联合钙盐骨水泥及可降解网状微孔球囊椎体成形的体外实验

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.12.003

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (12): 1817-1823.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.12.003

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联合钙盐骨水泥及可降解网状微孔球囊椎体成形的体外实验

刘训伟¹，钟建²，彭湘涛¹，魏岱旭²，周涓²，叶勇¹，孙钢¹

1解放军济南军区总医院医学影像科，山东省济南市 250031
2纳米技术及应用国家工程研究中心，上海市 200241

修回日期:2014-01-10 出版日期:2014-03-19 发布日期:2014-03-19
通讯作者: 孙钢，主任医师，博士，教授，博士研究生导师，解放军济南军区总医院医学影像科，山东省济南市 250031
作者简介:刘训伟，男，1975年生，山东省菏泽市人，泰山医学院毕业，主治医师，主要从事介入诊疗和影像诊断研究。
基金资助:
国家高技术研究发展计划(863计划)资助(2013AA032203)；国家自然科学基金资助(51073173)

Performance testing of biodegradable mesh-like microporous balloon combined with calcium phosphate cement for vertebroplasty

Liu Xun-wei¹, Zhong Jian², Peng Xiang-tao¹, Wei Dai-xu², Zhou Juan², Ye Yong¹, Sun Gang¹

1Medical Image Department of General Hospital of Jinan Military Region, Jinan 250031, Shandong Province, China
2National Engineering Research Center for Nanotechnology(NERCN), Shanghai 200241, China

Revised:2014-01-10 Online:2014-03-19 Published:2014-03-19
Contact: Sun Gang, M.D., Professor, Chief physician, Doctoral supervisor, Medical Image Department of General Hospital of Jinan Military Region, Jinan 250031, Shandong Province, China
About author:Liu Xun-wei, Attending physician, Medical Image Department of General Hospital of Jinan Military Region, Jinan 250031, Shandong Province, China
Supported by:
The National High Technology Research and Development Program of China (863 Program), No. 2013AA032203; the National Natural Science Foundation of China, No. 51073173

摘要/Abstract

摘要：

背景：椎体成形、椎体后凸成形治疗骨质疏松性椎体压缩性骨折中存在骨水泥外溢、伤椎及临近椎体继发骨折等风险。
目的：验证高分子可降解网状微孔球囊应用于骨质疏松性椎体压缩骨折的可行性。
方法：以聚乳酸-已内酯共聚物为原材料，采用静电纺丝技术制备可降解网状微孔球囊，同时制备涂层球囊，扫描电镜观察其形貌；向球囊内分别注入水和骨水泥，观察外渗情况；测试球囊的断裂强度和断裂伸长率。采用细胞染色法和CCK-8法测试小鼠胚胎成骨细胞在两种球囊上的增殖情况。观察两种球囊在模拟体液、猪胰脂肪酶溶液和新鲜的人血清中的降解。将球囊置入猪椎体后测试球囊的爆破压。将钙盐骨水泥注入球囊后密封，固化后置于6 atm压力的超纯水中，定期检测钙离子浓度。
结果与结论：网状微孔球囊具有良好的纤维形态，粗细分布均匀，存在孔隙；涂层球囊表面无具体形态结构及孔隙存在。与涂层球囊相比，网状微孔球囊具有更好的力学性能和液体渗透性及爆破压力，可防止骨水泥渗漏，促进成骨细胞的黏附与增殖，降解更均匀、稳定，可较好保持钙离子浓度，更利于新骨生长和骨折愈合。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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关键词: 生物材料, 骨生物材料, 可降解材料, 静电纺丝, 纳米纤维, 球囊, 骨质疏松, 椎体压缩性骨折, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Vertebroplasty and kyphoplasty for osteoporotic vertebral compression fractures can result in many complications, such as bone cement leakage and adjacent-level fractures.
OBJECTIVE: To verify the possibility of biodegradable mesh-like microporous polymer balloon for the treatment of osteoporotic vertebral compression fractures.
METHODS: Biodegradable mesh-like microporous P(DLLA-CL) balloons were fabricated by electrospinning technique. Coated balloons with the same specification was fabricated by coating P(DLLA-CL) onto the same mould. Morphology of the balloons was observed by scanning electron microscopy. The balloon leakage was observed by eyes after the injection of water or cement. The initial strength and stiffness were measured by a universal testing machine. The proliferation of MC3T3-E1 cells on the balloons was determined by laser confocal microscope and cell counting kit-8 assays. The biodegradation of balloons in simulated body fluid, porcine pancreatic lipase, and fresh human serum was studied by residual weighing and scanning electron microscopy observation. Burst pressure of balloons was measured after the balloon was placed into a hole in the vertebral bone. For the in vitro calcium release tests, the balloons were filled with calcium cement, tied, placed into 6atm ultrapure water, and then the calcium concentration was regularly determined.
RESULTS AND CONCLUSION: Mesh-like microporous balloons presented with good fiber morphology, thickness distribution, and the presence of pores; on the coated balloon surface, there was absence of specific morphology and porosity. Compared with the coated balloon, the mesh-like microporous balloon showed better mechanical properties, liquid permeability and burst pressure, to prevent leakage of bone cement and promote osteoblast adhesion and proliferation. In addition, the degradation of the mesh-like microporous balloons was more uniform and stable than the coated balloons, which may increase the calcium concentration in the injured vertebrae and will be beneficial to the new bone growth and fracture healing.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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Key words: biocompatible materials, nanofibers, saccule and utricle, fractures

