脐带间充质干细胞移植治疗大鼠糖尿病

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.19.023

摘要/Abstract

摘要：

背景：脐血间充质干细胞具有很强的增殖能力和分化能力，在趋向分化作用下可以分化成胰岛β细胞，进而起到治疗糖尿病的作用。
目的：观察移植脐带间充质干细胞对大鼠糖尿病的治疗效果。
方法：30只雄性SD大鼠中随机取6只作为对照组，注射生理盐水；其中24只按45 mg/kg的剂量注射链脲霉素建立糖尿病模型后，随机等分为移植组和糖尿病组，移植组大鼠尾静脉注射移植脐带间充质干细胞。
结果与结论：造模后30 d，糖尿病组大鼠空腹血糖维持在较高水平，且高于对照组(P < 0.05)。造模后，与糖尿病组相比，移植组大鼠空腹血糖水平显著下降(P < 0.05)，体质量显著增加(P < 0.01)，45 d时移植组大鼠空腹血糖水平与体质量接近对照组水平(P > 0.05)，而糖尿病组大鼠空腹血糖维持较高水平，且体质量持续下降。提示脐带间充质干细胞移植能有效治疗大鼠糖尿病。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 移植, 脐带间充质干细胞, 糖尿病, 干细胞移植, 空腹血糖, 胰岛细胞, 体质量

Abstract:

BACKGROUND: Umbilical cord mesenchymal stem cells have strong proliferation and differentiation capacities, and can be induced to differentiate into pancreatic β cells, thereby playing a therapeutic effect on diabetes mellitus.
OBJECTIVE: To study the therapeutic effects of transplantation of umbilical cord mesenchymal stem cells for treatment of diabetes mellitus in rats.
METHODS: Thirty male Sprague-Dawley rats were randomly divided into control group (n=6), transplantation group (n=12) and diabetic group (n=12). Rats in the control group were given normal saline injection. Rats in the other two groups were injected with streptozotocin at a dose of 45 mg/kg to establish diabetic models. After modeling, transplantation of umbilical cord mesenchymal stem cells via tail vein was given in the transplantation group.
RESULTS AND CONCLUSION: Thirty days after modeling, the fasting blood glucose was maintained at a higher level in comparison with the control group (P < 0.05). However, compared with the diabetic group, the level of fasting blood glucose was significantly reduced (P < 0.05) and the body mass was increased in the transplantation group (P < 0.05). After 45 days, the fasting blood glucose level and body mass in the transplantation group had no significant difference from those in the control group (P > 0.05), but in the diabetic group, the fasting blood glucose level was still higher and the body mass continued to decrease. These findings indicate that the transplantation of umbilical cord mesenchymal stem cells can be effective in the treatment of diabetes mellitus in rats.

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Key words: umbilical cord, cord blood stem cell transplantation, diabetes mellitus, diabetes mellitus, experimental, blood glucose

中图分类号:

R394.2

李丽，赵博 . 脐带间充质干细胞移植治疗大鼠糖尿病[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(19): 3094-3099.

Li Li, Zhao Bo. Umbilical cord mesenchymal stem cell transplantation for the treatment of diabetes mellitus in rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(19): 3094-3099.

图/表（结果） 3

2.1 培养的脐带间充质干细胞形态 培养四五天后，贴壁的细胞明显增多，细胞呈长梭形或多角形，并出现有丝分裂，部分细胞克隆呈集落状生长，形态呈单一的长梭形，胞体中央膨大，培养八九天，细胞铺满培养瓶底面，成漩涡状生长，漩涡中心的细胞为复层生长，周围大部分细胞胞体呈单层的漩涡状或辐射状(图1)。流式细胞仪检测结果显示CD29，CD49，CD90，CD105和HLA-1阳性，脐带间充质干细胞均一性好，纯度达96%以上。

2.2 脐带间充质干细胞免疫表型的鉴定 贴壁细胞均高表达脐带间充质干细胞表型CD29，CD49，CD90，CD105和HLA-1，不表达或低表达造血细胞表型CD34，CD45，低表达内皮细胞表型CD31(图2)。

2.3 实验动物数量分析 进入结果分析的实验动物30只，实验过程中无动物脱落或死亡，本实验24只大鼠模型造模均成功。

2.4 脐带间充质干细胞移植对糖尿病大鼠空腹血糖水平的影响 大鼠注射链脲霉素24 h后，与对照组相比，模型组大鼠空腹血糖明显增加(P < 0.05)，且高于正常值 (6.7 mmol/L)；给药后30 d，大鼠空腹血糖仍维持在较高水平，且高于对照组(P < 0.05，表1)。

