全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性及优势

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.10.002

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (10): 1484-1489.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.10.002

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全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性及优势

李双月，戚媛，陈若琳，王哲敏，刘爽，朴丰源

大连医科大学劳动卫生与环境卫生学教研室，辽宁省大连市 116044

出版日期:2014-03-05 发布日期:2014-03-05
通讯作者: 朴丰源，博士，教授，大连医科大学劳动卫生与环境卫生学教研室，辽宁省大连市 116044
作者简介:李双月，女，1978年生，黑龙江省哈尔滨市人，汉族，2009年中国科学院化学物理研究所毕业，博士，讲师，主要从事干细胞和神经毒理学研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81102160，81273038)

Biological characteristics and superiority of rat bone marrow mesenchymal stem cells isolated and cultured using whole bone marrow adherence method

Li Shuang-yue, Qi Yuan, Chen Ruo-lin, Wang Zhe-min, Liu Shuang, Piao Feng-yuan

Department of Occupational and Environmental Health, Dalian Medical University, Dalian 116044, Liaoning Province, China

Online:2014-03-05 Published:2014-03-05
Contact: Piao Feng-yuan, M.D., Professor, Department of Occupational and Environmental Health, Dalian Medical University, Dalian 116044, Liaoning Province, China
About author:Li Shuang-yue, M,D., Lecturer, Department of Occupational and Environmental Health, Dalian Medical University, Dalian 116044, Liaoning Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81102160, 81273038

摘要/Abstract

摘要：

背景：骨髓来源的间充质干细胞含量极低，体外纯化、扩增活性好、分化潜能高的骨髓间充质干细胞，对进一步研究至关重要。
目的：进一步验证全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化骨髓间充质干细胞的生物学特性、表型及多向分化潜能。
方法：通过全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞，进行形态学观察，流式细胞仪检测细胞标记物表达，分别进行成骨、成脂诱导分化。
结果与结论：成功纯化、扩增了高细胞活性、高分化潜能的骨髓间充质干细胞。所得细胞呈成纤维细胞样；表达CD29、CD90，不表达CD45；成骨、成脂诱导分化后，茜素红染色、油红O染色阳性。证实全骨髓贴壁法操作简单、对细胞活性损伤小，可以得到高纯度、高活性、高分化潜能、生物学形态和特征稳定的骨髓间充质干细胞。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 骨髓间充质干细胞, 骨髓贴壁法, 细胞培养, 成骨诱导, 成脂诱导, 鉴定, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Bone marrow mesenchymal stem cells are rare in vivo. It is important to purify, proliferate and differentiate bone marrow mesenchymal stem cells in vitro for further research.
OBJECTIVE: To evaluate the biological characteristics, phenotype and multiple differentiation potential cultivation of bone marrow mesenchymal stem cells that are isolated, cultured and purified using the whole bone marrow adherence method.
METHODS: Bone marrow mesenchymal stem cells were isolated, purified and cultured by the whole bone marrow adherence method. Morphological observation and flow cytometry determination of cell surface markers were performed. Osteogenic and adipogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells was induced.
RESULTS AND CONCLUSION: We successfully purified and proliferated bone marrow mesenchymal stem cells with high cell viability and differentiation ability. Fibroblast-like cells were harvested, expressing CD29 and CD90, but not CD45. Following osteogenic and adipogenic induction, cells were positive for oil red O staining and alizarin red staining. The whole bone marrow adherence method is easy to operate, has little impact on cell viability, and can be used to harvest high-purification bone marrow mesenchymal stem cells with high cell viability and differentiation ability.

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Key words: stem cells, mesenchymal stem cells, cells, cultured

中图分类号:

R394.2

李双月，戚媛，陈若琳，王哲敏，刘爽，朴丰源. 全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性及优势[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(10): 1484-1489.

Li Shuang-yue, Qi Yuan, Chen Ruo-lin, Wang Zhe-min, Liu Shuang, Piao Feng-yuan. Biological characteristics and superiority of rat bone marrow mesenchymal stem cells isolated and cultured using whole bone marrow adherence method[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(10): 1484-1489.

图/表（结果） 3

2.1 骨髓间充质干细胞的形态学观察

原代细胞形态：骨髓细胞初始分离时，大小不一，多数细胞呈圆形或椭圆形；接种培养初期悬浮于培养液中，4-6 h后细胞开始出现细小突起；24 h后全量换液，可见部分细胞已经贴壁，呈短梭形、多角形等多种形态(图1A)；四五天后部分细胞形成散在集落，细胞突起变长、变大，并且长短不一、粗细不均(图1B)；10 d左右细胞集落相互靠近融合成片，细胞间相互紧密贴附生长，同向排列(图1C)。

