小鼠毛囊再生与胸腺素β4的促进效应

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.11.008

摘要/Abstract

摘要：

背景：近年来研究表明，胸腺素β4与毛囊的生长发育和毛发的生长周期有着密切关系，但其作用机制尚不清楚。

目的：探讨胸腺素β4通过Wnt信号通路作用于毛囊干细胞对毛囊再生的促进作用。

方法：将实验小鼠随机分为低剂量胸腺素β4组、高剂量胸腺素β4组和对照组，使用松香/石蜡混合制剂建立脱毛模型。低剂量胸腺素β4组和高剂量胸腺素β4组给药浓度分别为0.3 μg/50 μL和3 μg/50 μL，对照组给予等量PBS，每隔12 h给药1次，均匀涂抹于小鼠脱毛背部。应用大体照相、苏木精-伊红染色、免疫组化及原位杂交技术，观察毛发生长情况，检测不同时间点和不同给药浓度下小鼠毛囊根部细胞β-catenin、LEF-1 mRNA的表达水平。

结果与结论：低剂量胸腺素β4组毛发再生速度高于高剂量胸腺素β4组和对照组。苏木精-伊红染色显示在脱毛初期，各组小鼠真皮和皮下脂肪层有一定炎性细胞浸润，9 d时，低剂量胸腺素β4组生长期毛囊数量明显多于高剂量胸腺素β4组和对照组。免疫组织化学和原位杂交结果分别显示β-catenin和LEF-1 mRNA主要表达于毛囊隆突部和外根鞘处细胞的胞浆中，经积分吸光度分析发现低剂量胸腺素β4组阳性细胞数量和染色强度高于高剂量胸腺素β4组和对照组(P < 0.05)，高剂量胸腺素β4组与对照组间差异无显著性意义。结果显示低剂量的胸腺素β4可以增加部分毛囊外根鞘处细胞内β-catenin和LEF-1 mRNA的表达。胸腺素β4可以促进毛囊再生的机制可能与影响Wnt信号通路有关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 组织工程, 干细胞, 毛囊干细胞, 胸腺素β4, 毛囊再生, Wnt信号通路, β-连环蛋白, 淋巴增强因子1, 毛囊周期

Abstract:

BACKGROUND: Results of recent studies demonstrated the modulation of thymosin β4 on hair cycle and regeneration, but the mechanism of action remains unclear.

OBJECTIVE: To investigate the mechanism by which thymosin β4 increases hair regeneration through Wnt signal pathway.

METHODS: After the mouse model of depilation was established using rosin/paraffin mixed agents, the experimental animals were randomly assorted to three different groups, including low-dose, high-dose and control groups, and a dose of 0.3 μg/50 μL, 3 μg/50 μL thymosin β4 and PBS was administered on the depilated backs every 12 hours, respectively. Then photography, hematoxylin-eosin staining, immunohistochemistry and in situ hybridization were applied to observe the growth of hair, and the expressions of β-catenin and LEF-1 mRNA in different groups at different time were quantitatively evaluated.

RESULTS AND CONCLUSION: The hair growth of the low-dose group was faster than that of the other groups. Hematoxylin-eosin staining demonstrated inflammatory cells infiltration in the dermis after depilation, and the number of hair follicles that were in the phase of anagen was much more than the other groups as time went by. Immunohistochemistry of β-catenin showed the accumulation of intra-cellular β-catenin in the low-dose group at the bulge of follicles assessed by integrated absorbance analysis (P < 0.05), so did the in situ hybridization of LEF-1 mRNA. Low-dose thymosin β4 accelerates hair growth through Wnt signal pathway by elevating the level of β-catenin and LEF-1 mRNA.

