羧甲基壳聚糖冲洗液预防大鼠术后腹膜粘连

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.08.017

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (8): 1250-1256.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.08.017

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羧甲基壳聚糖冲洗液预防大鼠术后腹膜粘连

崔娟娟，冯占芹，张守强，郑增娟，张维芬

潍坊医学院药学与生物科学学院药剂学教研室，山东省潍坊市 261053

收稿日期:2013-12-08 出版日期:2014-02-19 发布日期:2014-02-19
通讯作者: 张维芬，硕士生导师，博士，教授，潍坊医学院药学与生物科学学院药剂学教研室，山东省潍坊市 261053 通讯作者：郑增娟，硕士，讲师，潍坊医学院药学与生物科学学院药剂学教研室，山东省潍坊市 261053
作者简介:崔娟娟，女，1986年生，山东省滨州市人，汉族，2014年潍坊医学院毕业，硕士，主要从事药物新剂型与新生物材料方面的研究。
基金资助:
国家科技部科技计划项目(2013GA740103)；山东省自然科学基金(ZR2012CM025)；山东省科技攻关项目(2012YD 18063)；山东省高等学校科技计划项目(J11LF67)；山东省卫生厅计划项目(2011HZ115)；山东省潍坊市科技计划项目(20121232)；山东省中医药管理局项目(2013-241)

Preventive effect of carboxymethyl chitosan solution on postoperative peritoneal adhesions in a rat model

Cui Juan-juan, Feng Zhan-qin, Zhang Shou-qiang, Zheng Zeng-juan, Zhang Wei-fen

Department of Pharmaceutics, Pharmacy and Biological Science College, Weifang Medical University, Weifang 261053, Shandong Province, China

Received:2013-12-08 Online:2014-02-19 Published:2014-02-19
Contact: Zhang Wei-fen, M.D., Master’s supervisor, Professor, Department of Pharmaceutics, Pharmacy and Biological Science College, Weifang Medical University, Weifang 261053, Shandong Province, Corresponding author: Zheng Zeng-juan, Master, Lecturer, Department of Pharmaceutics, Pharmacy and Biological Science College, Weifang Medical University, Weifang 261053, Shandong Province, China
About author:Cui Juan-juan, Master, Department of Pharmaceutics, Pharmacy and Biological Science College, Weifang Medical University, Weifang 261053, Shandong Province, China
Supported by:
the National Key Technology R&D Program of the Ministry of Science and Technology, No. 2013GA740103; the Natural Science Foundation of Shandong Province, No. ZR2012CM025; the Scientific Tackle Key Program of Shandong Province, No. 2012YD 18063; A Project of the Higher Educational Science and Technology Program of Shandong Province, No. J11LF67; A Project of the Health Department of Shandong Province, No. 2011HZ115; A Project of Weifang Science and Technology of Shandong Province, No. 20121232; A Project of Administration of Traditional Chinese Medicine of Shandong Province, No. 2013-241

