辛伐他汀对成骨细胞增殖分化及连接蛋白43表达的调控

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.15.002

摘要/Abstract

摘要：

背景：辛伐他汀对成骨细胞增殖分化的影响以及分子机制尚不完全明了，尤其对连接蛋白43的作用知之甚少。
目的：探讨辛伐他汀对成骨细胞增殖分化及成骨基因和连接蛋白43表达的调控作用。
方法：选取新生SD大鼠，采用颅盖骨消化法培养成骨细胞。采用不同浓度辛伐他汀(0.062 5，0.125，0.25，0.5和1.0 μmol/L)处理成骨细胞，MTT检测辛伐他汀对成骨细胞增殖作用的影响；碱性磷酸酶活性检测辛伐他汀对成骨细胞分化作用的影响；实时定量RT-PCR和免疫印迹检测细胞成骨基因和间隙连接蛋白43 mRNA和蛋白的表达。
结果与结论：细胞培养第3天，辛伐他汀组各浓度组MTT吸光度值比较差异无显著性意义(P > 0.05)；但是培养第4天和第5天，辛伐他汀各浓度组MTT吸光度值低于对照组(P < 0.05)。通过不同浓度辛伐他汀处理成骨细胞后，与对照组比较，成骨细胞碱性磷酸酶活性增加(P < 0.05)，且0.25 μmol/L 浓度组作用对成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响最为显著。采用0.25 μmol/L辛伐他汀处理成骨细胞后，辛伐他汀组与对照组比较，成骨细胞骨钙蛋白、碱性磷酸酶、I型胶原和连接蛋白43 mRNA和蛋白表达均增加(P < 0.05)。提示辛伐他汀可能通过上调成骨基因和间隙连接蛋白43 mRNA和蛋白的表达来抑制成骨细胞增殖和促进其分化，这为他汀类药物治疗骨质疏松症提供新的干预靶点。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 骨组织工程, 辛伐他汀, 成骨细胞, 骨质疏松症, 间隙连接蛋白43, 增殖, 分化

Abstract:

BACKGROUND: The effects and molecular mechanism of simvastatin on the proliferation and differentiation of osteoblasts remain unclear. Especially, we do not know much about the effects of connexin 43.
OBJECTIVE: To evaluate the effects of simvastatin on the proliferation and differentiation of osteoblasts and the regulatory effect of simvastatin on the expression of osteogenic genes and connexin 43.
METHODS: Newborn Sprague-Dawley rats were chosen and the cranium digestion method was used to culture osteoblasts. The different concentrations of simvastatin (0.062 5, 0.125, 0.25, 0.5 and 1.0 μmol/L) were used to deal with osteoblasts. The proliferative effect of simvastatin on osteoblasts was measured with 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide. The effect of simvastatin on osteoblast differentiation was measured with alkaline phosphatase activities. The mRNA and protein expression of osteogenic genes and connexin 43 were measured by real time quantitative RT-PCR and western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: There were no significant differences in absorbance values of simvastatin groups at 3 days (P > 0.05). However, at 4 and 5 days, absorbance values were lower in the simvastatin groups than those in the control group (P < 0.05). Compared with the control group, alkaline phosphatase activities of osteoblasts were greater in the simvastatin groups (P < 0.05). Moreover, the effects of 0.25 μmol/L simvastatin on alkaline phosphatase activities of osteoblasts were most significant. Osteocalcin, alkaline phosphatase activities, type I collagen and connexin 43 mRNA and protein expressions were increased after treatment with 0.25 μmol/L simvastatin (P < 0.05). These results indicated that simvastatin may inhibit the proliferation and improve the differentiation of osteoblasts by upregulating the mRNA and protein expression of osteogenic genes and connexin 43. These data may provide the new intervention target for osteoporosis treated with statins.

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Key words: kininogens, osteoblasts, osteoporosis, connexin 43, cell proliferation

中图分类号:

R318

王国亮，蔡湘波，李文壮，罗胜明，陈泽雁，陈戈胜. 辛伐他汀对成骨细胞增殖分化及连接蛋白43表达的调控[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(15): 2303-2308.

Wang Guo-liang, Cai Xiang-bo, Li Wen-zhuang, Luo Sheng-ming, Chen Ze-yan, Chen Ge-sheng . Regulatory effects of simvastatin on osteoblast proliferation, differentiation and connexin 43 expression[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(15): 2303-2308.

