱ型胶原mRNA的表达明显高于其他3组(P < 0.01或P < 0.05)，见表1。

2.5 软骨下钻孔联合软骨源性形态发生蛋白缓释系统膝关节腔注射后兔修复软骨组织学变化 建模后第8周，模型组，苏木精-伊红染色可见有较多纤维母细胞增殖，为无序的纤维组织，甲苯胺蓝基质染色未见明显阳性着色。

钻孔组：苏木精-伊红染色可见有较多类透明软骨，同时混杂有部分梭形的纤维细胞，部分软骨细胞形成陷窝样结构，有较多的椭圆形的类软骨细胞，甲苯胺蓝基质染色颜色较钻孔联合HA/CDMP-1微球组淡。

HA/CDMP-1微球组：苏木精-伊红染色可见有较多同源细胞，类似透明软骨形态和排列，但细胞较为分散，有少许小梭形，细胞核深染的纤维细胞，甲苯胺蓝基质染色颜色较钻孔联合HA/CDMP-1微球组淡。

钻孔联合HA/CDMP-1微球组：软骨细胞大量增生，位于软骨陷窝中，软骨陷窝明显可见，细胞排列较规则，与正常软骨细胞间难以区分，甲苯胺蓝基质染色明显，见图4。建模后第12、16周各组组织学观察与第8周结果大致相仿。

2.6 软骨下钻孔联合软骨源性形态发生蛋白缓释系统膝关节腔注射后兔修复软骨组织超微结构变化 建模后16 周，钻孔联合HA/CDMP-1微球组可见软骨细胞核清晰可见，胞质内细胞器丰富，软骨细胞表面有褶皱状小突起。

胶原纤维排列比较规整。钻孔组和HA/CDMP-1微球组可见细胞核略大，内质网、线粒体等细胞器肿胀，软骨细胞表面亦可见褶皱状小突起，细胞周围基质排列欠规整。模型组细胞见细胞核溶解，细胞器呈空泡状，周围胶原纤维排列杂乱、稀少，见图5。

2.7 生物相容性及不良反应分析 部分兔软骨组织标本可见膝关节局部骨赘形成，分析与造模建模后关节稳定性改变、使用软骨下钻孔术及软骨源性形态发生蛋白均有一定相关。

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引言

软骨细胞不具有自身修复能力，软骨损伤始终是威胁人类健康的一个难题。近两个世纪以来，随着科技水平的飞速发展，越来越多的研究领域取得了突破性的进展。而且这些研究成果正在不断的进入临床，转化为新的生产力。但目前，实验研究和临床治疗方法仍很局限，效果并不十分理想，还没有被大家认可的非常确切的治疗软骨损伤的方法，而且关于因子和载体的研究还没有充分转化为临床成果。
软骨本身无血管，其营养来源于滑液。软骨细胞因存在的部位不同，其形态亦不相同，由软骨表面至深层逐渐增大。软骨细胞埋在软骨间质内，它存在的部位为一小腔，称为软骨陷窝。软骨中央部分的软骨细胞多为2-8个成群存在，他们都是由一个软骨细胞分裂而来，故称为同源细胞群。软骨基质呈半固态，其主要化学成分为软骨黏蛋白和水。软骨黏蛋白是由酸性糖胺多糖和蛋白质构成，也是由透明质酸作为主干，结合上许多蛋白多糖，其轴心蛋白质上结合较多的硫酸软骨素侧链和短小的硫酸角质素，为嗜碱性而被染成蓝色，亦称异染性。在软骨囊处硫酸软骨素更多，呈强嗜碱性，染色深。关节软骨的理化特性决定了其一旦损伤则难以自身修复。
软骨下钻孔技术作为一种最为简单、有效的治疗关节软骨的方式目前已经得到公认^[1] ，其具有操作简单、微创、并发症少、风险小等特点^[2-3] ，它是通过在缺损部位的软骨下骨上钻出许多微骨折孔，骨髓腔流出的血液可以在软骨缺损表面形成一层纤维素凝块，同时未分化细胞可以从骨髓腔中进入到软骨缺损区，这些细胞聚集于纤维素凝块内，逐渐增生分化成纤维软骨细胞，然后产生纤维软骨。该方法的重点在于切除钙化的软骨比软骨下钻孔更重要。
目前研究得知关节内有多种细胞因子，它们在关节的损伤修复过程中发挥着重要调节作用，可以促进软骨细胞的增生、分化。软骨源性形态发生蛋白1(cartilage derived morphogenetic protein 1，CDMP-1)就是其中之一^[4] 。CDMP-1又称生长分化因子5、脂多糖相关蛋白受体14，是转化生长因子β超家族-骨形态发生蛋白家族中的较新成员。现通过研究发现其作用主要集中于以下方面：基因结构、蛋白分子、组织分布、信号传导途径、在骨软骨及关节生成过程中的作用及与疾病的关系。研究表明在人类胚胎期CDMP-1可促进间充质干细胞聚集于四肢软骨发生处，以诱导软骨细胞分化，并对关节形成的部位起重要的决定作用，它对诱导间充质细胞分化为软骨细胞有较强的促进作用。然而，由于细胞因子半衰期短、价格昂贵，因此制备其载药缓释系统对延长药物作用时间、提高药物疗效有重要意义。
实验通过向软骨缺损区域行软骨下钻孔使骨髓腔的血液等渗透到缺损区，并形成纤维素血凝块，模拟构建缺损区载体植入；同时髓腔内间充质干细胞亦可以通过钻孔到达并浓聚于缺损区纤维素血凝块内；并通过外源性注入CDMP-1缓释微球等因子来诱导分化间充质干细胞更好地向软骨细胞转化；力图达到在缺损区域内构建组织工程化软骨修复体系。