传代细胞形态：细胞传代后生长速度明显加快，24 h后基本所有细胞完全贴壁；培养细胞传至第3代后为多角形、梭形，形态均一，呈漩涡状或簇状有序排列(图1D)；细胞生长代谢旺盛，接种后三四天即可行下一次传代扩增。

2.2 骨髓间充质干细胞表面标志物检测 流式检测结果显示，骨髓间充质干细胞的特异性表面标志物CD29和CD90均呈阳性表达，表达阳性率分别为90.10%和96.61%；CD45为阴性表达，表达率仅为0.40%(图2)。提示，培养的第3代贴壁细胞的表面标志物表达情况符合骨髓间充质干细胞的特点。

2.3 骨髓间充质干细胞成骨诱导分化结果 骨髓间充质干细胞经成骨诱导分化培养基培养18 d后，细胞间间隙加大，细胞普遍呈现方形、五角形，失去原有的长梭形及多角形形态，有些区域细胞轮廓不清，呈现细碎颗粒样、扁平样，细胞透光性差。对照孔内细胞密集排列，呈长梭形、多角形，细胞轮廓清晰，折光性强。茜素红染色后可见，对照孔内颜色苍白，未观察到着色区域；实验孔内细胞呈现广泛的橙红色，有明显的矿化结节形成(图3A，C)。

2.4 骨髓间充质干细胞成脂诱导分化结果 骨髓间充质干细胞加入成脂诱导剂后18 d，对照孔细胞仍呈现长梭形、多角形；实验组细胞密度减低，细胞间空隙增大，可见圆形高亮细胞，有些椭圆形细胞内可见呈串珠样排列分布的脂样小滴，脂滴变大并合并呈串珠状。油红O染色后，对照组未见着色，而实验组出现较多强阳性成脂细胞，其特征为细胞体积较大、呈圆形、内含鲜红色串珠样或大的融合脂滴(图3B，D)。

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引言

自Friendenstein在1976年首次发现并证实骨髓中存在一种纺锤形、可贴壁生长的成纤维细胞集落后，众多研究者针对这一发现开展了大量的研究，陆续证实这些细胞能促进造血细胞克隆形成，并具有自我更新能力和多向分化潜能，可分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞。直至1991年，Caphan把这些具有一致黏附能力，在体外能高度扩增、并多向分化的细胞命名为骨髓间充质干细胞。
间充质干细胞除了存在于最早发现的骨髓中，还能够从脂肪、滑膜、骨骼、肌肉、肺、肝、胰腺等组织以及羊水、脐带血中分离和制备间充质干细胞。目前，骨髓来源的间充质干细胞应用最多、研究最深入。
骨髓间充质干细胞的多向分化潜能最初是发现于HLA相合的异基因骨髓移植动物模型中，受体动物尸解后发现其双肺存在广泛骨化。研究发现，移植到新生鼠侧脑室的间充质干细胞可转移至海马、纹状体等部位，并分化为神经干细胞核神经细胞，这提示间充质干细胞不仅能分化为间充组织，还具有更广泛的多向分化潜能。之后，研究者们陆续证实，在一定的诱导条件下，间充质干细胞可分化为骨、软骨、神经、肌肉、韧带、肝、心肌、内皮等多种胚层细胞^[1-2] 。
由于骨髓间充质干细胞具有来源方便、扩增迅速、可塑性强、离成熟细胞近和多向分化潜能，并且异体移植时不会出现免疫排斥反应^[3-4] ，这些特点使其成为组织工程和细胞移植的重要细胞来源。临床上主要用于治疗机体无法自然修复的组织细胞和器官损伤的难治性疾病；作为免疫调节细胞，治疗免疫排斥和自身免疫性疾病。间充质干细胞的最初临床研究是1995年Lazarus等人进行的，他们收集缓解期血液肿瘤患者的自体间充质干细胞，在体外扩增培养4-7周，然后再静脉注射入患者体内，患者分别被给予不同剂量的间充质干细胞，移植后没有观察到毒副作用，提示其用于移植治疗安全可靠。随后间充质干细胞的临床报道逐渐增多，病种涉及放疗及化疗后造血重建、移植物抗宿主病、心脏系统疾病、肝脏系统疾病、肺脏系统疾病、神经系统疾病及骨骼外伤、肿瘤等，为这些疾病的治疗提供了一条全新的治疗方案^[5-9] 。
然而自体间充质干细胞的应用过程中逐渐暴露了不便之处，例如扩增能力个体差异很大、潜在的肿瘤细胞污染风险、培养需要一定的时间、不能及时适应病情的需要等，这些制约了自体间充质干细胞的使用。2004年，Le Blanc等报道了首例半相合异基因间充质干细胞移植治疗移植物抗宿主病获得成功，其后又报道了异基因配型不合的间充质干细胞移植治疗移植物抗宿主病的有效性，并且认为在应用间充质干细胞治疗移植物抗宿主病不需要严格的配型，其后又有多篇异基因未经配型的间充质干细胞治疗移植物抗宿主病、促进造血重建的报道。目前，美国FDA已批准了60余项临床试验，主要包括造血干细胞移植、自身免疫性疾病、神经系统、肝脏、心脏等组织损伤的修复和作为基因治疗的载体等方面。
然而不论是自体或者异体来源的骨髓间充质干细胞，骨髓间充质干细胞的含量仅占有核细胞总数的0.001%-0.1%^[10] ，必须在体外进行分离培养和扩增后才能用于研究及应用。如何建立一种简便、快速、可靠、稳定的培养方法，从而获得大量活性好、纯度高、分化潜能强的骨髓间充质干细胞对下一步研究显得至关重要，是组织工程、细胞移植等的必需基础。实验应用全骨髓贴壁法，利用细胞间黏附特性的不同，对大鼠骨髓间充质干细胞进行分离、纯化和扩增，并观察其生物学特性和分化潜能，以期为进一步深入研究提供可靠的细胞来源。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：细胞生物学实验。