摘要/Abstract

摘要：

背景：开腹手术后常造成腹膜粘连，给患者带来极大的痛苦，至今仍没有发现一种有效的药物或方法能够完全预防腹膜粘连，羧甲基壳聚糖是具有优良生物相容性和生物降解性，是理想的预防腹腔粘连的生物材料。
目的：研究羧甲基壳聚糖防粘连冲洗液预防大鼠术后腹膜粘连的效果，探讨其防粘连的作用机制。
方法：取56只成年雄性Wistar大鼠建立盲肠刮伤/腹壁缺损的动物手术模型，随机分为4组，分别以生理盐水、医用透明质酸、医用几丁糖和羧甲基壳聚糖防粘连冲洗液涂布于盲肠刮伤面及腹壁缺损处。术后2，3周进行粘连分级和病理组织观察，同时测定转化生长因子β1表达、血液中白细胞数量及羟脯氨酸含量。
结果与结论：透明质酸组、几丁糖组粘连分级评分结果优于生理盐水组(P < 0.05)，羧甲基壳聚糖组粘连分级评分结果明显优于生理盐水组(P < 0.01)。血常规、苏木精-伊红染色和转化生长因子β1免疫组织化学染色结果显示，羧甲基壳聚糖防粘连冲洗液与医用透明质酸和医用几丁糖一样具有较好的组织相容性，可通过降低转化生长因子β1的表达、减少羟脯氨酸的合成，抑制腹腔粘连发生的程度和范围。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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关键词: 生物材料, 材料相容性, 羧甲基壳聚糖, 几丁糖, 透明质酸, 冲洗液, 预防, 腹膜粘连, 山东省自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: The patients are suffering from peritoneal adhesions that are caused after abdominal operation. As so far, there is still no effective drug or method that can completely prevent peritoneal adhesions. Carboxymethyl chitosan is a biocompatible and biodegradable biomedical material with anti-adhesion effects, which is an ideal biomaterial for prevention of peritoneal adhesion theoretically.
OBJECTIVE: To investigate the novel anti-adhesion properties of carboxymethyl chitosan anti-adhesion solution on the prevention of postsurgical adhesion in vivo in a rat model.
METHODS: Fifty-six adult male Wistar rats were randomly divided into four groups: 0.9% normal saline solution (group A), hyaluronic acid gels (group B), medical chitosan gels (group C) and carboxymethyl chitosan anti-adhesion solution (group D). The model of postoperative intestinal adhesion was established by making cecal scratches/abdominal wall defects. All the rats were scarified after 2 or 3 weeks. Whole blood was collected by cardio-puncture, lung tissue and tissue adhesion were stripped. The incidence and degree of adhesions, histological effects, expression of transforming growth factor-β1 (TGF-β1), the amounts of hydroxyproline and white blood cells were observed.
RESULTS AND CONCLUSION: The formation of postsurgical adhesions in groups B, C and D was significantly decreased, which was lighter than that of group A (P < 0.05). Furthermore, the adhesion formation in group D was significantly decreased in comparison with group A (P < 0.01). At the same time, the levels of transforming growth factor-β1, hydroxyproline and white blood cells in group D were lighter than those of group A (P < 0.05), and the histopathological results indicated that a marked reduction in inflammatory cells and fibroblasts. Carboxymethyl
chitosan anti-adhesion solution can effectively reduce the degree and incidence of postoperative adhesion, and it is becoming a promising drug delivery system in the context of postsurgical anti-adhesion.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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Key words: biocompatible materials, chitosan, hyaluronic acid, tissue adhesions

中图分类号:

R318

崔娟娟，冯占芹，张守强，郑增娟，张维芬. 羧甲基壳聚糖冲洗液预防大鼠术后腹膜粘连[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(8): 1250-1256.

Cui Juan-juan, Feng Zhan-qin, Zhang Shou-qiang, Zheng Zeng-juan, Zhang Wei-fen. Preventive effect of carboxymethyl chitosan solution on postoperative peritoneal adhesions in a rat model[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(8): 1250-1256.

图/表（结果） 3

2.1 成功建立大鼠盲肠刮伤/腹壁缺损模型生理盐水组12只大鼠，于术后2周及3周大体观察皆有肠粘连，说明实验的动物肠粘连模型制作成功。大鼠盲肠刮伤/腹壁缺损模型及参考Nair制定的粘连程度5级分类法分级(图1)。

2.2 药效测定和粘连观察在第2周，医用透明质酸组和医用几丁糖组的大鼠分别于6 d和3 d后死亡1只，尸检探查表明死于严重的腹膜炎并有肠麻痹，粘连级别均定为Ⅳ级，剩余大鼠术后均存活，缺失大鼠均予以补足。术后24 h各组大鼠一般状态差，活动量少，进食与饮水较差；术后48 h各组大鼠饮水和进食已基本接近正常。腹部术后第7天各组大鼠伤口愈合好，无切口感染。术后14 d和21 d分别处死动物，生理盐水组大鼠皆有粘连。其余3组大鼠的肠粘连数量少，且程度也较生理盐水组轻，说明3种药物均有预防肠粘连作用。

