温阳益髓中药干预兔膝骨关节炎软骨基质金属蛋白酶的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.07.003

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (7): 997-1002.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.07.003

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温阳益髓中药干预兔膝骨关节炎软骨基质金属蛋白酶的表达

单鹏程，何名江，张洪美，荆琳，张淳，张仁卓，闫奇，沙益辉

中国中医科学院望京医院骨关节一科，北京市 100102

修回日期:2013-12-19 出版日期:2014-02-12 发布日期:2014-02-12
通讯作者: 张洪美，教授，主任医师，中国中医科学院望京医院骨关节一科，北京市 100102
作者简介:单鹏程，男，1983年生，北京市人，汉族，2010年北京大学医学部毕业，博士，主治医师，主要从事中医骨关节疾病及关节外科的研究。
基金资助:
北京市自然科学基金(7102166)

Effects of warming the yang and benefiting the marrow on the expression of matrix metalloproteinases in articular cartilage of rabbits with knee osteoarthritis

Shan Peng-cheng, He Ming-jiang, Zhang Hong-mei, Jing Lin, Zhang Chun, Zhang Ren-zhuo, Yan Qi, Sha Yi-hui

First Department of Bone and Joint, Wangjing Hospital of China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100102, China

Revised:2013-12-19 Online:2014-02-12 Published:2014-02-12
Contact: Zhang Hong-mei, Professor, Chief physician, First Department of Bone and Joint, Wangjing Hospital of China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100102, China
About author:Shan Peng-cheng, M.D., Attending physician, First Department of Bone and Joint, Wangjing Hospital of China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100102, China
Supported by:
the Beijing Municipal Natural Science Foundation, No. 7102166

摘要/Abstract

摘要：

背景：目前临床上关于温阳益髓中药治疗膝骨关节炎对软骨基质金属蛋白酶表达影响的研究还较少有报道。
目的：制作兔膝骨关节炎模型观察温阳益髓中药对软骨基质金属蛋白酶表达的影响。
方法：健康成年新西兰大白兔96只，随机选取72只采用石膏外固定方法制作兔膝骨关节炎模型。确定造模成功后再随机分为3组，模型组不做处理；中药治疗组每日灌胃方药提取液24 mL/kg，药物对照组每日灌胃葡立胶囊(盐酸氨基葡萄糖)24 mg/kg，1次/d，至造模成功后8周。另外24只新西兰大白兔作为空白对照。
结果与结论：PCR方法定量分析骨关节炎模型组软骨组织中基质金属蛋白酶1、基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶13表达水平均显著高于其他3组。中药治疗组及药物对照组中基质金属蛋白酶1、基质金属蛋白酶3及基质金属蛋白酶13的表达较模型组明显降低。说明温阳益髓中药治疗兔膝骨关节炎能够有效抑制兔骨关节炎软骨基质金属蛋白酶的表达。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

全文链接：

关键词: 组织构建, 软骨组织工程, 温阳益髓, 中药, 骨关节炎, 基质金属蛋白酶, 软骨, 盐酸氨基葡萄糖, 北京市自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: There are few reports concerning effects of warming the yang and benefiting the marrow for the knee osteoarthritis on the expression of matrix metalloproteinase.
OBJECTIVE: To observe the effect of warming the yang and benefiting the marrow on the expression of matrix metalloproteinase in rabbit models of knee osteoarthritis.
METHODS: Of 96 healthy adult New Zealand rabbits, 72 rabbits were randomly selected for making rabbit models of knee osteoarthritis using plaster external fixation. After success model establishment, the rabbits were randomly assigned to three groups. Model group was left intact. Chinese medicine group received daily intragastric administration of drug extract 24 mL/kg. Drug control group was daily intragastrically administered Puli Capsule (glucosamine hydrochloride) 24 mg/kg, once a day, until the eighth week of success model induction. An additional 24 New Zealand rabbits served as blank controls.
RESULTS AND CONCLUSION: Using quantitative PCR, matrix metalloproteinase-1, matrix metalloproteinase-3 and matrix metalloproteinase-13 expression was significantly higher in the model group than that in the other three groups. Matrix metalloproteinase-1, matrix metalloproteinase-3 and matrix metalloproteinase-13 expression was significantly lower in the Chinese medicine group and drug control group than that in the model group. These results indicated that warming the yang and benefiting the marrow for knee osteoarthritis in rabbits could effectively inhibit the expression of matrix metalloproteinase in rabbits.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

全文链接：

Key words: osteoarthritis, cartilage, drugs, Chinese herbal, matrix metalloproteinase

中图分类号:

R318

单鹏程，何名江，张洪美，荆琳，张淳，张仁卓，闫奇，沙益辉. 温阳益髓中药干预兔膝骨关节炎软骨基质金属蛋白酶的表达[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(7): 997-1002.