糖尿病大鼠移植间充质干细胞后空腹血糖逐渐下降，15 d时空腹血糖水平明显低于糖尿病组(P < 0.05)；移植 45 d后移植组大鼠空腹血糖水平降至正常值，与对照组接近(P > 0.05)。而糖尿病组大鼠空腹血糖维持较高水平，无明显变化(表2)。

2.5 脐带间充质干细胞移植对糖尿病大鼠体质量的影响 脐带间充质干细胞移植后，大鼠体质量逐渐增加，15 d时大鼠体质量明显高于糖尿病组(P < 0.01)，45 d时大鼠体质量与对照组接近(P > 0.05)，而与对照组相比，糖尿病组大鼠体质量下降(表3)。

2.6 脐带间充质干细胞移植对糖尿病大鼠空腹胰岛素水平及胰岛素抵抗指数的影响 与对照组相比，糖尿病组大鼠空腹胰岛素水平和胰岛素抵抗指数明显增加(P < 0.05)，而脐带间充质干细胞移植的大鼠空腹胰岛素水平和胰岛素抵抗指数显著下降(P < 0.05，表4)。

2.7 糖尿病大鼠胰岛组织脐带间充质干细胞存活的情况 荧光显微镜观察发现对照组和糖尿病组大鼠胰岛组织中不存在CM-Dil阳性细胞，而移植组大鼠胰岛组织中CM-Dil阳性细胞数量为(52.34±7.56)个/高倍视野(图3)。

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引言

脐带间充质干细胞是指留存在新生儿脐带中的一种干细胞，可分化为多种细胞，是临床骨、肌肉、神经、肝、内皮和心肌等组织工程的重要原料，医学界对该干细胞的研究和应用越来越广阔^[1-2]。目前较为成熟的研究成果显示，在脐血中含有大量未成熟的造血干细胞，脐血干细胞的移植，具有对白血病、再生障碍性贫血等恶性血液病较好的疗效。脐血干细胞与骨髓干细胞移植相比较，排斥反应较小，医疗费用亦较低，且没有因寻找适合骨髓的等待而拖延治疗时间。除此之外，脐血干细胞移植作为辅助治疗恶性肿瘤的疗法，可以明显降低化疗所引起的不良反应。20世纪90年代中国开始对脐血进行研究。天津和北京的首个脐血，均被保存在零下196 ℃的液氮深低温罐中，从理论上讲，可以终生保存和受益^[3-6]。脐带间充质干细胞来源于患者自体移植，通过体外培养后可有效维持脐带间充质干细胞活性和分化潜能^[7-9]。干细胞移植是目前最为先进的和行之有效的治疗手段，将具有某种特定功能的细胞移植到体内相应的受损部位，不仅可以恢复部分功能，而且避免了传统药物治疗引起的毒副作用^[10-14]。大量研究显示脐血间充质干细胞具有很强的增殖能力和分化能力，在趋向分化作用下可以分化成胰岛β细胞，进而起到治疗糖尿病的作用^[15-18]。糖尿病时胰岛β细胞遭到大量破坏，致使胰岛素分泌严重缺乏而引起的一系列代谢性疾病，可有高血糖、酮症酸中毒等出现，并由此诱发各种临床表现及各系统并发症。随着科学技术的发展和对糖尿病的进一步深入研究，糖尿病的治疗方法经历了从传统的口服降糖药、胰岛素，到糖尿病新指南明确的胃转流，再到日渐成熟的干细胞移植等的发展，也为患者提供了多种治疗糖尿病的方法及多样的选择机会^[19-21]。脐血干细胞作为一种新技术治疗糖尿病，对降低血糖，改善临床症状及并发症有较好的疗效，已经在临床中大量开展，并取得较好的成绩^[22-24]。目前，医学界对脐带间充质干细胞应用于糖尿病治疗工作尚处于探索阶段，有不少问题仍待解决，如究竟是间充质干细胞中哪一种单核细胞表达这些胰腺相关分子尚不明确，还需进一步证实，但单核细胞中肯定有一部分是间充质干细胞。作者选取大鼠脐带间充质干细胞治疗糖尿病。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2011年4月至2012年11月在天津医科大学代谢病医院中心实验室完成。

材料：

动物：选取清洁级SD雄性大鼠30只，鼠龄1.5-2个月，体质量200-220 g，购自南京市江宁区青山养殖基地，动物许可证号：SCXK(苏)2009-0002。大鼠饲养环境应满足如下要求：温度在18-26 ℃，相对湿度40%-70%。噪音85 dB以下，氨浓度20 ppm以下，通风换气8-12次/h。实验中对动物处置方法符合动物伦理学要求。