不同药物处理组在同一时间点和同一药物处理组不同时间点的大鼠腹膜粘连情况通过大体观察，得到如下结果：术后2周及3周，生理盐水组12只大鼠均有粘连，可见盲肠增厚、挛缩变形，与周围肠管及肠系膜之间形成的粘连带多且较粗，需要锐性分离。大鼠粘连肠壁组织进行相关指标检测，其中4只为I级腹腔粘连，2只为Ⅱ级腹腔粘连，2只为Ⅲ级腹腔粘连，4只为Ⅳ级腹腔粘连。羧甲基壳聚糖冲洗液组发生粘连的程度比较轻，盲肠偶见增厚，无挛缩变形，形成的粘连带细小，钝性即可分离，粘连点形成的面积小，16只大鼠中有12只未出现腹腔粘连，2只大鼠为I级腹腔粘连，仅2只为IV级腹腔粘连。医用透明质酸组和医用几丁糖组未形成腹腔粘连的大鼠分别为8只和13只，医用透明质酸组有1只发生了IV级腹腔粘连(提前死亡)，医用几丁糖组有2只发生了IV级腹腔粘连(1只提前死亡)，而且粘连点形成的面积小，盲肠偶见增厚。与生理盐水组比较，

医用透明质酸组、医用几丁糖及羧甲基壳聚糖冲洗液组腹腔内粘连的发生率和粘连程度差异有显著性意义 (P < 0.05)，说明医用透明质酸、医用几丁糖与羧甲基壳聚糖冲洗液均能明显减轻术后腹腔粘连的范围和程度；而医用透明质酸组、医用几丁糖组与羧甲基壳聚糖冲洗液组组间症状评分两两比较，差异无显著性意义(P > 0.05)，表明羧甲基壳聚糖冲洗液能有效防止腹腔粘连。然而，2周时间点羧甲基壳聚糖冲洗液组与生理盐水组粘连水平比较差异有非常显著性意义(P < 0.01)，防粘连效果较医用透明质酸组、医用几丁糖组为优。不同时间点各组大鼠术后腹膜粘连分级评分结果见表1。于第3周解剖大鼠时发现羧甲基壳聚糖冲洗液组多数动物无腹腔粘连，切口愈合良好，表明羧甲基壳聚糖冲洗液在减轻粘连的同时并未影响切口及创面的愈合。

2.3 组织学观察各组病理观察结果(图2)：生理盐水组术后2周时纤维结缔组织明显增生、粘连，胶原纤维排列致密，有渗出及各型粒细胞和巨噬细胞较多；术后3周时炎性细胞浸润，主要为淋巴细胞，形成的炎性组织有渗出物，纤维组织及血管增生。医用透明质酸组术后2周时腹膜炎性细胞浸润明显；术后3周时腹壁增厚，有少量炎性细胞。医用几丁糖组术后2周时可见炎性细胞浸润，纤维结缔组织明显增生；术后3周时为炎性细胞浸润，且多数为淋巴细胞，无纤维组织增生。羧甲基壳聚糖冲洗液组术后2周时纤维结缔组织增生，形成肉芽，可见巨细胞；术后3周时有炎性细胞浸润，但程度较轻，纤维细胞较少。

于术后2周时从各组选取肠壁组织进行转化生长因子β₁的免疫组织化学染色测定，转化生长因子β₁免疫组化染色阳性部位主要位于粘连组织内成纤维细胞，可见细胞质内出现棕黄色颗粒，未见炎症细胞染色。转化生长因子β₁对成纤维细胞具有化学趋化作用，且促进细胞增殖、分化、血管形成，引起许多组织发生纤维化及在引起动物实验腹膜粘连的形成中起关键作用。图3显示生理盐水组可见有较多的棕黄色颗粒，其余3组染色强度较生理盐水组弱。因此，羧甲基壳聚糖冲洗液与医用透明质酸和医用几丁糖皆有降低转化生长因子β₁表达的作用，从而达到减少腹膜粘连形成的程度和范围的作用。

2.4 血常规指标测定测定血液白细胞总数及分类，比较不同药物在预防粘连的同时对血液指标是否产生影响，验证羧甲基壳聚糖外科用手术防粘连冲液是否比其他药物具有较好的组织相容性。对不同时间点肠粘连大鼠的血液分析测定见表2。术后2周结果显示：①白细胞：医用透明质酸、羧甲基壳聚糖冲洗液组与生理盐水组比较差异有显著性意义(P < 0.05)，医用几丁糖组与生理盐水组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，而医用几丁糖组与医用透明质酸组比较差异有显著性意义(P < 0.05)。②中性粒细胞和淋巴细胞：医用透明质酸组与生理盐水组差异有显著性意义(P < 0.05)。③血红蛋白、红细胞和血小板：医用透明质酸组、医用几丁糖组、羧甲基壳聚糖冲洗液组与生理盐水组比较差异无显著性意义(P > 0.05)。医用透明质酸组和羧甲基壳聚糖冲洗液组的白细胞明显低于生理盐水组，说明羧甲基壳聚糖冲洗液与透明质酸一样具有很好的抗炎作用；羧甲基壳聚糖冲洗液组血红蛋白、红细胞、中性粒细胞、淋巴细胞及血小板与生理盐水组比较差异均无显著性意义，