Shan Peng-cheng, He Ming-jiang, Zhang Hong-mei, Jing Lin, Zhang Chun, Zhang Ren-zhuo, Yan Qi, Sha Yi-hui. Effects of warming the yang and benefiting the marrow on the expression of matrix metalloproteinases in articular cartilage of rabbits with knee osteoarthritis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(7): 997-1002.

图/表（结果） 2

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引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2011年6月至2013年6月在北京大学医学部动物实验室完成。

材料：

实验动物：健康成年新西兰大白兔96只，雌雄各半。体质量(2.5±0.3) kg。分笼饲养于北京大学医学部动物实验室(SPF级)，进食和饮水均符合实验动物标准。

温阳益髓方：淫羊藿10 g，仙茅10 g，补骨脂10 g，菟丝子10 g，肉苁蓉10 g，鹿角霜10 g，按上述处方于药店购买生药，用水煎药物制成生药1 000 g/L的提取液，保存备用。

方法：

动物分组：96只新西兰大白兔中随机选取24只作为空白对照组，其余72只制作成膝骨关节炎模型，造模成功后随机分为模型组、中药治疗组及药物对照组，每组各24只，中药治疗组每日灌胃方药提取液24 mL/kg，药物对照组每日灌胃葡立胶囊 (盐酸氨基葡萄糖，山西中远威药业制造)24 mg/kg。

兔膝骨关节炎动物模型的制作：采用管型石膏伸直位制动方法复制出膝骨关节炎的动物模型^[2-3]。具体方法：将兔右膝关节长腿石膏管型固定于伸直位，固定范围：自腹股沟以下1.5 cm至踝关节下3 cm(趾端)，踝关节背屈30°-60°，制动时间为6周，左膝不做处理。制动后采用一兔一笼喂养，定期检查模型组石膏的固定情况。

预试验确定造模成功：石膏外固定制动6周后，处死预试验兔子，截取双侧胫骨近端、股骨远端的关节软骨标本，将其置于5%中性缓冲甲醛溶液固定48 h，然后经过10%中性乙二胺四乙酸二钠缓冲液反复脱钙3个月后，标本再常规脱水，石蜡包埋后连续切片，取厚度4.0-5.0 μm软骨组织制成病理切片。经过常规苏木精-伊红染色后，采用Nikon TE2000型倒置荧光显微镜观察关节软骨及滑膜病理改变情况，获得的图像经分析和拍照后保存。观察软骨形态和细胞形态与排列、潮线位置及形态。

动物给药：预实验中模型组于造模后6周取膝关节做病理组织学检查确定造模成功，造模成功后开始灌胃中药及盐酸氨基葡萄糖，1次/d，至造模成功后8周。4组实验动物均采用耳缘静脉空气栓塞法处死。

检测指标：至造模成功后8周。4组实验动物均采用耳缘静脉空气栓塞法处死。选取右侧胫骨近端的关节软骨标本，置于生理盐水冲洗后，用锐刀刮下胫骨平台全层软骨，反复剪成软骨碎片后，置于液氮中充分研磨，加入软骨细胞RNA提取试剂后，分离和纯化软骨细胞的总RNA，测量RNA浓度后置于-80 ℃冰箱中保存。mRNA的反转录实验按照试剂盒推荐的方法，将反转录合成好的cDNA溶液中加入荧光定量PCR反应液，并分别加入各种目标基因的扩增引物(表1)。PCR扩增实验包括95 ℃预变性3 min后，然后按照以下温度反应循环45次：95 ℃变性30 s；56 ℃退火30 s；72 ℃延伸45 s；同时并行扩增GAPDH和18 s等持家基因作为内参基因。

主要观察指标：兔软骨组织中基质金属蛋白酶1、基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶13的表达。