组织：新生胎儿脐带组织，脐带经知情同意情况下，由天津市中心妇产医院获得，符合伦理学要求。

方法：

脐带间充质干细胞的培养：将新生胎儿脐带组织剪成1.0-2.0 mm³碎片，选用0.125%胰蛋白酶联合0.15%胶原酶Ⅱ于37 ℃静置消化1 h后，选用150 μm细胞筛过滤，去除杂质。将过滤细胞通过DMEM/F12培养液洗涤2次，2 500 r/min离心20 min，去除上清液杂质。将细胞重悬于完全培养液，接种培养，当细胞生长至75%-85%融合时，选用0.125%的胰酶消化传代备用。取第3代细胞，胰蛋白酶消化后加人PE FITC标记的CD73，CD105，HLA-DR，CD31，VWF，KDR，CD34，CD45，CD235a流式抗体及相应对照标记，流式细胞仪检测。

脐带间充质干细胞的CM-Dil标记：吸取CM-Dil液5 µL至1.5 mL的EP管中，加入1 mL完全培养液，吹打均匀，即得CM-Dil标记液。取贴壁达90%融合的细胞，吸弃培养液，PBS洗3次，加入上述标记液40 µL/cm²，于37 ℃、体积分数5%CO₂、饱和湿度恒温培养箱中孵育20 min，吸弃标记液，加入37 ℃完全培养液5 mL后，孵育10 min后吸弃，继续加入培养液重复清洗3次。培养24 h后在倒置相差显微镜下观察CM-Dil标记效果和细胞形态变化。随机选取6个视野，计数CM-Dil阳性细胞数及细胞总数，计算标记率。标记率=视野内阳性细胞总数/视野内细胞总数×100%。

实验动物分组及糖尿病模型的建立：30只大鼠中取6只作为对照组，其余24只建立糖尿病模型。造模成功后，大鼠随机等分为移植组和糖尿病组，移植组大鼠移植脐带间充质干细胞。

造模方法如下：选用0.1 mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液将2 mL链脲菌素稀释成2%注射液，大鼠空腹12 h后腹腔注射45 mg/kg，于注射前后断尾采血，检测造模结果。造模后，检测大鼠血糖值，当空腹血糖值大于6.7 mmol/L时，可判断为糖尿病模型造模成功^[25-27]。

脐带间充质干细胞移植方法：造模成功后立即给予移植组大鼠用1 mL注射器通过尾静脉分别注入1 mL间充质干细胞(1.5×10¹⁰ L^-¹)，测量大鼠移植前后血糖浓度，移植后每周定时测量大鼠空腹血糖及其体质量。

大鼠胰岛组织观察：各组在造模后2周随机各取6只大鼠麻醉处死，取材行胰岛组织学检查以证实恢复程度。取损伤处组织，40 g/L多聚甲醛固定，行常规冰冻切片，切片后荧光显微镜观察。每张切片在高倍镜(×200)下任取8个视野，计算每个视野中的CM-Dil阳性细胞数，取其均值作为各组的CM-Dil阳性细胞数。

大鼠空腹血糖、血清胰岛素和胰岛素抵抗指数的测量：造模24 h，造模后3，10，20，30 d后，检测对照组、移植组和糖尿病组大鼠空腹血糖水平，各组血清胰岛素用放免法测定^[28]，严格按试剂盒说明书进行。胰岛素抵抗指数=空腹血糖×空腹胰岛素水平/22.5。

主要观察指标：大鼠血清胰岛素、血糖及体质量的变化。

统计学分析：将所得数据经SPSS 17.0(美国SPSS公司)进行统计学分析，计量资料以x(_)±s表示，两组间采用t 检验；P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

糖尿病是临床较为常见的一种高血糖性代谢疾病，患者多因胰岛素分泌缺陷或胰岛素生物作用损伤而引发^[29-30]。糖尿病是引发其他组织器官慢性损伤、功能障碍的主要病因之一，尤其表述为心、脑、肾等器官^[31-35]。目前，较为常用的治疗方法有：饮食治疗、药物治疗、生活习惯和运动治疗。药物治疗主要有磺脲类药物、双胍类降糖药、α葡萄糖苷酶抑制剂、胰岛素增敏剂等^[36-38]。但是医学界尚无法根治糖尿病，这些治疗方法只能一定程度上改善患者血糖水平，减慢病情发展，寻找新的糖尿病治疗方法势在必行，干细胞移植是目前最为先进的和行之有效的治疗手段，将具有某种特定功能的细胞移植到体内相应的受损部位，不仅可以恢复部分功能，而且避免了传统药物治疗引起的毒副作用。