说明应用羧甲基壳聚糖冲洗液对大鼠血液常规指标没有影响，具有较好的组织相容性。术后3周结果显示，医用透明质酸组、医用几丁糖组及羧甲基壳聚糖冲洗液组与生理盐水组比较，各血液指标差异无显著性意义(P > 0.05)，说明羧甲基壳聚糖冲洗液与医用几丁糖及透明质酸一样对大鼠血常规没有影响，组织相容性良好。2.5 粘连组织羟脯氨酸测定术后3周，生理盐水组、医用透明质酸组、医用几丁糖组、羧甲基壳聚糖冲洗液组大鼠粘连组织中羟脯氨酸含量分别为(1.04±0.38)，(0.63±0.19)，(0.50±0.06)，(0.42±0.13) mg/g。经LSD、SNK-q检验，在α=0.05水平，医用透明质酸组、医用几丁糖组、羧甲基壳聚糖冲洗液组与生理盐水组比较差异均有显著性意义(P < 0.05)，但前3组组间比较差异无显著性意义。组织粘连主要取决于胶原的合成，而羟脯氨酸是形成胶原的前体，羟脯氨酸含量多，反映修复过程明显，相应地粘连形成会增多。通过粘连组织中氢脯氨酸含量的测定，表明羧甲基壳聚糖冲洗液能明显减少羟脯氨酸的合成，有效抑制胶原形成，从而降低粘连形成的概率。

参考文献

[1] Yang B,Gong CY,Zhao X,et al.Preventing postoperative abdominal adhesions in a rat model with PEG-PCL-PEG hydrogel.Int J Nanomedicine.2012;7:547-557.

[2] Kutlay J,Ozer Y,Isik B,et al.Comparative effectiveness of several agents for preventing postoperative adhesions.World J Surg.2004;28(7):662-665.

[3] Mulier KE,Nguyen AH,Delaney JP,et al.Comparison of Permacol™ and Strattice™ for the repair of abdominal wall defects.Hernia.2011;15(3):315-319.

[4] Sahin M,Cakir M,Avsar FM,et al.The effects of anti-adhesion materials in preventing postoperative adhesion in abdominal cavity(anti-adhesion materials for postoperative adhesions). Inflamm.2007;30(6):244-249.

[5] Wei CZ,Hou CL,Gu QS,et al.A thermosensitive chitosan-based hydrogel barrier for postoperative adhesions’ prevention. Biomaterials.2009;30(29):5534-5540.

[6] Na NH,Kim IK,Han JH,et al.Synthesis of O-carboxylated low molecular chitosan with azido phenyl group: its application for adhesion prevention.Macromol Res.2010;18(10): 1001-1007.

[7] Lauder CI,Garcea G,Strickland A,et al.Use of a modified chitosan-dextran gel to prevent peritoneal adhesions in rat model.J Surg Res.2011;171(2):877-882.

[8] Muzzarelli RAA,Muzzarelli C.Chitosan chemistry: relevance to the biomedical sciences.Adv Polym Sci.2005;186:151-209.

[9] Francesko A,Tzanov T.Chitin, chitosan and derivatives for wound healing and tissue engineering.Adv Biochem Engin Biotechnol.2011; 125:1-27.

[10] Park SH,Seo SY,Na HN,et al.Preparation of a visible light-reactive low molecular-o-carboxymethyl chitosan (LM-O-CMCS)derivative and applicability as an anti-adhesion agent.Macromol Res.2011;19(9):921-927.

[11] 肖海军,侯春林,薛峰.羧甲基壳聚糖-羧甲基纤维素防粘连膜的制备及其理化特性[J].中国组织工程研究与临床康复,2010, 14(38): 7069-7074.