统计学分析：实验结果采SPSS 16.0统计学软件进行分析，采用中位数和四分位法计算正态分布的P值。首先用Kruskal-Wallis test进行全局统计量的检验，然后再用Mann-Whitney U-test进行非参数分析来确定独立样本是否来源于同一群体，若P < 0.05表明差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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讨论

关节软骨细胞外基质的降解是由多种蛋白酶参与完成的, 如丝氨酸蛋白酶类、半胧氨酸蛋白酶类等, 基质金属蛋白酶是导致细胞外基质降解最重要的蛋白酶^[4]。基质金属蛋白酶最早是由Gross和Lapiere发现的一组锌离子依赖酶^[5]，其在调节细胞外基质代谢的过程中起着至关重要的作用，被认为是机体生理重建和病理破坏的主要基础因素之一。

目前越来越多的研究发现基质金属蛋白酶在骨关节炎软骨退变中发挥着重要作用^[6-15]。正常的软骨细胞能够合成大量Ⅱ型胶原及蛋白多糖并将其分泌到细胞外基质中, 构成细胞外纤维网架结构, 为软骨细胞提供支撑和保护。而在基质金属蛋白酶的作用下，这些纤维网架结构会不断降解最终导致关节软骨退变。软骨组织中过量表达的基质金属蛋白酶引起关节软骨基质降解，是造成动物骨关节炎的主要原因^[16-24]。有关中药抑制关节软骨中基质金属蛋白酶的研究已有较多的报道。随着对基质金属蛋白酶和骨关节炎研究的不断深入，目前大多数学者认为基质金属蛋白酶1、3、13与骨关节炎关节软骨病理性降解关系最为密切^[25-27](表3)。

实验以温阳益髓为治则，通过检测关节软骨中基质金属蛋白酶1、基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶13的含量，进一步研究中医药物对骨关节炎关节软骨中基质金属蛋白酶表达的影响，从而为中药治疗膝骨关节炎提供理论基础。

目前已知的与骨关节炎基质金属蛋白酶有10余种, 主要可分为胶原酶(基质金属蛋白酶1、8、13), 基质溶解素(基质金属蛋白酶3、7、10、11) , 明胶酶(基质金属蛋白酶2、9) 等亚家族, 不同的基质金属蛋白酶对软骨细胞外基质不同组分降解的特异性也有所不同^[28-31]。

基质金属蛋白酶1和基质金属蛋白酶13是骨关节炎发病机制中最重要胶原酶，其作用底物有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原和蛋白多糖，但都以降解Ⅱ型胶原为主^[32]。其中基质金属蛋白酶13是所有基质金属蛋白酶亚型中最有效的Ⅱ型胶原降解酶^[33]。

Reboul等^[34]通过分离培养骨关节炎软骨细胞发现两个主要的基质金属蛋白酶13基因片段，与正常软骨相比骨关节炎软骨中基质金属蛋白酶13基因的表达明显增强。此外，王玉彬等^[35]研究发现，骨关节炎软骨中基质金属蛋白酶13的含量不仅在表层软骨较正常软骨中增加，在深层软骨组织中的表达同样明显增加，两组比较差异均有显著性意义。关于此问题国内还有相关报道(表3)。

实验的模型组中基质金属蛋白酶13的表达也显著高于其他3组，这与以上研究的结论基本一致。通过中医药物治疗，中药治疗组与药物对照组中基质金属蛋白酶13的表达明显降低，应用温阳益髓中药治疗组中基质金属蛋白酶13的表达甚至比正常对照组还低，由此可见，温阳益髓中药对骨关节炎软骨中基质金属蛋白酶13的表达的抑制作用极其显著。基质金属蛋白酶1与基质金属蛋白酶13都属于胶原酶，但基质金属蛋白酶1降解Ⅱ型胶原的能力却明显低于基质金属蛋白酶13。基质金属蛋白酶1在正常软骨中与基质金属蛋白酶抑制剂结合很难被发现，但在骨关节炎软骨中含量明显升高，其作用对象主要是新合成的Ⅱ型胶原，控制基质金属蛋白酶1的活性后，新合成的Ⅱ型胶原明显增加^[36]。