中图分类号:

R318

刘训伟，钟建，彭湘涛，魏岱旭，周涓，叶勇，孙钢 . 联合钙盐骨水泥及可降解网状微孔球囊椎体成形的体外实验[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(12): 1817-1823.

Liu Xun-wei, Zhong Jian, Peng Xiang-tao, Wei Dai-xu, Zhou Juan, Ye Yong, Sun Gang . Performance testing of biodegradable mesh-like microporous balloon combined with calcium phosphate cement for vertebroplasty[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(12): 1817-1823.

图/表（结果） 6

2.1 扫描电镜测试 可降解网状微孔球囊及涂层球囊膜的扫描电镜照片见图1A，B。可降解网状微孔球囊膜纳米纤维粗细一致，纤维直径为(335±55) nm，纤维分布均匀，囊膜上具有微米级的孔隙。涂层球囊表面无具体形态结构及孔隙存在。
2.2 球囊渗漏性测试 加压注入生理盐水后，见网状微孔球囊表面有大量液珠形成，涂层球囊表面光滑无渗出；加压注入稀粥期钙盐骨水泥后，网状微孔球囊表面有微量骨水泥呈针尖状渗出，涂层球囊表面无骨水泥外渗(图1C-F)。
2.3 拉伸力学性能测试 网状微孔球囊的断裂强度和断裂伸长率分别为(13.19±1.38) MPa，(554±162)%；涂层球囊的断裂强度和断裂伸长率分别为(6.65±0.66) MPa，(75±21)%。网状微孔球囊的断裂强度和断裂伸长率均高于涂层球囊(P < 0.05)，说明网状微孔球囊膜的力学性能优于涂层球囊。

2.4 细胞增殖测试 通过CCK-8和激光共聚焦显微镜观察MC3T3-E1细胞在网状微孔球囊及涂层球囊膜上生长 7 d的情况，见图2，3。图2结果表明培养1，4，7 d后，CCK-8检测细胞增殖情况随时间发生显著变化，两种球囊上生长的细胞的活性随时间的增长而增强，培养7 d后，网状微孔球囊膜上细胞活性明显高于涂层球囊膜上的细胞活性。图3结果同样表明在细胞培养7 d时，网状微孔球囊膜上的细胞数量和形态已经优于涂层球囊膜。

2.5 降解测试 通过测量在膜片置入模拟体液、猪胰脂肪酶溶液和人血清3种液体后不同时间点的质量，得出膜片质量丢失的趋势图，见图4。图4结果表明聚乳酸-已内酯共聚物制备的膜片在3种液体中降解速度人血清>猪胰脂肪酶溶液>模拟体液。网状微孔球囊膜降解速率较平均，而涂层球囊先期降解不明显，后期质量改变较大，溶液中并可见小片絮状物质，为整块脱落的薄膜。电镜扫描图像显示网状微孔球囊膜逐层降解，向内渗透(图5)；而涂层球囊膜降解不均匀，成片状脱落。因此网状微孔球囊膜的降解过程中更具稳定性。