[12] Jiang LY,Li YB,Xiong CD.A novel composite membrane of chitosan-carboxymethyl cellulose polyelectrolyte complex membrane filled with nano-hydroxyapatite I Preparation and properties. J Mater Sci Mater Med.2009;20(8):1645-1652.

[13] 张紫平,周光文,吴慧萍,等.羧甲基壳聚糖粉防大鼠腹腔粘连的实验研究[J].医学临床研究,2010,27(6):101-104.

[14] Harris ES,Morgan RF,Rodeheaver GC.Analysis of the kinetics of peritoneal adhesion formation in the rat and evaluation of potential antiadhesive agents.Surgery.1995; 117(6):663-669.

[15] Nair SK,Bhat IK,Aurora AL.Role of proteolytic enzyme in the prevention of postoperative intraperitoneal adhesions.Arch Surg.1974;108:849-853.

[16] Belluco C, Meggiolaro F, Pressato D,et al.Prevention of postsurgical adhesions with an autocross linked hyaluronan derivative gel.J Surg Res.2001;100(2):217-221.

[17] Di Filippo C,Petronella P, Freda F,et al.Involvement of the ubiquitin-proteasomesystem in the formation of experimental postsurgical peritoneal adhesions.Mediat Inflamm.2012;19(4): 723-726.

[18] Zhou J,Liwski RS,Elson C,et al.Reduction in postsurgical adhesion formation after cardiac surgery in a rabbit model using N,O-carboxymethyl chitosan to block cell adherence. J Thorac Cardiovasc Surg.2008;135(4): 777-783.

[19] Schneider A,Bennek J,Olsen KO,et al.Experimental study evaluating the effect of a barrier method on postoperative intraabdominal adhesions.Diges Dis Sci.2006;51(3): 566-570.

[20] Yang Z,Han B,Fu D,et al.Acute toxicity of high dosage carboxymethyl chitosan and its effect on the blood parameters in rats.J Mater Sci Mater Med.2012;23(2): 457-462.

[21] 洪欣,沈柏用,韩宝三.羧甲基壳聚糖防粘连粉雾剂的应用及作用机制的研究[J].外科理论与实践,2009,14 (4):426-429.

[22] 周贵,奚延斐,郑裕东,等.三种羧甲基壳聚糖防粘连膜的降解及其生物相容性[J].中国组织工程研究与临床康复,2009,13(8): 1411-1418.

[23] 沈新,李孟彬,王为忠,等.壳聚糖和尿囊素预防外科术后腹腔粘连效果的观察[J].第四军医大学学报,2006,27(12): 1104- 1107.

[24] 胡莎,李亚,孟维杰,等.妇康口服液对大鼠实验性宫腔粘连预防效果及对宫内膜组织TGF-β1, PAI-1和MMP-9表达影响的试验研究[J].四川大学学报:医学版,2013,44(4):540-544.

[25] 潘仕荣,莫家聪,郑欢玲,等.O-羧甲基壳聚糖溶液预防腹膜术后粘连的试验研究[J].生物医学工程学杂志,2009,26(2): 347-350.

[26] 王勇,陈道达,田元,等.腹腔粘连大鼠血清、腹腔灌洗液中IL-6、IL-8及TNF-a的变化[J].华中科技大学学报:医学版,2003,32(2): 194-196.

引言

材料方法

设计：对比观察实验。

时间及地点：于2010年4月至2011年1月在山东潍坊医学院完成。

材料：

实验动物：健康成年雄性 Wistar大鼠56只，体质量 (200±10) g，由山东鲁抗动物中心提供，实验动物许可证号：Slxk鲁20080002号。动物饲养环境为清洁级，称质量后按体质量编号，参照随机数字表随机分为4组：生理盐水组(n=12)、医用透明质酸组(n =12)、医用几丁糖组(n =16)、羧甲基壳聚糖冲洗液组(n =16)。实验过程对动物的处置符合相关动物伦理学要求。

