骨髓动员单个核细胞向血管内皮细胞和心肌样细胞的转化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.06.015

摘要/Abstract

摘要：

背景：目前骨髓动员能否归巢到心肌病心衰受损部位，分化成心肌样细胞和血管内皮细胞尚无定论。

目的：观察骨髓动员剂粒细胞集落刺激因子对心肌病心衰大鼠心肌和血管的影响。

方法：选取阿霉素心肌病心衰模型大鼠50只，分成2组，骨髓动员组30只皮下注射重组人粒细胞集落刺激因子，心衰组20只给予相同体积的生理盐水。骨髓动员组其中10只在动员第6天处死，留取心肌标本，行CD34免疫荧光检测。各组在治疗前及治疗后第5天剪尾取血，测量白细胞总数及单个核细胞百分比，同时提取外周血中单个核细胞行流式细胞仪检测。治疗第5天，腹腔注射Brdu 50 mg/kg，连续4周直至动物处死。留取心肌组织，通过心肌BrdU单染、BrdU与肌球蛋白重链双染及BrdU与肌动蛋白双染确定单个核细胞的归巢，评价移植的单个核细胞向心肌和血管内皮细胞的生成、分化。采用苏木精-伊红染色评价血管密度。

结果与结论：骨髓动员组白细胞数及单个核细胞数较治疗前明显增高(P < 0.05)。流式细胞仪证实骨髓动员组外周血单个核细胞CD34阳性率显著高于心衰组(P < 0.05)。心肌CD34免疫荧光检测，心衰组阴性，骨髓动员组阳性。骨髓动员组心肌BrdU单染和肌球蛋白重链、肌动蛋白双染均呈阳性，心肌损伤处血管内皮细胞核呈BrdU阳性；心衰组均为阴性。骨髓动员组血管密度显著高于心衰组(P < 0.001)。提示骨髓动员出单个核细胞，归巢到心肌受损处，对心肌病心衰大鼠模型心肌和血管有明显修复作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 骨髓动员, 粒细胞集落刺激因子, 单个核细胞, 心力衰竭, 阿霉素, 心肌样细胞, 血管内皮细胞

Abstract:

BACKGROUND: It is controversial whether bone marrow mobilization can retain in cardiac injured position in congestive cardiomyopathy or differentiate into cardiomyocytes and vascular endothelial cells.

OBJECTIVE: To study the effects of granulocyte colony stimulating factor (G-GSF) on myocardium and angiogenesis in rats with congestive cardiomyopathy.

METHODS: Fifty Wistar rats with heart failure caused by adriamycin-induced cardiomyopathy were divided into heart failure group (n=20) treated with normal saline and bone marrow mobilization (n=30) treated with subcutaneous injection of recombinant human G-GSF. Ten rats from the bone marrow mobilization were killed at day 6 of mobilization, and myocardial tissue was taken for CD43 immunofluorescent staining. Blood samples were taken from the rat tail in each group before and 5 days after treatment to count total number of white blood cells and percentage of mononuclear cells. Meanwhile, mononuclear cells extracted from the peripheral blood were used for flow cytometry detection. At day 5 after treatment, bromodeoxyuridine (BrdU, 50 mg/kg) was successively given to all rats for 4 weeks before they were sacrificed. Myocardial tissues were taken to determine the homing of mononuclear cells and evaluate differentiation of mononuclear cells into cardiomyocytes and vascular endothelial cells using BrdU staining, BrdU/myosin heavy chain double staining, and BrdU/actin double staining. Hematoxylin-eosin staining was used for determination of blood vessel density.

RESULTS AND CONCLUSION: G-CSF mobilization increased the number of mononuclear cells that was significantly higher than before treatment (P < 0.05). Flow cytometry showed that the number of CD34-positive mononuclear cells in the peripheral blood was higher in the bone marrow mobilization than in the heart failure group (P < 0.05). Myocardial CD34 immunofluorescence showed that the heart failure group was negative and the bone marrow mobilization group was positive. In the bone marrow mobilization group, the myocardial tissue was positive for BrdU staining, BrdU/myosin heavy chain double staining and BrdU/actin double staining, while vascular endothelial cells in the region of myocardial injury was positive for BrdU; conversely, the heart failure group was negative. The density of blood vessels in the bone marrow mobilization group was significantly higher than that in the heart failure group (P < 0.001). These findings indicate that bone marrow mobilization increases the number of mononuclear cells, and these cells are homing to myocardial injury, thereby playing a repair role in the myocardium and vascular tissue of heart failure rats with congestive cardiomyopathy.