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材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2011年5月至2013年5月在辽宁医学院解剖学与组织胚胎学实验室完成。

材料：

实验动物：健康4月龄新西兰白兔48只，体质量 (2 500±100) g，由辽宁医学院动物实验中心提供，许可证号：SCXK(辽)2009-0004。

试剂及仪器：软骨源性形态发生蛋白1(CDMP-1)，透明质酸(hyaluronic acid，HA)来自上海生工生物工程公司，RT-PCR引物由上海皓嘉科技发展有限公司合成。

实验方法：

HA/CDMP-1微球的制备：采用李成等^[5]超声乳化法制备空白HA缓释微球。光镜及扫描电镜下观察微球的形态、粒径及分布等；将含有CDMP-1的溶液滴到空白微球上，待完全膨胀后即形成HA/CDMP-1微球。对微球行体外释放试验，对不同释放时间的微球离心后行吸光度值测定，推算出各组样本中CDMP-1含量，绘出释药曲线。

分组及双侧膝关节软骨缺损兔模型建立：将48只兔查随机数字表进行随机编号分为4组，分别为模型组、钻孔组、HA/CDMP-1微球组及钻孔联合HA/CDMP-1微球组，每组12只。所有实验动物均采用葛志强等^[6]方法建立兔双侧膝关节软骨缺损模型：无菌操作下，解剖兔膝关节，于股骨滑车部用利刀片作6 mm×8 mm全层软骨缺损，深度以软骨下骨外露、创面点状出血为度。模型组于建模后1，4周兔关节腔内注射1 mL生理盐水对照；钻孔组、钻孔联合HA/CDMP-1微球组家兔均于造模后当时行软骨下钻孔；HA/CDMP-1微球组、钻孔联合HA/CDMP-1微球组分别于建模后第1周和第4周以1 mL注射器从外侧入路进针，由膝关节间隙，进入膝关节腔，2次于关节腔内注射1 mL含 CDMP-1微球溶液。分别于建模后第8，12，16周分批处死动物各4只取材，见图1。

兔软骨组织学观察：建模后8，12，16周处死动物。切取大体观察后的股骨下端缺损处修复组织标本，常规切片，每个标本贴片2张：一张进行常规苏木精-伊红染色，在400倍光镜下观察新生修复组织性质、表面特性、与正常软骨连接等组织学特征；一张进行甲苯胺蓝染色，行图像数字分析，检测蛋白多糖的相对含量^[7]。

兔修复软骨组织中蛋白多糖含量测定：甲苯胺蓝对软骨基质中的蛋白多糖有异染特性，组织化学染色后，在400倍光镜下对所染切片随机选取3个视野进行图像数字分析仪分析，得出吸光度值，取其均值表示蛋白多糖的相对含量。

荧光定量PCR检测兔修复软骨组织中Ⅱ型胶原mRNA的表达：修复组织中RNA的提取按Trizol法说明书进行操作。每个样品中取总RNA悬液2 μL，加入体积分数0.1% DEPC水稀释到50 μL，在核酸蛋白分析仪上用空白体积分数0.1% DEPC水作为对照，测定紫外线波长260 nm与280 nm处的吸光度值，确定总RNA的浓度和纯度。依据A_{260 nm}/A_{280 nm}的比值来反映RNA纯度，比值在1.8-2.0时纯度高。