2.6 球囊爆破压测试 网状微孔球囊及涂层球囊膜的爆破压测试结果分别为(15.2±0.8)，(6.2±0.6) atm，两者差异有显著性意义(P < 0.001)。目前临床应用的塑胶类椎体扩张球囊爆破压为18 atm，恢复椎体高度需要的压力为9 atm^[23]，因此网状微孔球囊在承受压力范围内与足以使压缩椎体复位。而涂层球囊承受压力较小，实验过程中在抬升椎体时常出现爆裂现象，且无法完全抬升椎体，并在爆裂时对周围骨小梁产生强力压迫，造成二次骨折。爆破压测试过程见图6。

2.7 钙离子析出测试 球囊包裹的骨水泥和圆柱状钙盐骨水泥块置于6 atm压力下的超纯水中，在1-4周钙离子浓度改变趋势，见图7。无包裹的钙盐骨水泥块钙离子析出较快，浓度达到较高状态，4周后骨水泥块失去正常形态，呈泥沙状沉淀于容器底部。涂层球囊包裹下5周仍未测出钙离子，电镜扫描发现球囊膜无降解，钙离子无法穿透球囊膜进入液体内。网状微孔球囊包裹下的骨水泥钙离子析出较平稳，浓度最高至2.08 mmol/L即呈相对稳定状态，略低于血液中钙离子浓度。

血液中钙离子具有一定的浓度，骨折部位钙浓度增高利于新骨形成和生长，但钙离子过高会导致骨痂的过度钙化，影响预后功能。因此钙盐骨水泥直接作用于骨折部位效果并未如想象中理想。而涂层球囊导致骨水泥中钙离子无法析出，在骨折愈合期无法发挥钙盐骨水泥应有的作用。网状微孔球囊的结构特性使钙离子的浓度达到一定浓度并稳定在一水平线上，这样既保证了骨折椎体的快速愈合，又能改善椎体的骨质疏松状况。

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引言

经皮椎体成形、经皮椎体后凸成形现已成为临床上治疗骨质疏松性椎体压缩性骨折最重要的手段。经过多年的发展创新及经验积累，椎体成形、椎体后凸成形术式、器械及植入骨水泥种类基本确定，同时骨水泥外溢、术后伤椎临近椎体骨折发生率增加^[1-6]、伤椎裂隙征等后续问题也显露出来^[7]，究其原因，主要是植入的聚丙烯酸树脂骨水泥自身硬度大、刚度强的特性导致的^[8-9]。而具有促骨生长的可降解性钙盐骨水泥因机械性能差、遇水易溃散等难以应用于椎体手术中^[10-11]，国内外专家学者多年来的改性或改良研究^[12-17]，仍未见钙盐骨水泥可应用椎体的确切报道。

为在椎体骨折中应用钙盐骨水泥，有研究采用聚合物薄膜材料(如硅胶薄膜等)，在移出球囊后植入复位椎体内部，薄膜材料可以对灌注的钙盐骨水泥与周围组织之间形成一个良好的分割屏障，有效防止了骨水泥的溃散和渗漏，动物实验和临床试验结果表明有一定的改善^[10,18]。但硅胶材料不降解，钙盐骨水泥无法接触骨组织发挥促骨生长的特性，也不能避免伤椎裂隙征的发生。也有研究者采用可降解高分子膜如聚乳酸等^[19]，成品存在强度不足、降解不可控性等问题，未能应用于临床。

通过静电纺丝技术制备的纳米纤维膜，具有较常规制备的可降解薄膜更好的力学特性，其包裹钙盐骨水泥后力学强度接近正常椎体^[20]，并能避免椎体后凸成形中的椎体失高^[21]。

实验就是将聚乳酸-已内酯共聚物(P(DLLA-CL))分别通过静电纺丝技术和涂层法制备为球囊，并对两种球囊各种性能进行比较，验证可降解网状微孔球囊应用于临床的可行性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程
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材料方法