时间及地点：2012年9至2013年6在大连医科大学劳动卫生与环境卫生学实验室开展相关实验。

材料：4-6周龄SD大鼠，体质量120-150 g，由大连医科大学动物中心提供，许可证号：SCKK(辽)2002-0002。实验大鼠相关处置在《关于善待实验动物的指导性意见》的指导下进行^[11]。

方法：

骨髓间充质干细胞的原代培养：大鼠脱臼处死，体积分数75%乙醇浸泡5 min，无菌分离股骨、胫骨，清除附着的肌肉组织，暴露骨髓腔并用PBS反复冲洗，收集细胞冲洗液并过筛网制成单细胞悬液，离心收集骨髓细胞，用含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液重悬细胞，混匀后以2×10⁹/cm²的细胞密度接种于培养皿中，放入37 ℃、CO₂培养箱中静止培养。

骨髓间充质干细胞的传代、扩增：原代接种后，静置培养，24 h后首次全量换液，以后每3 d全量换液。待细胞生长至80%-90%融合时，胰酶消化，按1∶3的比例传代培养。

骨髓间充质干细胞的形态学观察：倒置显微镜下，观察细胞形态及生长状况变化并记录。

骨髓间充质干细胞鉴定：

细胞表面标志物检测：选取第3代生长状态良好的细胞，胰蛋白酶室温消化，1 000 r/min离心5 min收集细胞，PBS清洗细胞并过200目筛网制成单细胞悬液。各管样本分别加入FITC-CD29、PE-CD90和PE-CD45的单克隆抗体，同时设立同型阴性对照，4 ℃避光孵育，用流式细胞仪进行检测。

体外诱导分化：选用第3代生长状态良好的骨髓间充质干细胞，按2×10⁸ L^-¹细胞浓度接种于6孔培养板，待细胞长至80%-90%融合时，在各诱导孔分别加入1 mL下列诱导培养基：①SD大鼠骨髓间质干细胞成脂诱导分化培养基。②SD大鼠骨髓间质干细胞成骨诱导分化培养基，各诱导分化孔3 d全量换液1次，以不含诱导培养基的细胞培养孔作为对照。各组6复孔，每日镜下观察细胞形态。成脂诱导分化18 d后进行油红O染色，成骨诱导分化21 d后进行茜素红染色。

主要观察指标： ①倒置显微镜观察骨髓间充质干细胞形态。②流式细胞仪技术检测细胞表面标志物的表达情况。③培养的骨髓间充质干细胞进行脂肪细胞诱导分化和油红O染色鉴定成脂分化潜能。④培养的骨髓间充质干细胞进行成骨细胞分化和茜素红染色鉴定成骨分化潜能。