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Key words: stem cells, granulocyte colony-stimulating factor, blood vessels, endothelial cells, antigens, CD34, flow cytometry

中图分类号:

R394.2

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图/表（结果） 3

2.1 实验动物数量分析 纳入80只大鼠制备阿霉素诱导心肌病心衰模型，50只符合造模标准，分为2组，骨髓动员组30只，心衰组20只，全部进入结果分析，无脱失。

2.2 各组大鼠治疗前后外周血白细胞总数及单个核细胞百分比 见表1。

骨髓动员组治疗后第5天较治疗前白细胞数明显增高，差异有显著性意义(P < 0.05)；单个核细胞百分比无明显增高，差异无显著性意义(P > 0.05)。因此骨髓动员组根据白细胞明显增高，计算出单个核细胞(单个核细胞=白细胞×单个核细胞百分比)，在骨髓动员组治疗后第5天较治疗前明显增高，差异有显著性意义(P < 0.05)。心衰组治疗后第5天较治疗前白细胞无明显增高，差异无显著性意义(P > 0.05)；单个核细胞百分比无明显增高，差异无显著性意义(P > 0.05)。因此心衰组根据白细胞无明显增高，计算出单个核细胞在心衰组治疗后第5天较治疗前无明显增高，差异无显著性意义(P > 0.05)。这充分说明骨髓动员出单个核细胞。

2.3 治疗后第5天模型大鼠外周血CD34水平 通过流式细胞仪检测，骨髓动员组的CD34为阳性，有明显第二峰；而心衰组为阴性，没有第二峰。骨髓动员组与心衰组大鼠外周血单个核细胞CD34阳性率分别为(26.35±0.91)%，(1.41± 0.77)%，骨髓动员组高于心衰组，差异有显著性意义(P > 0.05)，见图1A。

2.4 模型大鼠心肌CD34免疫荧光检测结果 通过心肌CD34免疫荧光可以看出心衰组没有CD34免疫荧光，为阴性(图1B1)；而骨髓动员组可以看见许多CD34免疫荧光，为阳性(图1B2)，因此可认为动员出血液CD34⁺单个核细胞归巢到心脏。

2.5 模型大鼠心肌切片苏木精-伊红染色结果 见图1。

心衰组可见部分心肌细胞肥大，心肌细胞的胞浆内有空泡形成、间质水肿、心肌细胞间隙增宽、心肌纤维断裂和肌原纤维溶解，没有似炎性细胞，且又不是心肌细胞的单个核细胞(图1C1)。

骨髓动员组可见心肌细胞的修复，看到许多类似炎性细胞，且又不是心肌细胞的单个核细胞(图1C2)，而心衰组切片苏木精-伊红缺如，推测就是骨髓动员出的CD34⁺单个核细胞。

2.6 模型大鼠心肌Brdu单染结果 通过心肌Brdu免疫组化染色，可见骨髓动员组有棕色核(图2A)，而心衰组为阴性(图2B)，看不到棕色核，进一步证实了单个核细胞归巢到心脏。

2.7 模型大鼠单个核细胞分化为血管内皮细胞及血管计数 在骨髓动员组心肌Brdu单染图中发现部分血管内皮有棕色核，说明单个核细胞可向血管内皮细胞转化。在苏木精-伊红染色下各组血管数经统计学结果显示，骨髓动员组的微血管数、毛细血管数和总血管数均显著高于心衰组 (P < 0.001)，见图2C，D及表2。