羧甲基壳聚糖冲洗液预防大鼠术后腹膜粘连实验的主要试剂及仪器：
试剂及仪器	来源
医用透明质酸和医用几丁糖(规格：浓度2%，2 mL/支，批号：101074-01)	上海其胜生物制剂有限公司
羧甲基壳聚糖外科手术用防粘连冲洗液(批号：S20101101)	杭州协合医疗用品有限公司
免疫组化试剂盒	北京中杉金桥生物技术有限公司
戊巴比妥钠	中国医药上海化学试剂公司
Centrifuge 5415R离心机	德国Eppendorf公司
BIO-TEK ELX800全自动酶标仪	美国宝特仪器有限公司
DNP9052电热恒温培养箱	嘉兴中新医疗仪器有限公司，中国浙江

实验方法：

大鼠盲肠刮伤/腹壁缺损模型制作：实验手术场所及所用器具严格消毒，全部操作在无菌条件下进行。参考Harris 等^[14]的手术方式建立盲肠刮伤/腹壁缺损的动物手术模型。手术模型制作过程如下：大鼠术前禁食12 h，称质量，用1%戊巴比妥钠4 mL/kg腹腔内注射麻醉，麻醉后仰卧固定于手术台，中下腹部剃毛，体积分数75%乙醇消毒后，无菌操作下取下腹部正中切口，切口长4 cm，逐层入腹。打开腹腔后找到回盲部将其提至切口外，并在盲肠系膜对侧浆膜上用手术刀片挫伤，至盲肠浆膜下有瘀斑，造成面积约2 cm×1 cm 毛糙创面，勿刮破盲肠壁。在距切口右侧约1 cm处，挫伤腹膜至肌层，造成面积约2 cm×1 cm 的腹壁毛糙面，将挫伤盲肠与腹壁缺损处两者相对放置，使其相互接触。动物腹膜粘连模型制作成功后，关腹前，按分组不同分别将生理盐水、医用透明质酸、医用几丁糖凝胶剂和羧甲基壳聚糖冲洗液涂布于盲肠刮伤面及腹壁缺损处，用药剂量为5 mL。用手术缝合线缝合切口，逐层关闭腹腔。术后大鼠在动物房分笼饲养，禁食12 h，自由饮水，饲料均为同种大鼠颗粒饲料。

粘连分级：于术后2，3周分别用1%戊巴比妥钠麻醉大鼠，剂量同模型制作。每个时间点生理盐水组、医用透明质酸组每组6只，医用几丁糖组、羧甲基壳聚糖冲洗液组每组8只，麻醉后仰卧固定于手术台上，腹部取“U”形切口开腹，参考Nair^[15]制定的5级分类法进行粘连程度分级：0级，完全无粘连；I级，内脏间或内脏与腹壁间一条粘连带；II级，内脏间或内脏与腹壁间二条粘连带；Ⅲ级，多于二条粘连带，而内脏未直接粘连到腹壁；IV级，内脏直接粘连到腹壁，而不管粘连带多少。

药效测定：分别于术后2，3周(每个时间点生理盐水组、医用透明质酸组每组6只，医用几丁糖组、羧甲基壳聚糖冲洗液组每组8只)处死全部大鼠，腹部取“U”形切口开腹，肉眼观察不同药物处理组在同一时间点和同一药物处理组不同时间点的大鼠腹膜粘连情况，根据Belluco等^[16]的评分方法，计算总分。

Belluco粘连部位特征分类及评分表：
粘连面积	记分	粘连物血管生长程度	记分	粘连物韧性	记分
0	0	无粘连	0	无粘连	0
<25%	1	薄膜，透明，无血管	1	粘连本身易分离	1
<50%	2	不透明，或半透明，无血管	2	粘连可牵引分离	2
<75%	3	不透明，存在毛细血管	3	粘连需利器分离	3
<100%	4	不透明，存在大的血管	4

苏木精-伊红染色显微观察：大鼠心脏取血后，用眼科剪刀、镊子取出粘连肠壁组织浸入体积分数4%甲醛溶液固定。经过乙醇梯度脱水，石蜡包埋，切片，进行苏木精-伊红染色。观察浆膜创伤面修复情况、肠管壁炎症及纤维沉积等。

转化生长因子β₁免疫组织化学观察：按SP-9001二步法进行免疫组织化学染色。SC-146，阳性对照。转化生长因子β₁位于胞浆内，阳性细胞为细胞质内出现棕黄或棕褐色颗粒，结果用Axiotron研究型显微镜观察。