随着干细胞移植技术的不断发展，医学界开始探究干细胞移植治疗糖尿病的可能性^[39-41]。脐带间充质干细胞是以人脐带血清为主体培养出的一种干细胞，该种干细胞具有极强的分化功能，可分化为骨、肌肉、神经、肝、内皮和心肌等组织细胞^[42-44]。临床研究认为，外源性脐带间充质干细胞不但可以在大鼠体内正常存活，还可以快速增殖，但是人们尚未明确脐带间充质干细胞转话成其他细胞因子的作用机理^[45-48]。有报道称，脐带间充质干细胞分离出的干细胞活性和含量显著优于骨髓间充质干细胞，但免疫原性低于骨髓间充质干细胞^[49-52]。因此，作者选用脐带间充质干细胞作为外源培养干细胞。有研究显示，给予糖尿病患者移植脐带间充质干细胞可有效改善糖尿病末期患者肾脏功能，提高患者存活率^[53-54]。Pievani等^[55]研究显示，脐带间充质干细胞移植后可以分化为胰岛β细胞，从而修复损伤的胰岛细胞，改善糖尿病患者症状，发现外源性干细胞在胰腺微环境中可以有效促进胰岛素分化。作者检测大鼠注射链脲霉素后，发现大鼠注射链脲霉素24 h后，与对照组相比，模型组大鼠空腹血糖明显增加(P < 0.05)，且高于正常值(6.7 mmol/L)；给药后30 d，大鼠空腹血糖仍维持在较高水平，且高于对照组(P < 0.05)，换而言之，实验大鼠造模实验成功。在给予移植组大鼠脐带间充质干细胞移植后，糖尿病大鼠移植间充质干细胞后空腹血糖逐渐下降，15 d时空腹血糖水平明显低于糖尿病组(P < 0.05)；移植 45 d后移植组大鼠空腹血糖水平降至正常值，与对照组接近(P > 0.05)。而糖尿病组大鼠空腹血糖维持较高水平，无明显变化。检测移植组、糖尿病组大鼠不同时间的体质量，脐带间充质干细胞移植后，大鼠体质量逐渐增加，15 d时大鼠体质量明显高于糖尿病组(P < 0.01)，45 d时大鼠体质量与对照组接近(P > 0.05)，而糖尿病组大鼠体质量持续下降。从本次实验结果显示脐带间充质干细胞可以有效改善糖尿病大鼠症状，这对人类应用脐带间充质干细胞治疗糖尿病而言具有重要借鉴意义，既往研究表明骨髓间充质干细胞可在体外诱导分化为胰岛样细胞；骨髓间充质干细胞诱导分化的胰岛样细胞可以降低糖尿病大鼠血糖、尿糖值水平，可能具有治疗糖尿病作用^[56]，故考虑移植的脐带间充质干细胞在大鼠体内通过分化为胰岛样细胞起到降低糖尿病大鼠血糖的作用。

综上所述，移植了脐带间充质干细胞的糖尿病大鼠血糖值降低、体质量增加；证实脐带间充质干细胞移植能有效治疗大鼠糖尿病。

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实验性糖尿病动物模型的研究进展：

实验性糖尿病动物模型是指通过物理、生物、化学等致病因素人工诱发出的具有糖尿病特征的动物模型。具有耗时短，方法简便，易于掌握，重复性好的特点，短期内可诱导出大量模型。

①胰腺切除法：是最早的糖尿病动物模型复制方法。1890年，Mehring和Minkowski报道，在切除狗胰腺后，出现多尿，多饮，多食和严重的糖尿现象。一般选用较大的实验动物，如狗和家兔等，其次用大鼠。全部切除胰腺，可制成无胰性糖尿病动物模型，需补充外源性胰酶。如果希望动物保持良好的健康状况，需保留部分胰腺组织。

②化学药物特异性破坏胰岛β细胞：

链脲佐菌素：链脲佐菌素通过自由基损伤β细胞，使β细胞功能受损，胰岛素合成减少，引发糖尿病。

四氧嘧啶：四氧嘧啶产生超氧自由基而破坏β细胞，导致胰岛素合成减少，胰岛素缺

乏。其作用可能与干扰锌的代谢有关。

③手术及药物联合制作糖尿病模型：通过手术切除实验动物较易切除的胰腺钩突及体尾部，然后局部或全身应用胰腺β细胞毒性药物，以破坏残留胰腺的β细胞，使其丧失功能，造成实验动物体内胰岛素缺乏，从而诱发实验动物出现糖尿病的临床症象。克服了全胰切除所致的严重创伤和胰腺外分泌障碍的缺点，也避免了大剂量应用胰腺β细胞毒性剂给其他组织器官带来的严重损伤。

④病毒诱导方法：柯萨奇病毒多感染儿童，主要经肠道传播，引发胰腺炎，导致淋巴细胞浸润β细胞坏死，可使新生的小白鼠、田鼠等致病，对成年鼠不致病。

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