反转录反应体系：5×M-MLV Buffer 4.0 μL，M-MLV (200 U/μL) 1.0 μL，DTT 1.0 μL，Oligo dT Primer (2.5 μmol/L) 1.0 μL，RNase Inhibitor (40 U/μL) 0.5 μL，DNTP Mixture (10 μmol/L) 1.0 μL，Sampie mRNA 3.0 μL，0.1%DEPC水8.5 μL，总体积20 μL。反转录反应条件： 42 ℃下反转录30 min，形成cDNA，95 ℃灭活反转录酶 5 min，迅速降至4 ℃，冻存于-20 ℃备用。引物的设计与合成：软骨Ⅱ型胶原mRNA基因及内参照GAPDH的引物序列采用Primer Premier 5.0软件进行设计(基因通过Genbank查找获得编码序列为S83370)，并由上海皓嘉科技公司合成，其序列如下:

荧光定量PCR法检测Ⅱ型胶原 mRNA表达：选择非特异性SYBR Green I荧光染料进行定量反应，双链DNA的数量与其发出的荧光信号强度相关，PCR体系中双链DNA数量可以根据荧光信号检测得出。

荧光定量PCR反应体系：cDNA 2.0 μL，2×PCR Master MIX 12.5 μL，5×SYBR Green染料1.0 μL，上游引物(10 μmol/L) 0.5 μL，下游引物(10 μmol/L) 0.5 μL，ddH₂O 8.5 μL，总体积25 μL。

荧光定量PCR扩增反应条件：每个管设3个复孔，冰上避光操作。1 min 94 ℃预变性，30 s 94 ℃变性，30 s 60 ℃退火，72 ℃延伸45 s，上述步骤循环35次。随后 94 ℃变性1 min；在60-95 ℃区间内行熔解实验，即缓慢升温，每个温度1次循环，每循环30 s，共35个循坏。荧光定量PCR结果分析：每个样本重复3次，取平均循环阈值(Cycle threshold，Ct)。然后通过2^-^△△Ct法计算出各组样本Ⅱ型胶原mRNA相对表达量^[8]，其中△Ct=Ct目的基因-Ct内参基因。

透射电镜观察：将软骨标本用超薄切片机做70 nm超薄切片。采用孟丽等^[9]透射电镜染色方法染色。透射电镜下观察软骨细胞表面结构形态变化及其周围胶原纤维变化并拍片。

主要观察指标：各组兔修复组织覆盖缺损的面积、蛋白多糖及Ⅱ型胶原mRNA表达量。

统计学分析：计量资料以x(_)±s表示，用SPSS 16.0统计学软件进行数据分析，结果资料满足正态分布、方差齐性时用单因素方差分析，不满足方差分析条件时组间用Mann- Whitney U非参数检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