图/表（结果） 3

2.1 辛伐他汀对细胞增殖的影响 根据MTT数据分析，与对照组比较，细胞培养第3天，辛伐他汀各浓度组MTT吸光度值比较，差异无显著性意义(P > 0.05)，说明辛伐他汀对成骨细胞无明显促增殖效应；而在成骨细胞培养第4，5天，不同浓度辛伐他汀组MTT吸光度值比较，差异有显著性意义(P < 0.05)，辛伐他汀各浓度组MTT吸光度均值小于对照组，说明辛伐他汀对成骨细胞的增殖具有抑制作用(表2)。

2.2 辛伐他汀对成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响 与对照组比较，不同浓度辛伐他汀组的A值均升高，差异有显著性意义(P < 0.05)，提示辛伐他汀能够增强成骨细胞碱性磷酸酶活性，其中0.250 μmol/L辛伐他汀组对成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响最为显著(表2)。

2.3 辛伐他汀对成骨细胞成骨基因和连接蛋白43 mRNA表达的影响 采用0.25 μmol/L辛伐他汀处理成骨细胞后，辛伐他汀组与对照组比较，成骨细胞骨钙蛋白、碱性磷酸酶、I型胶原和连接蛋白43 mRNA表达差异均有显著性意义(P < 0.05)，提示辛伐他汀能够提高成骨细胞骨钙蛋白、碱性磷酸酶、I型胶原和连接蛋白43的mRNA表达，因此说明0.25 μmol/L浓度组作用成骨细胞，通过上调成骨细胞成骨基因和连接蛋白43 mRNA表达，来影响成骨细胞增殖或分化(图1)。

2.4 辛伐他汀对成骨细胞成骨基因和连接蛋白43蛋白表达的影响 通过Western blot技术，采用0.25 μmol/L辛伐他汀处理成骨细胞后，辛伐他汀组与对照组比较，成骨细胞骨钙蛋白、碱性磷酸酶、I型胶原和连接蛋白43蛋白表达差异均有显著性意义(P < 0.05)，提示辛伐他汀能够提高成骨细胞骨钙蛋白、碱性磷酸酶、I型胶原和连接蛋白43的蛋白表达，因此说明0.25 μmol/L浓度组作用成骨细胞，通过上调成骨细胞成骨相关蛋白和连接蛋白43蛋白表达，来影响成骨细胞增殖或分化(图2)。

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引言

材料方法

设计：动物实验，对照观察。

时间及地点：于2011年至2012年9月在广州医科大学麻醉学系实验室完成。

材料：

实验动物：新生24 h健康SD大鼠72只，由广东省医学动物实验中心提供，许可证号：SCXK(粤)2008-0002，实验过程中对动物的处置符合伦理学标准。

方法：

成骨细胞培养：采用颅盖骨消化法培养成骨细胞。取SD大鼠(新生24 h内)为实验对象，颈椎脱臼处死，用眼科剪剪下头部，分离颅骨，D-Hank液(含青霉素100 U/mL，链霉素100 U/mL)冲洗，仔细去除颅骨表面的纤维组织、骨膜组织及血管等软组织。将颅骨剪成1.0 mm×1.0 mm 大小的骨片，送入培养瓶中，置于体积分数5%CO₂、37 ℃ CO₂培养箱中。倒置相差显微镜观察细胞贴壁生长情况至细胞长至80%融合时传代培养，0.25%胰蛋白酶消化细胞，收集消化所得细胞，并用差速贴壁法除去成纤维细胞。

实验分组：将辛伐他汀溶解于二甲基亚砜(DMSO)，并用DMEM培养液配制5组不同浓度辛伐他汀，浓度分别为 0.062 5，0.125，0.25，0.5和1.0 μmol/L，对照组培养液中加入等体积不含辛伐他汀的DMSO，其余同实验组。

MTT检测：成骨细胞以1×10⁸L^-1的细胞浓度分别植入96孔板中，用含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液中培养24 h后，采用无血清DMEM培养24 h，再培养20 h后每孔加入20 μL MTT(5 g/L)，4 h后吸去培养液，加入DMSO 150 μL，每组重复6孔，参考波长630 nm，采用酶标仪检测570 nm波长时各孔吸光度值。

碱性磷酸酶活性检测：成骨细胞以3×10⁷ L^-1的细胞浓度接种到6孔板中，更换无血清培养基24 h后，实验组含不同浓度辛伐他汀的无血清DMEM培养24 h后，对照组使用无血清DMEM培养，吸弃孔中的培养液，用D-Hank洗2遍，每孔加入细胞裂解液(Tri-HCl，pH 7.5，含0.1%Triton X-100)400 μL，超声波破碎细胞，4 ℃离心取上清，采用BCA法测定裂解液中总蛋白浓度，采用对硝基酚磷酸盐法测定碱性磷酸酶活性，用碱性磷酸酶活性数值比蛋白量，为碱性磷酸酶比活性数值。碱性磷酸酶活性以U/mg蛋白表示。