Boris等^[37]报告，取材于骨关节炎患者损伤部位的软骨细胞中基质金属蛋白酶1 mRNA水平为取材于正常部位软骨细胞相对应水平的1.8倍。由此不难发现，基质金属蛋白酶1在骨关节炎Ⅱ型胶原降解中发挥着重要作用。

将上述生药制成温阳益髓方治疗疾病方面的文献报道较少。临床观察认为，温阳益髓方结合动脉血注射治疗长干骨骨折术后延迟愈合具有创伤轻、痛苦小、方法简便、安全，无感染等并发症的优点，远期疗效可靠。

实验结果表明，通过药物预防与治疗，兔骨关节炎软骨中基质金属蛋白酶1的表达较单纯骨关节炎模型组明显降低，但中药治疗组降低没有药物对照组降低显著。此结果说明温阳益髓中药可以降低基质金属蛋白酶1的表达，其作用效果较盐酸氨基葡萄糖要略弱。

基质溶解素主要包括基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶10和基质金属蛋白酶11，其作用底物主要是细胞外基质中的蛋白多糖和糖蛋白。这其中基质金属蛋白酶3是基质溶解素中的重要成分，不仅对蛋白多糖有高度的裂解活性，还参与胶原酶的激活，加快Ⅱ型胶原的降解^[38]。

基质金属蛋白酶3是关节软骨基质降解中最重要的酶。基质金属蛋白酶抑制剂1是基质金属蛋白酶3的特异性抑制剂，它可与基质金属蛋白酶3分子结合形成不可逆的1∶1非共价键结合复合物，从而抑制其活性，正常状态下，基质金属蛋白酶3和基质金属蛋白酶抑制剂1的分泌保持平衡，二者之间水平失衡会导致基质金属蛋白酶3的活性增高，从而导致关节软骨的降解^[39-41]。

Flannery等^[42]研究发现,骨关节炎患者滑膜和软骨细胞都有高表达的基质金属蛋白酶3, 而基质金属蛋白酶抑制剂1增加较少,呈现基质金属蛋白酶3和基质金属蛋白酶抑制剂1的比例失衡,从而导致软骨降解增加,而且软骨破坏的严重程度与二者的比例失衡呈正相关性。

Naito等^[43]采用酶联免疫方法检测了83例膝骨关节炎患者和19名正常志愿者的血清中基质金属蛋白酶3和基质金属蛋白酶抑制剂1的含量，结果证明骨关节炎患者的血清中两者含量都明显高于正常志愿者血清中的含量。

此外王国金等^[44]通过检测正常人群及骨关节炎患者关节液和血清中基质金属蛋白酶3水平发现，骨关节炎组与正常组相比，关节液中基质金属蛋白酶3升高了约2倍，血清中基质金属蛋白酶3升高了约3倍，从而有力的证明了基质金属蛋白酶3在关节软骨退变中的重要作用。

实验中，骨关节炎模型组及药物对照组中基质金属蛋白酶3的含量较空白对照组均明显升高，具有显著统计学差异，而中药治疗组中基质金属蛋白酶3含量较对照组略有升高，两者比较无显著统计学差异，说明温阳益髓中药对基质金属蛋白酶3表达具有显著的抑制作用，其作用强度比盐酸氨基葡萄糖更强。

实验证明，通过应用温阳益髓中药能够有效抑制胶原酶基质金属蛋白酶1、基质金属蛋白酶13以及基质溶解酶基质金属蛋白酶3的表达，从而起到抑制骨关节炎进展的作用。基质金属蛋白酶是调节细胞外基质合成和降解代谢平衡的重要酶系, 其作用贯穿于骨组织发育、重塑和改建的整个过程^[45-52]。

综合实验结果，温阳益髓中药对基质金属蛋白酶1、基质金属蛋白酶3及基质金属蛋白酶13的表达均有明显的抑制作用，其中对基质金属蛋白酶13的抑制作用最强，由此可见，温阳益髓中药可以有效抑制软骨基质中基质金属蛋白酶的表达，通过抑制基质金属蛋白酶的表达减少软骨基质的降解，从而对关节软骨起到保护作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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温阳益髓中药干预兔膝骨关节炎软骨基质金属蛋白酶的表达

Effects of warming the yang and benefiting the marrow on the expression of matrix metalloproteinases in articular cartilage of rabbits with knee osteoarthritis

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