血常规检查：打开各组大鼠胸腔，暴露心脏，立即心脏取血5 mL，置于抗凝管中，全自动血液分析仪测定血中白细胞总数及分类。

粘连组织羟脯氨酸含量测定：术后3周动物处死后，粘连组织取自盲肠与腹壁粘连之处。若盲肠与腹壁无粘连，则取起源于腹内其他器官的粘连带。若未发生腹膜粘连，则取经手术损伤后愈合处组织。将从各组收取的粘连组织冻存于-20 ℃冰箱，备用。采用氯胺T法测定，按如下步骤进行：取粘连组织100-200 mg，称质量，剪碎，放入10 mL空安瓿瓶中，加入6 mol/L盐酸2 mL，喷灯封口，置于 130 ℃烘箱中裂解3 h。开封口后加入6 mol/L氢氧化钠 0.2 mL调节pH值，加双蒸水7.8 mL，使安瓿瓶内液体总量达10 mL，过滤，取续滤液、标准液及双蒸水各1 mL，加人柠檬酸缓冲液0.5 mL及0.05 mol/L氯化胺T 1 mL，6 min后再加入3.15 mol/L高氯酸1 mL，终止反应5 min后加入0.67 mol/L P-DMAB甲醇液1 mL，置80 ℃水浴中显色 10 min后置冰浴中冷却，在30 min内测定分光光度计A值。羟脯氨酸含量依据下列公式计算：

主要观察指标：各组粘连分级和病理组织、血液中白细胞数量及羟脯氨酸含量。

统计学分析：全部数据采用SPSS 13.0统计软件包进行统计分析，正态分布数据用x(_)±s表示。各组样本均先进行方差齐性检验，若方差齐同，采用单因素方差分析(One Way ANOVA)，各组间显著性检验采用LSD检验，显著性检验水准α取双侧0.05，即P < 0.05为差异有显著性意义的标准。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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临床术后粘连的形成是由外科手术创伤引起，导致过多的纤维蛋白沉积，造成纤维蛋白沉积和降解失平衡。诸多因素如成纤维细胞，胶原纤维，间皮细胞等都可导致粘连形成，可通过测定肿瘤坏死因子α、白细胞介素1、白细胞介素6、转化生长因子β₁及转化生长因子β₃等指标水平来监测粘连发生的程度和范围^[17]。不同的动物模型如心脏手术损伤模型^[18]，改良家兔侧壁模型或盲肠挫伤模型等^[19-20]，用来评价不同药物和材料对手术损伤部位具有预防术后粘连的效果。考虑到经济、简单、重复及粘连可能发生于手术直接或间接损伤的部位，实验建立大鼠盲肠刮伤/腹壁缺损模型，对术后各时间点粘连形成的观察表明，术后2周及3周生理盐水模型组大鼠100%产生粘连，证实了动物手术模型成功制作，且早期损伤面的相互接触在粘连形成中是一个关键性的因素。通过术后肠粘连程度与范围评分及病理实验可知，经过羧甲基壳聚糖冲洗液处理大鼠后，形成肠粘连的动物数较少，可见少量纤维组织，炎性浸润较轻，防粘连效果与医用透明质酸及几丁糖一致，而且对术后肠粘连有修复作用，因此，其预防术后腹膜粘连的作用更优。可能原因是羧甲基壳聚糖冲洗液能将手术中的组织碎片等异物冲洗掉，因其流动性在修复早期随着器官的蠕动而漫布于整个腹腔，起着润滑作用，然后将肠管和腹膜隔开，抑制成纤维细胞的生长，降解为对人体有益的氨基葡萄糖单体被吸收，最终减少炎性反应所致的血管纤维胶原蛋白等渗出，从而显著减少粘连组织的形成^[21]。

实验中羧甲基壳聚糖冲洗液预防粘连的机制如下：一是羧甲基壳聚糖防粘连冲洗液于修复早期可以形成生物屏障，将炎症因子隔离，1周后其降解形成的粘性大分子可明显稀释炎性反应的刺激因子，抑制局部炎症细胞响应^[22]，其抑制纤维细胞黏附而减少纤维基因的产生^[23]；二是转化生长因子β₁在组织损伤中的活性比较强，是导致细胞外基质沉积形成粘连的最主要的细胞因子^[24]，羧甲基壳聚糖冲洗液抑制转化生长因子β₁的表达，从而减少粘连；三是抑制瘢痕瘤成纤维细胞的增殖，可诱发纤维母细胞产生促进上皮细胞和血管内皮细胞增殖的白细胞介素8，加速胶原蛋白的形成，促进肉芽组织和上皮组织的形成^[25]，加快伤口愈合等。此外，羧甲基壳聚糖冲洗液预防腹膜粘连的机制可能是多种作用的综合结果，如隔离、抗菌、止血等作用。