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Key words: hair follicle, thymosin, beta catenin, lymphoid enhancer-binding factor 1

中图分类号:

R318

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图/表（结果） 2

2.1 实验动物数量分析 实验入选小鼠105只，分为3组，全部进入结果分析，无脱失。

2.2 小鼠背部毛发生长情况 小鼠脱毛后皮肤略呈粉色；低剂量胸腺素β4组第5天皮肤颜色变灰，之后颜色逐渐加深，第9-11天可见背部有大面积细密短小的新毛长出，第18天背部毛发完全与周围毛发平齐，但颜色相对黑亮；高剂量胸腺素β4组与对照组第7-9天背部局部皮肤变灰，第12至13天才有新毛长出且较为稀疏，第18天细小毛发长满脱毛处，但明显较周围毛发短(图1)。

2.3 组织学观察毛囊再生 毛囊的生长包括3个阶段：生长期、退化期和静止期^[25]。小鼠脱毛后，毛囊形态呈静止期表现，毛乳头位于真皮和皮下组织交界处，没有毛囊包裹，毛囊短小，与毛乳头接触范围小。在真皮和皮下脂肪层有一定数量的炎细胞浸润；第9天，低剂量胸腺素β4组镜下可见处于生长期的毛囊多于对照组，毛囊增长并向下生长，毛囊末端基质细胞包绕毛乳头，毛乳头细胞体积较原来增大。毛母质细胞内有明显的黑色素形成, 新生毛发明显可见，皮下组织有新的小血管形成；18 d时低剂量胸腺素β4组毛乳头体积缩小，部分毛球远端基质细胞变小，呈退化期改变，毛干完全长出。高剂量胸腺素β4组和对照组各阶段毛囊生长情况均明显滞后于低剂量胸腺素β4组(图2)。

2.4 β-catenin免疫组化检查结果 β-catenin主要表达于毛囊外根鞘处细胞的胞浆中，胞浆呈棕黄色的为β-catenin表达阳性细胞。从镜下纵切面可观察到，阳性细胞主要分布于毛囊隆突部，部分分布于外根鞘处，较其他部位染色程度深(图3A1)。相同时间点不同组别间比较，低剂量胸腺素β4组的阳性细胞最多，平均染色程度最深；高剂量胸腺素β4组和对照组阳性细胞较少，染色程度浅(图3B1，C1)。经积分吸光度分析发现(表1)，低剂量胸腺素β4组各时间点积分吸光度值均高于高剂量胸腺素β4组和对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)，而高剂量胸腺素β4组与对照组之间差异无显著性意义(P > 0.05，图4A)。

2.5 LEF-1 mRNA原位杂交检测结果 淋巴增强因子1 mRNA的转录在低剂量胸腺素β4组中表达明显(图3A2)，阳性部位多出现在毛囊隆突部和外根鞘细胞内。高剂量胸腺

素β4组和对照组中阳性细胞表达不甚明显(图3B2，C2)。积分吸光度分析结果示(表1)，低剂量胸腺素β4组与高剂量胸腺素β4组和对照组在各时间点相比，差异有显著性意义(P < 0.05)，而高剂量胸腺素β4组和对照组之间差异无显著性意义(P > 0.05，图4B)。

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引言

在快速发展的现代社会，由于受外界各种因素影响和心理压力增大，人们脱发现象日益普遍。然而目前市场上的生发、防止脱发的产品大多属于化妆品而非药品，即便已有一些内服或外用的药物，生发效果也难以令人满意。胸腺素是胸腺产生的一种淋巴细胞生长因子，普遍存在于各种组织细胞当中，其中胸腺素β4(Thymosinβ4，Tβ4)亚型是目前研究的热点之一^[1-3]，对于各系统器官都有着重要的调节作用^[4-10]。它是1个由43个氨基酸残基组成的多肽，在维持肌动蛋白与肌纤蛋白的动态平衡^[11]，细胞凋亡，炎症^[1,12-13]，肿瘤发生侵袭与转移^[12,14-15]，血管生成和创伤愈合等生理、病理过程中发挥作用^[16-17]。

近年来的研究表明，胸腺素β4与毛囊的生长发育和毛发的生长周期有着密切关系^[1,17]。在毛发的生长过程中，毛囊干细胞的激活、分化和迁移，是毛发再生的基础^[17]。存在于毛囊隆突部的干细胞可以分化为仍然保持分化多能性的细胞和短暂增殖细胞(transit-amplifying cells，TA细胞)两种，短暂增殖细胞可以分化为其他类型毛囊前体细胞。短暂增殖细胞迁移至毛乳头处，在基质细胞形成的分化微环境中形成毛干^[18]。研究表明胸腺素β4是通过促进毛囊干细胞分化迁移来促进毛囊再生^[19]。体外干细胞的迁移实验也证实胸腺素β4具有促进细胞迁移的作用^[12]。