2.8 心肌Brdu与肌球蛋白重链双染及Brdu与肌动蛋白双染 在心肌Brdu、肌球蛋白重链双染和Brdu、肌动蛋白双染中，可见骨髓动员组有红色细胞核，说明单个核细胞归巢到心脏，同时也看到胞浆被染成棕色，表明肌球蛋白重链和肌动蛋白为阳性，示产生了心肌样物质，同样也发现心肌样物质向心肌样细胞转换，肌样细胞分化，出现细胞膜和横纹。此外也可见一些红色细胞核但胞浆未被染成棕色，说明单个核细胞尚未产生了心肌样物质(图2E，F)。

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引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：于2008年1月至2009年1月在山西医科大学国家重点生理实验室、山西医科大学生化分子实验室、山西医科大学实验动物中心、山西医科大学中心实验室完成。

材料：

动物：Wistar大鼠80只，雄性，8周龄，体质量200- 250 g，山西医科大学实验动物中心购进，许可证号：Sxyk2008-31。

方法：

建立阿霉素诱导心肌病心衰大鼠模型：选用80只Wistar大鼠，阿霉素腹腔注射，每次2.5 mg/kg，1次/周，连续6周，总剂量15 mg/kg。末次注射完成后观察2周，对存活的大鼠，由经胸彩色超声心动图测得心功能参数，以左室射血分数、左室短轴缩短率较正常参考值下降20%-30%作为心衰模型建立的标准。选取符合标准的50只大鼠，按随机数字表法分成2组，骨髓动员组30只重组人粒细胞集落刺激因子50 μg/(kg•d)皮下注射连续5 d，其中10只在动员后第6天处死，留取心脏标本，作心肌CD34免疫荧光^[25-26])；心衰组20只给予同样体积生理盐水，皮下注射连续5 d。

剪尾取血测量外周血干细胞动员情况：各组在治疗前及治疗后第5天剪尾取血，标本即刻用ABX血细胞自动分析仪测量白细胞总数及单个核细胞百分比。

单个核细胞提取：Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离外周血单个核细胞。各组在治疗后第5天剪尾取静脉血，然后提取外周血中单个核细胞。在短管中加入1.077 g/mL密度梯度的适量淋巴细胞分离液，取肝素抗凝静脉血与等量RPMI 1640液充分混匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，水平离心。离心后管内分为3层，上层为血浆和RPMI 1640液，下层主要为红细胞和粒细胞。中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。用毛细血管插到云雾层，吸取单个核细胞。

心脏标本处理：10只大鼠骨髓动员后第6天处死，留取心脏标本，作心肌CD34免疫荧光。各组观察4周后处死，立即开胸取出心脏，留取左心室，滤纸吸干。然后将心脏标本浸于体积分数4%中性甲醛溶液中固定，石蜡包埋。标本行苏木精-伊红染色、Brdu单染、Brdu与肌球蛋白重链双染及BrdU与肌动蛋白双染。损伤区域血管内皮细胞BrdU免疫组织化学染色呈现阳性的细胞核(棕色核)证实为新生血管内皮细胞。评价血管密度参照Van Kerckhove的方法，取苏木精-伊红染色切片，于普通光学显微镜下放大400倍，随机选取10个高倍镜视野，计算每个视野内血管总数、直径小于10 μm的毛细血管及直径大于10 μm的微血管数目。整个计数过程由2名未参与实验的病理专业技师操作，每张切片得到20个计数结果，取最终的计数结果平均值，分别计作每高倍镜视野内总血管密度、毛细血管密度及微血管密度。同样计数方法Brdu单染形成的棕色核代表单个核细胞归巢和存活的数目，BrdU与肌球蛋白重链双染或BrdU与肌动蛋白双染中红色核有棕色胞浆表心肌样物质产生的数目。通过出现细胞膜和横纹证实心肌样物质向心肌样细胞转化。

主要观察指标：损伤区域血管内皮细胞BrdU免疫组织化学染色呈现阳性的细胞核(棕色核)证实为新生血管内皮细胞。心肌Brdu与肌球蛋白重链双染及Brdu和肌动蛋白双染中，可见有红色细胞核，说明单个核细胞归巢到心脏，同时也看到胞浆被染成棕色，表明肌球蛋白重链和肌动蛋白为阳性，示产生了心肌样物质。同样出现细胞膜和横纹，说明心肌样物质向心肌样细胞分化。