实验通过向软骨缺损区域行软骨下钻孔使骨髓腔的血液等渗透到缺损区，并形成纤维素血凝块，模拟构建缺损区载体植入；同时髓腔内间充质干细胞亦可以通过钻孔到达并浓聚于缺损区纤维素血凝块内；并通过外源性注入CDMP-1缓释微球等因子来诱导分化间充质干细胞更好地向软骨细胞转化；力图达到在缺损区域内构建组织工程化软骨修复体系。
3.1 软骨下钻孔 相关研究表明：通过钻孔软骨缺损区可以被含有骨髓间充质干细胞的纤维素凝块所填充，继而刺激未分化的骨髓间充质干细胞迁移至血凝块中，在局部微环境的作用下诱导其增殖并分化为成软骨细胞，从而形成软骨组织^[10] ，以修复该缺损区域。有学者研究发现，兔膝软骨缺损经钻孔建模后修复良好，组织学观察亦显示修复结果满意，而模型组的缺损则未得到良好修复。通过大量临床研究也证实了软骨下钻孔对关节软骨损伤修复的有效性。付昌马等^[11]应用直径较小的克氏针钻孔，并配合关节内注射玻璃酸钠治疗40例关节软骨损伤，建模后优良率达87.5%；林松等^[12]应用微骨折治疗关节软骨缺损总有效率达85.7%。本次实验发现，钻孔后可见修复区有较多的椭圆形的类软骨细胞,软骨细胞形成陷窝样结构，大体及组织学观察结果满意，统计学分析后有显著性意义，提示钻孔术对关节软骨缺损的行之有效。
软骨下钻孔优点较多，因其操作简单易学、微创、风险较小、并发症少，深受关节外科医生及软骨修复研究方面学者的重视，但关于软骨缺损后如何钻孔，钻孔直径及深度以多少为宜，单位面积内最佳钻孔数量是多少等问题目前尚未有统一的报道。目前部分学者通过实验研究主张以小直径、多点钻孔为主，可达到更好的修复结果。本次研究结果也证实了该软骨下钻孔的可行性及有效性。
3.2 软骨源性形态发生蛋白缓释系统在软骨损伤修复中的应用 生长因子能调节细胞的各类活动与功能，多种生长因子参与并调节软骨的生长过程，对软骨损伤的修复起积极促进作用。近来生长因子的作用日益得到重视，CDMP-1是骨形态发生蛋白中的新亚型^[13]，又被称为骨形态发生蛋白14，生长分化因子5。CDMP-1可调节组织细胞的生长、分化，具有维持细胞表型和促进细胞凋亡的作用，对软骨细胞的分化起特异性调节作用:①促进基质干细胞聚集。②诱导基质干细胞向软骨细胞分化。③维持成熟的关节软骨细胞表型稳定。④确定指(趾)骨正确的分节段模式。CDMP-1具有调节间质干细胞向软骨细胞分化功能，与软骨发生和发育密切相关^[14-18] 。
相关研究证实CDMP-1在人胚主要分布在软骨雏基和正在发育的软骨核中，这些部位就是将来关节形成的部位。在成人关节软骨中CDMP-1也有表达。其在胚胎中的分布特点提示其可能与四肢关节软骨形成有密切关联，而在成人关节软骨的分布则可能与维持软骨细胞表型有关。CDMP-1有诱导软骨形成的能力^[19] ，且诱导的特异性较强。穆长征等^[20]研究显示转染软骨源形态发生蛋白基因的骨髓间充质干细胞能够促进和提高关节软骨的改建和修复。
生长因子在体内的半衰期很短，直接应用时作用有限，因此制备缓释载药系统以延长药物在损伤局部的作用时间、维持有效药物浓度对骨关节炎治疗有重要意义。微球制剂是将药物与合适的载体通过微囊化技术制得微球，其具有能及时释放药物、维持有效血药浓度、减少给药次数、疗效持久和安全等优点^[21] 。HA是一种广泛分布于自然界的天然酸性黏多糖^[22-23] ，具有良好的组织相容性。HA以其独特的理化性质和分子结构在机体内显示出多种重要的生理功能。如润滑关节，调节蛋白质、促进创伤愈合、水电解质扩散及转运等。目前，HA治疗骨关节炎目前已被广泛应用于临床，张丽娜等[24]研究提示HA能够降低关节滑液中的肿瘤坏死因子α的含量，从而减轻滑膜炎症，降低炎症递质对软骨的破坏,加速软骨的合成代谢，有利于软骨的修复。
3.3 实验动物的选择与模型的建立 选择动物实验模型应本着相似性、可靠性、适用性、可控性、易行性和经济性等原则。膝关节因位置表浅，易于操作，且关节软骨损伤最常见于此，故以往相关方面研究的学者多选用膝关节作为研究对象^[25-27] 。实验通过于兔膝关节关节面造6 mm× 8 mm全层缺损来制作兔关节软骨缺损模型^[28] ，钻孔组修复满意，模型组则未被修复。关节软骨缺损的修复与软骨缺损深度有密切相关，由于缺损部修复组织无法附着到部分厚度的软骨缺损处，只能附着于软骨下骨上，因而过去的研究多选用全层厚度关节软骨缺损模型^[29-30] 。
综上所述，联合应用软骨下钻孔技术与HA/CDMP-1缓释微球关节腔注射是一种能促进创伤性关节软骨缺损软骨面生物学再生修复的很好方法。实验中联合组关节软骨缺损区修复组织以透明软骨为主，其他各对照组中软骨缺损区的修复组织多为类透明软骨及纤维软骨，表明联合组在修复过程中发生了明显的协同作用。实验通过利用软骨下钻孔术将松质骨的骨髓间充质干细胞引入软骨缺损区；并通过应用CDMP-1其调节间质前体细胞的分化功能，促进间质干细胞向更好软骨细胞分化，最终修复关节面的软骨缺损，达到增强软骨下钻孔修复软骨缺损的效果。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程
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