实验的不足之处是还未开展可引起粘连形成的其他指标监测及粘连形态观察。譬如，白细胞介素8可以提高炎症细胞的积累和激发其活性，释放炎症递质，同时它可以渗透到中性粒细胞的炎症部位，加剧炎症症状^[26]。因此需要进一步测定血清和腹腔灌洗液中白细胞介素8水平，利于阐明其防粘连的作用机制。而通过电镜观察粘连组织白细胞、嗜酸粒细胞及成纤维细胞的形状，内质网的大小及胶原纤维的密度，从而深入表征粘连形成的程度和范围。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程
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羧甲基壳聚糖冲洗液预防大鼠术后腹膜粘连

Preventive effect of carboxymethyl chitosan solution on postoperative peritoneal adhesions in a rat model

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[1]	李黎, 马力. 磁性壳聚糖微球固定化乳糖酶及其酶学性质[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 576-581.
[2]	杨威, 陈泽华, 易志勇, 黄旭东, 韩清民, 张荣华. 关节腔内注射透明质酸与安慰剂治疗早中期膝骨关节炎的疗效差异：基于随机、双盲、对照、临床试验的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3760-3766.
[3]	刘鋆, 杨龙, 王伟宇, 周玉虎, 吴颖, 卢涛, 舒莉萍, 马敏先, 叶川. 聚3-羟基丁酸酯4-羟基丁酸酯/聚乙二醇/氧化石墨烯组织工程支架的制备和性能评价[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3466-3472.
[4]	周安琪, 唐渝菲, 吴秉峰, 向琳. 骨膜组织工程设计：共性与个性的结合[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3551-3557.
[5]	郎丽敏, 何生, 姜增誉, 胡奕奕, 张智星, 梁敏茜. 导电复合材料在心肌梗死组织工程治疗领域的应用进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3584-3590.
[6]	靖金鹏, 张玥, 刘效敏, 刘壹. 补阳还五汤预防骨科术后深静脉血栓形成的系统评价及试验序贯分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(20): 3267-3274.
[7]	李玉, 黄鹏, 王宏, 王安利. 健美操运动员优势侧与非优势侧膝关节等速肌力测试分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(2): 232-236.
[8]	李洁, 许楗桢, 胡萍, 雷琪琪, 张文柠, 敖宁建. 用于慢性伤口羧甲基壳聚糖/氧化葡甘聚糖/三七总皂苷复合海绵的制备及性能评价[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(16): 2528-2534.
[9]	解健, 苏俭生. 静电纺丝取向纳米纤维作为组织工程生物支架的优势与特征[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(16): 2575-2581.
[10]	纪琦, 喻正文, 张剑. 3D打印金属基生物材料工艺和临床应用的问题与趋势[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(16): 2597-2604.
[11]	宋涯含, 吴云霞, 范道洋. 基于VOSviewer生物医学领域3D打印的知识图谱分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(15): 2385-2393.
[12]	李安安, 陈嘉韵, 陈锦, 宋敏, 李聪聪, 叶国柱, 吴高艺, 林文政, 蔡宇宁, 刘文刚. 关节镜联合玻璃酸钠治疗膝骨关节炎效果的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(15): 2437-2444.
[13]	钱楠楠, 张潜, 杨睿, 敖俊, 章涛. 间充质干细胞治疗脊髓损伤：细胞治疗及联合新药和生物材料[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(13): 2114-2120.
[14]	张艺岑, 王培鑫, 刘志成. 超声引导下注射透明质酸钠与皮质类固醇治疗足底筋膜炎：疼痛、筋膜厚度及踝足功能评估[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(11): 1670-1674.
[15]	罗雅馨, 毕浩然, 陈晓旭, 杨琨. 细胞外基质与组织的再生与修复[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(11): 1785-1790.