Real-time RT-PCR：用0.25 μmol/L辛伐他汀处理成骨细胞4 d后，采用Trizol法提取细胞总RNA，RNA定量后反转录合成第一链cDNA后，进行PCR反应，内参基因为GAPDH，梯度稀释内参基因法制定相对标准曲线，根据扩增产物的Ct值(扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数)及相对标准曲线求出各标本所含连接蛋白43的模板量，与GAPDH量作比，以比值作为最终统计数据，采用溶解曲线法和凝胶电泳法鉴定产物特异性和片段大小。PCR反应体系：总体积50 μL，包括：PCR MasterMix 25 μL，引物(10 μmol/L)各2 μL，cDNA模板 5 μL。PCR反应条件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，45个循环。基因引物序列(表1)。

Western blot：采用0.25 μmol/L辛伐他汀处理成骨细胞4 d后，细胞裂解液裂解成骨细胞，12 000 r/min离心 30 min，取上清，测定总蛋白含量。细胞蛋白经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，100 V电泳转移至PVDF膜上，脱脂奶粉封闭液封闭2 h，用骨钙蛋白、碱性磷酸酶、I型胶原和连接蛋白43抗体4 ℃孵育过夜。辣根过氧化物酶偶联的IgG孵育2 h，采用ECL显影并检测。以GAPDH作为内对照。

主要观察指标：采用颅盖骨消化法培养成骨细胞，MTT检测辛伐他汀对成骨细胞增殖作用的影响；碱性磷酸酶活性检测辛伐他汀对成骨细胞分化作用的影响；实时定量RT-PCR和免疫印迹检测细胞成骨基因和间隙连接蛋白43 mRNA和蛋白的表达。

统计学分析：所有数值采用x(_)±s表示，两两比较采用Student’s t-test，多重比较采用方差分析，统计分析均采用SPSS 17.0软件，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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讨论