短暂增殖细胞发育过程中受到多种信号通路调节^[20]，其中Wnt信号传导通路最为关键。β-catenin和LEF-1是Wnt信号通路的两个关键分子，Huelsken等^[21]、Wang等^[22]发现β-catenin在毛囊的发生发育中起决定性作用。当Wnt蛋白与Wnt受体结合并将其激活后，激活Dsh蛋白，激活的Dsh阻断糖原合成激酶3β的活性，使β-catenin避免被磷酸化，β-catenin从复合物中解离、保持稳定并积累，进入细胞核与DNA结合蛋白LEF-1形成复合物，作用于毛发角质基因的直接上游调控者DLX3，激活毛发角质基因，促进毛囊生长^[23]。本实验通过建立小鼠背部脱毛模型，检测β-catenin和LEF-1 mRNA在毛囊内的表达情况，探讨胸腺素β4通过Wnt信号通路作用于毛囊干细胞促进毛囊再生的可能机制。

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材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2009年12月至2011年5月在南开大学医学院实验室完成。

材料：

实验动物：6-8周龄C57/BL6小鼠，体质量15-20 g，雌性，由军事医学科学院实验动物中心提供，许可证号SCXK-(军)2007-2004。选择皮色粉红(毛发处于休止期)的小鼠105只进行实验。实验中对动物的处理符合南开大学医学院伦理学标准。

实验方法：

动物分组：C57/BL6小鼠随机分为低剂量胸腺素β4组、高剂量胸腺素β4组和对照组。每组实验动物35只，共105只。

脱毛模型建立：小鼠腹腔注射水合氯醛(0.3 mg/kg)麻醉，参照文献[24]所述，将1∶0.5混合的松香/石蜡加热熔化为胶体状后涂于小鼠背部脊柱两侧对称部位，凝固变硬后连同涂抹处毛发一同揭去达到脱毛效果，脱毛面积 1 cm×2 cm。

给药剂量和给药次数：将胸腺素β4溶液与甘油配置成1∶9膏剂均匀涂抹于小鼠脱毛背部，低剂量胸腺素β4组和高剂量胸腺素β4组给药浓度分别为0.3 μg/50 μL和 3 μg/50 μL，对照组给予等量PBS。于每日8点和20点每隔12 h给药一次(每日共给药2次)。分别于模型建立后6 h， 12 h，1 d，3 d，9 d，11 d，18 d 7个时间点取材。

标本采集：取背部皮肤，于相应时间点取材，用40 g/L多聚甲醛溶液4 ℃固定。24 h后将每个皮肤矢状分为两等份，一份石蜡包埋切片(厚5 μm)，一份用于冰冻切片(厚8 μm)。

苏木精-伊红染色观察：苏木精-伊红常规染色，并在显微镜下观察各时间点皮肤全层、生长期毛囊数目和形态变化，炎细胞浸润及新生毛细血管情况。

β-catenin免疫组化：6 h，12 h，1 d和3 d冰冻切片采用体积分数为3%H₂O₂孵育10 min；0.5%TritonX-100浸泡8 min；体积分数为10%正常驴血清室温封闭45 min。羊抗鼠β-catenin抗体，4 ℃孵育过夜，对照组用PBS替代一抗。生物素标记的驴抗羊IgG(1∶200)室温孵育45 min；链酶亲和素HRP室温孵育45 min；DAB显色，各组切片显色时间均为7 min；苏木精对比染色，常规封固，镜下观察。每组每个标本随机选取2张切片，每张切片随机选取3个不重叠的视野(×400)进行积分吸光度分析。

LEF-1 mRNA原位杂交：6 h，12 h，1 d和3 d石蜡切片脱蜡，体积分数为3%H₂O₂孵育10 min；预杂交37 ℃，1 h；LEF-1寡核甘酸探针杂交液浓度1 mg/L，37 ℃过夜；2×ssc 37 ℃洗3遍，每遍5 min；0.2×ssc 37 ℃洗3遍，每遍3 min；生物素标记的小鼠抗地高辛37 ℃孵育45 min；链酶亲和素HRP酶37 ℃孵育45 min；DAB显色，各组切片显色时间均为5 min；苏木精对比染色，常规封固，镜下观察。每组每个标本随机选取2张切片，每张切片随机选取3个不重叠的视野(×400)进行积分吸光度分析。对照组用阴性探针代替LEF-1杂交探针。