设计：对比观察实验。

时间及地点：于2012年7月至2013年5月在纳米技术及应用国家工程研究中心实验室、解放军济南军区总医院医学影像科及检验科实验室完成。

材料：

实验方法：

可降解网状微孔球囊及涂层球囊的制备：①溶液配制：将聚乳酸-已内酯共聚物(DLLA/CL=70/30)聚合物按照6%溶解在二氯甲烷和N，N-二甲基甲酰胺(7∶3)溶剂中，密封后置于磁力搅拌器上搅拌24 h，制备成完全透明的溶液。②静电纺丝制备可降解网状微孔球囊：将配置好的溶液置于10 mL玻璃注射器内，注射器针头为4号平针头，针头与高压发生器相连，施加电压为10.0-11.0 kV。溶液流量由微量注射泵控制，流速为30 μm/min，纤维收集到水平位置转速为15 r/min接地的钛合金模具上。模具与针头距离10-15 cm。在室温密闭条件下进行静电纺丝。球囊厚度约0.2 mm，制备好的球囊在真空干燥器中干燥后密封保存。③通过模具直接在溶液中制备厚度约0.2 mm的涂层球囊。

测试与表征：

球囊形貌观测：将制备好的球囊真空干燥后随机裁剪方形样品，喷金后扫描电镜检测，随机选取扫描图像，观察球囊膜的结构及纤维形态。

球囊包裹和渗漏：将球囊固定于传送装置上，通过传送管道注入生理盐水和稀粥期的钙盐骨水泥，观察球囊膨胀和膜表面有无渗漏。

拉伸力学性能测试：用自制直径1.0 cm钛合金棒经相同条件制备0.2 mm薄膜，垂直剖开后制成宽1.0 cm、长10.0 cm、厚0.2 mm的条带状，干燥后固定于万能试验机上，两端各于1.0 cm处固定，中间8.0 cm为测试区。在20 ℃、60%湿度的环境下以10 mm/min拉伸速度测试，计算断裂强度和断裂伸长率。各用5个样品进行测试，取统计值。

细胞增殖测试：将球囊剖开并用体积分数75%乙醇灭菌后，将球囊外表面向上平铺在48孔板中，将2×10⁴个MC3T3-E1细胞接种到球囊膜上分别培养7 d。使用含体积分数10%胎牛血清的MEM-α培养基在体积分数5% CO₂和37 ℃条件下培养细胞，每2 d更换1次培养基。在细胞培养1，4，7 d时，将球囊膜用含0.5 mg/L二乙酸荧光素的培养基染色后，通过激光共聚焦显微镜观察细胞数量的增长。取另一部分材料浸润在含10% CCK-8的培养基中继续培养2 h，每孔吸取100 μL的染色液置于96孔板中，采用酶标仪在450 nm波长下测定吸光值。

降解测试：将球囊膜制成直径0.8 cm的圆形膜片，分别标记、测质量后置于kokubo’s人工模拟体液^[22]、猪胰脂肪酶溶液和新鲜的人血清(解放军济南军区总医院检验科)里，置于37.5 ℃恒温振荡器中，振荡速率为100 r/min。于1 d、4 d、1周、2周、3周、4周时取出膜片，用超纯水洗涤3次，在真空下干燥12 h后称质量，然用扫描电镜观察膜的形态。

球囊爆破压测试：应用解放军济南军区总医院动物实验中心提供的新鲜猪腰椎椎体，在DSA引导下经椎弓根穿刺进入椎体后，撤出针芯，用骨钻建立工作通道，将球囊置入椎体后，应用压力泵注入76%泛影葡胺，球囊膨胀至破裂，测试球囊最大承重压力。各用5个样品进行测试，取统计值。

钙离子析出测试：将钙盐骨水泥注入可球囊后密封，将与骨水泥固化后的圆柱状固体分别置于骨水泥灌注枪中，注入超纯水至20 mL，并给予6 atm压力，于1，2，3，4周测定钙离子的浓度。

主要观察指标：球囊膜的结构、纤维形态，力学性能、生物相容性、降解性能及爆破压和钙离子析出。

统计学分析：采用SPSS Statistics 17.0统计软件进行分析。数据以x(_)±s表示，所得数据进行配对t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

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