目前他汀类药物在临床上主要是用于降低胆固醇，治疗高脂血症，从而达到控制心血管疾病。人们发现降血脂药他汀类药物能特异性增加成骨细胞骨形态发生蛋白2表达，并且可以刺激骨的形成，说明其能预防骨质疏松症及骨折发生，因此具有一定的临床应用潜力^[14-19] 。辛伐他汀影响成骨细胞增殖、分化和凋亡等过程中的分子机制，尤其对间隙连接蛋白连接蛋白43在其对成骨细胞影响中发挥的作用机制尚不清楚。
在外界信息刺激下，通过细胞自身调控系统的作用而进行细胞增殖的调控。细胞内调控信息是由一些离子和小分子物质传递的，它们在细胞间的流动受到间隙连接精细调控。生长抑制信息通过间隙连接从生长静止细胞传到生长活跃细胞，达到一定阈值后，停止生长；而将生长刺激信息从生长活跃细胞传到临近细胞，使生长刺激分子在更大的细胞群体中分布，其浓度逐渐稀释，低于阈值时，生长停止。实验研究辛伐他汀对成骨细胞增殖的影响，采用MTT法检测细胞增殖情况。MTT可以在代谢活跃细胞内被线粒体琥珀酸脱氢酶还原为不溶于水的蓝紫色结晶物，并沉积在细胞中，间接反映活细胞数量，是测定细胞增殖水平的一个可靠指标。实验经MTT检测发现，各浓度辛伐他汀实验组MTT值均有降低，与对照组比较差异有显著性意义，说明辛伐他汀抑制成骨细胞增殖。
碱性磷酸酶是成骨细胞分化的早期指标之一，其表达随着细胞分化的发展而加强，代表骨形成的状况，表明细胞分化和骨组织形成的开始。因此碱性磷酸酶增高在体外实验中可作为成骨细胞分化的指标。骨钙蛋白又称骨γ-羧基谷氨酸蛋白(bone γ-carboxyglutamic acid，BGP)，是成骨细胞分化时所分泌的一种非胶原蛋白质，是成骨细胞产生的一类多肽物质。其活性大小在一定程度上反映成骨细胞分化程度和功能状况。骨钙蛋白检测常可间接反映骨的合成代谢。I型胶原是成骨细胞分泌基质中的主要定型成分之一，占骨有机基质的90%以上，是细胞附着和钙盐沉着的支架。因此I型胶原是成骨细胞晚期分化的指标。骨钙蛋白、碱性磷酸酶和I型胶原是成骨细胞的标志性分子，骨钙蛋白、碱性磷酸酶和I型胶原水平的升高是成骨细胞向骨细胞转化和成骨细胞成骨功能的标志^[20-21] 。实验结果显示辛伐他汀能够促进成骨细胞碱性磷酸酶活性，其中辛伐他汀0.25 μmol/L浓度组作用对成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响最为显著。并且发现辛伐他汀能够提高成骨细胞成骨标志物骨钙蛋白、碱性磷酸酶和Ⅰ型胶原mRNA和蛋白水平的表达，可以刺激成骨细胞产生大量的骨钙蛋白、碱性磷酸酶和I型胶原，这说明辛伐他汀既可以刺激成骨细胞的早期分化，也可以刺激其晚期分化。
物理信号特别是力负载在骨转换中起重要作用，而骨组织中的细胞成分是对其周围环境的刺激作出反应的基本结构单位，它们在接受刺激后通过结构和功能的调整从而作出反应，然而力负载通过什么途径对细胞群体产生作用，骨细胞对力负载引起的顺式反应机制至今令人困惑^[22-23] 。近来研究发现，骨的重建与细胞间隙连接蛋白基因表达和信号转导机制变化以及间隙连接胞间通讯功能调整密切相关^[24] 。同时，胞间连接蛋白又受着许多生长因子素等的调控，这些作用因素通过影响连接蛋白，进而调节骨组织中各种细胞的数量，影响细胞代谢等活动，使骨组织发生相应改变^[25] 。成骨细胞连接蛋白43是骨内细胞网络中成骨细胞间代谢活动所必需的，连接蛋白43直接调节成骨细胞间通讯，连接蛋白43接受刺激后可改变骨钙蛋白和I型胶原基因水平的表达^[26-29] 。在连接蛋白43突变老鼠身上发现早发性骨量减少^[30] ，并且在缺失成骨细胞连接蛋白43的小鼠接受3周后肢悬挂机械卸载力训练后，与对照组比较，其骨形成标志物P1NP和硬骨素sclerostin表达降低，因此抑制皮质骨形成^[31] 。吕海宏等^[32]研究了去卵巢致骨质疏松大鼠骨细胞中间隙连接蛋白43的表达及意义，30只大鼠随机分为去卵巢组、假手术组和尼尔雌醇治疗组，于术后8周末测量3组大鼠全身及腰椎骨密度(BMD)，采用放免法测定血清雌二醇水平，采用SABC免疫组化法观察连接蛋白43在成骨细胞和破骨细胞中的表达情况。结果各项指标假手术组和尼尔雌醇治疗组差异无显著性意义，实验认为去卵巢大鼠连接蛋白43在成骨细胞中表达下降，而在破骨细胞中表达增加，在成骨和破骨细胞中连接蛋白43表达的变化可能是去卵巢大鼠发生骨质疏松的机制之一。
在老年患者，由于氧化应激引起的骨细胞死亡是损害骨质量和骨丢失的主要原因之一，人们发现H₂O₂可以引起成骨细胞死亡，并且引起剂量依赖性的连接蛋白43表达减少^[33] ，因此作者推测辛伐他汀可能通过减轻成骨细胞的氧化应激水平来调控连接蛋白43的表达。连接蛋白43siRNA或缝隙连接的化学抑制剂抑制成骨细胞连接蛋白43的表达，可以上调凋亡信号通路蛋白caspase-3、破骨细胞生成信号通路蛋白RANK和骨形成信号通路蛋白Sost/sclerostin表达^[34] 。而且人们发现成骨细胞连接蛋白43的表达通过调控Runx2来影响对成纤维细胞生长因子2的反应性，而这是通过激活PKCδ信号级联反应产生的^[35-36] 。
实验发现辛伐他汀上调成骨细胞连接蛋白43的mRNA和蛋白表达，说明辛伐他汀可能通过上调成骨细胞连接蛋白43的mRNA和蛋白表达，去影响成骨细胞的增殖和分化情况。本实验研究发现辛伐他汀可能通过上调成骨基因和连接蛋白43表达，抑制成骨细胞的增殖，促进成骨细胞分化，从而为探索他汀类药物对成骨细胞的调节机制提供新的依据，为他汀类药物治疗骨质疏松症提供理论依据和新的干预靶点。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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