主要观察指标：小鼠背部皮肤颜色变化、毛发生长时间。苏木精-伊红染色镜下皮肤全层、生长期毛囊数目和形态变化。β-catenin免疫组化结果。LEF-1 mRNA原位杂交结果。

统计学分析：由第一作者使用SPSS 20.0进行数据分析。数据采用x(_)±s表示，各组比较使用单因素方差分析， P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

当今社会中，脱发对人群身心健康的影响，越来越受到关注。在市场上，虽然已经开发出多种类型的药物，如雄激素受体拮抗剂，中药何首乌、当归等，但效果都不甚理想，尤其对于男性患者无有效治疗药，很难满足人群的要求。

目前有部分研究提示，胸腺素β4可以通过促进毛囊干细胞分化迁移以促进毛囊再生，为脱发患者带来新的希望。有研究证实，胸腺素β4的三维空间结构图显示在其WH2结构域有actin的结合位点，可以抑制并裂解胞内微丝结构^[26]。在毛囊静止期游离的少量β-catenin被GSK-3β通过泛素蛋白酶体的方式降解^[27]，故静止期胞内游离β-catenin含量少。胸腺素β4可以通过裂解actin的方式间接引起β-catenin含量增加。假设脱毛后在Wnt信号通路的作用下胞内β-catenin的含量开始增加，外源加入的胸腺素β4间接提高了β-catenin在胞内累积的速度，从而可以加快毛囊干细胞的迁移并促进毛囊的生长^[12,28-29]。目前已有最新研究表明，胸腺素家族对于体外培养的人类头发生长周期有调节作用，其中胸腺素β4可以缩短生长期^[30]。

实验采用C57/BL6小鼠作为脱毛模型，是因为其毛发在处于静止期时，皮肤本身为粉红色，而只有在有毛发开始生长时，皮肤才会逐渐变为黑色，随后长出新生毛发，故使用该种类小鼠易于观察不同时间毛发生长情况^[24]。

大体观察发现低剂量胸腺素β4组动物毛发生长明显快于高剂量胸腺素β4组和对照组。苏木精-伊红常规染色可见低剂量组较其他两组毛发生长周期缩短，生长期毛囊数目增加明显。苏木精-伊红染色显示脱毛初期，毛囊形态处于休止期，与Fuchs等^[31]和DasGupta等^[32]对静止期毛囊的组织形态描述一致，毛囊短，与毛乳头接触范围小，二者之间细胞联系疏松，毛乳头细胞小且着色深，毛乳头细胞排列紧密。镜下可见在真皮和皮下脂肪层有一定数量的炎细胞浸润。实验第3天可见毛囊增长并向下生长，毛囊末端基质细胞开始逐渐包绕毛乳头细胞，对比文献所述说明毛囊开始进入生长期初期，此阶段应该有毛乳头对毛囊基质细胞外源性信号的诱导产生^[31]。毛乳头细胞体积较原来增大，说明毛乳头细胞被激活并开始活跃。实验第9天处于生长期毛囊末端毛球部向下延伸至皮下组织深层，毛球部毛乳头完全被基质细胞包绕，体积大且着色变浅，此时可见基质细胞内有明显的黑色素形成, 新生毛发明显可见，皮下组织有新的小血管形成，这与胸腺素β4对血管新生的促进作用有关，通过对皮下结缔组织毛细血管新生的诱导作用^[33]，提供毛囊干细胞分化、毛囊基质细胞合成角蛋白的营养物质。脱毛后第18天，低剂量胸腺素β4组毛乳头体积缩小，部分毛球远端基质细胞退化，毛囊下端和毛乳头由皮下组织深层向真皮层移动，黑素生成减少，提示毛囊生长进入退行期^[31]。而高剂量胸腺素β4组和对照组组织切片显示，毛囊所处生长阶段比同一时间低剂量组滞后。