统计学分析：2组之间比较采用独立样本比较t 检验，所得数据由文章作者采用SPSS 10.0软件进行统计学处理，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

扩张型心肌病主要特征是全心扩大、以左室扩大为主心肌收缩功能减退的一种原发性心肌病。由于其病因未明，故目前主要是对症治疗，因此迫切需要一种新的治疗手段来改变现状。目前干细胞移植为临床治疗心衰带来新的思路。在心血管领域，干细胞移植主要集中在采用经胸腔心肌注射、冠脉介入2种方法。扩张型心肌病是弥漫的心肌损害，介入需要多支冠脉同时进行，而开胸手术和冠脉介入方法复杂且有创伤，临床上难以推广，骨髓动员可能是较好的办法。

干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞^[27-30]，它具有以下特征：①自我更新能力。②一种干细胞可分化多种组织细胞。③植入相应的组织可实现功能修复。根据其来源不同，干细胞分为成体干细胞和胚胎干细胞。目前用研究的骨髓中干细胞主要有以下2类：骨髓间充质干细胞和造血干细胞。贴壁培养的是骨髓间充质干细胞，而骨髓动员的是造血干细胞^[31]。

在心脏受损时，骨髓动员是修复心肌和血管的自然过程。在自然过程中，有3个重要的环节：①干细胞从骨髓中动员。②干细胞归巢到受损处。③在受损组织，干细胞分化成有功能的细胞。目前骨髓动员治疗心肌梗死的动物实验已被国内外证实^[1-24]，但对心肌病心衰动物模型及临床研究报道尚少，仍缺理论依据。本实验骨髓动员治疗扩张型心肌病，观察心脏损伤处单个核细胞在心肌受损处的存活与分化，以期为临床应用骨髓动员治疗扩张型心肌病提供新的相关实验依据。

3.1 单个核细胞的特点及定性 CD34⁺细胞目前被认为是一种干细胞，主要存在于骨髓，具有向多种组织分化的能力。在健康人，外周血液中这种细胞很少，但骨髓动员常能使这种干细胞到外周血中。通常说的外周血中的单个核细胞就是这种CD34⁺细胞。文献报道在骨髓、外周血、脐血中都存在CD34⁺原始造血干细胞，它具有分化潜能，可转化为心肌细胞和血管内皮细胞并替代损伤的心肌和血管内皮细胞^[31-32]。骨髓动员主要是动员出这种CD34⁺表型原始造血干细胞。骨髓动员是否动员出单个核细胞主要是通过测定外周血单个核细胞数目和提取外周血中单个核细胞，通过流式细胞仪测定其表明抗原CD34来定性。

本实验发现大鼠外周血白细胞与人的白细胞基本相似，通常在10×10⁹ L^-¹以下，不同的是人以中性粒细胞为主，在70%以上；而大鼠以单个核细胞为主，在70%以上。虽然2组治疗前后单个核细胞百分率差异无显著性意义(P > 0.05)，但骨髓动员组治疗后白细胞与治疗前差异有显著性意义(P < 0.05)，而心衰组白细胞差异无显著性意义(P > 0.05)，因此骨髓动员组根据白细胞明显增高，计算出单个核细胞(单个核细胞=白细胞×单个核细胞%)在骨髓动员组治疗前后差异有显著性意义(P < 0.05)，充分说明骨髓动员动员出单个核细胞。通过单个核细胞 CD34流式细胞仪定性，可见骨髓动员组CD34阳性，有明显第二峰，而心衰组没有第二峰，为阴性。骨髓动员组和心衰组的CD34阳性率分别为(26.35±0.91)%和(1.41±0.77)%。这些也进一步证实了骨髓动员动员出单个核细胞。

3.2 骨髓动员时机选用骨髓动员的动员剂种类很多最常用的是粒细胞集落刺激因子。其具有以下特点^[33-34]：使用第3天血液CD34⁺细胞开始增加，第5天或第6天达到最高峰，以后开始下降，这说明外周血中CD34⁺细胞在治疗第5天或第6天测定最好，这时为最高峰，即使再增加治疗时间，CD34⁺细胞的量是下降的，并不是增加的，故作者选择粒细胞集落刺激因子连续治疗5 d，并在第5天提取外周静脉血单个核细胞测定CD34。