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讨论

骨髓间充质干细胞体外培养体系主要包括：①全骨髓贴壁法。②密度梯度离心法。③流式细胞仪分选法。④免疫磁珠法。密度梯度离心法可根据细胞密度的不同提取出单核细胞进行培养，但操作较繁琐，且同时亦破坏了骨髓间充质干细胞的生长微环境；流式细胞仪分选法和免疫磁珠分离法虽可获得纯度较高的骨髓间充质干细胞，但对细胞活性有较大损伤，且价格昂贵，难以普及，存在一定的局限性^[11-12] 。
全骨髓贴壁法是根据骨髓间充质干细胞的贴壁特性，通过定期换液从而去除骨髓中的不贴壁细胞或贴壁性能较弱细胞的一种分离方法^[12-22] 。此种方法筛选出的骨髓间充质干细胞活性高，损伤小，而且保留的骨髓中的其他干细胞和基质细胞能分泌多种生长因子和细胞外基质，充分模拟体内微环境，促进骨髓间充质干细胞贴壁生长，使得骨髓间充质干细胞在保持自身未分化特性的前提下，能够较快适应体外培养环境，细胞增殖迅速[23]。要获得较大数量、活性较高、未分化性能较强的骨髓间充质干细胞，全骨髓贴壁法显然更为可取^[24-33] 。
实验利用全骨髓贴壁法分离、纯化和培养了大量骨髓间充质干细胞，细胞培养至第3代时，可得到活性良好、形态均一、较高纯度的骨髓间充质干细胞。由于骨髓间充质干细胞缺乏典型的形态学特征，单凭光镜下的形态学观察很难进行鉴别，而且骨髓间充质干细胞没有特异性的表面标志物^[34] ，对骨髓间充质干细胞的鉴别尚无统一标准。
目前，通常利用流式细胞仪技术通过检测表面分子CD表型表达与否来判断是否为骨髓间充质干细胞^[35-36] 。骨髓间充质干细胞属于非造血谱系干细胞，不表达CD10、CD31、CD14，CD34和CD45等造血谱系表面分子标志，其表达阳性的表面标志物有CD13、CD29、CD44、Cd54、CD71、CD90、CD105、CD106、SH2、SH3和SH-4等表面分子^[37-38] 。
本实验经流式检测发现，在未添加任何诱导剂的情况下，全骨髓贴壁法培养制备的第3-5代细胞能够较稳定、均一地表达细胞表面抗原CD29和CD90，几乎不表达CD45，证实利用本方法可制备纯度较高的骨髓间充质干细胞细胞群^[39] 。
除检测细胞表面标志物外，本实验还分别将培养的骨髓间充质干细胞向成骨和成脂两个方向分化以进行分化潜能的检测。结果显示，在诱导分化过程中，分别诱导出成脂细胞、成骨细胞的标志——脂肪滴和钙化结节，证实本方法培养的骨髓间充质干细胞具有成脂和成果多向分化潜能。
在利用骨髓贴壁法分离、培养骨髓间充质干细胞的实验过程中，要获得活性好、纯度高、未分化性能保持良好的骨髓间充质干细胞，有以下细节需要注意：①避免交叉污染。要进行严格的无菌操作，尤其是暴露骨髓腔前要及时更换器械，避免动物取材和分离骨髓细胞间的交叉污染。②培养液中要添加L-谷氨酰胺。培养液4 ℃储藏2周以上时，注意要再次添加L-谷氨酰胺，否则氮源不足会影响细胞生长。③冲洗大鼠的股骨和胫骨骨髓腔时，应缓慢、轻柔冲洗，力度不要太大，次数不应太多, 以免影响细胞活性。④骨髓间充质干细胞在培养数小时内即可牢固贴壁，因此24 h后可以首次换液。换液前轻轻吹打瓶壁，这样可以有效去除悬浮杂质和贴壁不牢的细胞，提高获得的细胞纯度。⑤在早期几代的传代过程中，适当加大细胞的接种密度，使细胞较快增殖，以缩短骨髓间充质干细胞纯化时间。如此，一般传到第3代时即能得到纯化度很高的骨髓间充质干细胞。
刘贤华等^[40]采用60Co照射处理的培养瓶结合全骨髓贴壁法分离培养获得高纯度贴壁生长的骨髓间充质干细胞，方法简单易行，细胞增殖快，活性好，传代力持久，可以收获大量、高纯度的间充质干细胞。曾瑞霞等^[41]联合应用密度梯度离心法及贴壁筛选法成功分离骨髓间充质干细胞,且效率高、纯度高，48 h首次半量换液更适合骨髓间充质干细胞的生长繁殖。张君红等^[42]观察全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特征，细胞表型检测结果CD29⁺和CD44⁺阳性， CD34⁺和CD45⁺为阴性，经成骨、成脂诱导分化后证实具有向成骨、成脂分化多向分化的潜能^[43] ，符合国际细胞治疗学会间充质及组织干细胞委员会提出的鉴定动物来源骨髓间充质干细胞的最低标准。盛瑾等^[44]采用全骨髓法分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞，并传代、纯化和扩增细胞。经流式细胞仪检测第4代细胞膜表面抗原CD45、CD90、CD29阳性率分别为1.50%，99.18%，97.70%。证实全骨髓贴壁法能有效得到分离纯化的大鼠骨髓间充质干细胞，切细胞生长稳定，增殖能力活跃，具有骨髓间充质干细胞的一般生物学特性。
综上所述，全骨髓贴壁法是一种快速可靠、简便稳定的骨髓间充质干细胞培养体系^[40-63] ，可以得到高纯度、高活性、高分化潜能、生物学形态和特征稳定的骨髓间充质干细胞，为骨髓间充质干细胞的进一步研究和应用提供了良好的基础。

全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性及优势

Biological characteristics and superiority of rat bone marrow mesenchymal stem cells isolated and cultured using whole bone marrow adherence method

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