免疫组织化学染色、原位杂交和积分吸光度分析提示低剂量胸腺素β4可以明显促进β-catenin和LEF-1 mRNA的表达，缩短毛发生长周期从而促进毛囊再生。目前已知有较多因素影响毛囊干细胞迁移和分化。其中在毛发生长初期被激活的Wnt-β-catenin信号通路对干细胞的激活、分化过程起重要作用^[34-35]。Wnt信号未被激活时，β-catenin与GSK-3β、APC蛋白和Actin形成复合物。复合物中的GSK-3β磷酸化β-catenin N端的关键残基，磷酸化的β-catenin被β-TrCP识别进而被泛素化，β-catenin粘着力降低。当Wnt蛋白与Wnt受体结合并将其激活后，活化Dsh蛋白，激活的Dsh阻断GSK-3β的活性，使β-catenin避免被磷酸化^[27]，继而阻止了β-TrCP介导的泛素化，使β-catenin从复合物中解离并在胞浆内保持稳定积累。之后其进入细胞核与DNA结合蛋白LEF-1形成复合物，作用于毛发角质基因的直接上游调控者DLX3，激活毛发角质基因，促进毛发生长^[23]。

在研究中发现，各组组织胞浆内β-catenin含量在脱毛初期较低，以后逐渐积累并在1 d时达到最大表达量，3 d时较1 d时含量减低。低剂量组皮肤组织细胞内β-catenin表达从脱毛后6 h开始积累，各时间点含量均高于高剂量胸腺素β4组和对照组。虽然低剂量胸腺素β4组3 d时含量也同样减低，但始终保持高于其他两组的水平，β-catenin确实与毛发生长周期缩短相关。两个不同剂量实验组对胞内β-catenin的表达影响结果不一致，低剂量胸腺素β4对毛囊再生有促进作用，高剂量胸腺素β4作用不甚明显，其机制需进一步研究证实，猜测可能与激活胸腺素家族作用的其他调节通路有关^[30]。

LEF-1为β-catenin下游启动的核内DNA结合蛋白。以往的研究多集中于β-catenin上，对LEF-1机制的研究尚未完善。本实验另外一个研究重点主要在外源性给予胸腺素β4后，观测毛囊细胞内LEF-1 mRNA的转录情况，希望揭示其在毛囊再生过程中可能启到的作用。本实验中，LEF-1 mRNA的原位杂交结果显示阳性部位多出现在毛囊隆突部和内根鞘处细胞内，低剂量胸腺素β4组与高剂量胸腺素β4组和对照组差异有显著性意义。低剂量胸腺素β4组LEF-1 mRNA随时间增加逐渐累积，在3 d时依然存在增长趋势；而高剂量胸腺素β4组和对照组在3 d时其表达量趋于稳定，提示低剂量胸腺素β4可以增加并延长LEF-1 mRNA的表达促进毛囊再生。DasGupt等^[32]研究表明，LEF-1在毛囊基质细胞中含量最多，在核内和胞浆中均有表达。以往关于Wnt信号通路对毛囊作用的研究多集中于其关键因子β-catenin上，对于β-catenin相互作用的LEF-1研究并不完善。Behrens等^[36]和Roose等^[37]研究表明LEF-1只有与β-catenin结合，此复合物才可被激活。而β-catenin如何激活LEF-1的机制仍有争议。Tutter等^[38]认为β-catenin与LEF-1/TCF形成复合的转录因子发挥其信号传导作用。而Chan等^[39]认为β-catenin选择性地与LEF-1/TCF相结合，将复合物从核内转运至胞浆内被活化。β-catenin甚至不一定促进LEF-1/TCF激活，Zorn等^[40]认为HMG-box-Containing Sox protein可与β-catenin发生物理相互作用，之后可抑制LEF-1/TCF活性。

本实验β-catenin和LEF-1 mRNA在6 h、12 h和1 d、 3 d四个关键时间点进行了测定，不能完全体现二者在整个毛发生长周期的变化情况。若要进一步证实胸腺素β4对Wnt信号通路的影响进而对毛囊干细胞的迁移分化产生作用，还需检测更多指标，如K-15，VEGF，TGF-β，CyclinD1，CDK4，并证明毛囊隆突部高表达β-catenin和LEF-1 mRNA的细胞是毛囊干细胞，需要进一步的体外细胞实验。另外，本实验结果提示高剂量胸腺素β4对于毛囊再生没有明显的作用，目前没有实验观察到这一现象，其内在原因需要进一步探讨。

综上所述，实验初步证实了胸腺素β4可以通过Wnt通路，促进β-catenin和LEF-1 mRNA表达继而缩短毛发生长周期，促进毛囊再生，希望能够为临床药物研究提供新思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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