3.3 单个核细胞归巢至心脏心脏受损时，干细胞修复心肌和血管是一个自然过程。在自然过程中，有3个重要的环节：①干细胞从骨髓中动员。②干细胞归巢到受损处。③在受损组织，干细胞分化心肌细胞和血管内皮细胞。目前已证实骨髓干细胞动员在心肌梗死中的治疗的价值^[1-24]，而骨髓动员治疗扩张型心肌病心衰的机制未明，有可能具有一定价值。Kocher等^[35]从尾部静脉注射用荧光染料标记的CD34⁺的骨髓干细胞到裸鼠心肌梗死动物模型内，2周后发现这种标记的干细胞被迁移到梗死区及梗死周边区，并形成了新生的血管，这说明了干细胞的定向归巢能力和分化能力。Ciulla等^[36]进一步证实了骨髓干细胞定向归巢能力，由股静脉注入红色荧光染料标记的骨髓干细胞到心肌梗死大鼠体内，证明了标志的干细胞只存在心肌受损处，其他正常组织如肺、肝、肾组织均没有发现这种标志的干细胞。

本实验通过白细胞计数和流式细胞仪CD34定性，发现骨髓动员CD34为阳性，心衰组CD34为阴性；证实了骨髓动员动员出CD34⁺表型原始造血干细胞，采用心肌的免疫荧光染色进一步证实了骨髓动员出CD34⁺表型原始造血干细胞归巢至心脏。

Brdu分子结构类似胸腺嘧啶，可与胸腺嘧啶发生竞争作用，取代胸腺嘧啶合成DNA，然后用免疫组化的方法测定，阳性为新生细胞。正常细胞内无Brdu，故免疫组化为阴性。大鼠腹腔注射Brdu后，被吸收入血，心肌细胞在病理上为永久细胞，受损后分裂增殖能力很弱，因此心肌组织内Brdu(+)的细胞通常认为来自血液的干细胞即骨髓动员产生的骨髓干细胞^[37]，故Brdu是否阳性是跟踪监测移植的干细胞的理想指标^[38-40]。通过心肌切片苏木精-伊红观察，发现骨髓动员组在心脏受损部位有许多类似炎性细胞，又不是心肌细胞的单个核细胞。而心衰组苏木精-伊红缺如，推测这有可能就是单个核细胞。通过心肌Brdu免疫组化染色，可见动员组有棕色核，而心衰组看不到棕色核，进一步证实了单个核细胞归巢至心脏。

3.4 单个核细胞分化特性 Orlic等^[41]使用粒细胞集落刺激因子50 μg/(kg•d)和干细胞因子200 μg/(kg•d)皮下注射5 d治疗心肌梗死模型，发现损伤区域内形成了新的心肌细胞和新生的血管内皮细胞，这些新生的心肌组织和血管都是由单个核细胞分化而来的。本实验通过Brdu和肌球蛋白重链双染和Brdu和肌动蛋白双染中，可见骨髓动员组有红色细胞核，说明单个核细胞归巢到心脏，同时也看到胞浆被染成棕色，表明肌球蛋白重链和肌动蛋白为阳性，说明产生了心肌样物质。同样可见心肌样物质向心肌样细胞分化，出现细胞膜和横纹。在心肌Brdu单染图中发现部分血管内皮有棕色核，说明单个核细胞可向血管内皮细胞转化。

实验通过外周血单个核细胞计数和流式细胞仪检测单个核细胞CD34，证明骨髓动员出单个核细胞，通过心肌免疫CD34荧光和Brdu免疫组化单染证实了动员出单个核细胞归巢到心肌受损处，并通过免疫组化Brdu和肌球蛋白重链双染和Brdu和肌动蛋白双染发现了单个核细胞向心肌样细胞演变过程。通过血管内皮细胞棕色核证实单个核细胞可转变血管内皮细胞。由此可见，粒细胞集落刺激因子骨髓动员产生单个核细胞可黏附在受损心肌病心衰大鼠心肌受损处，存活并向心肌样细胞和血管内皮细胞转换，对心肌病心衰大鼠的心肌和血管组织均有修复作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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