健膝强骨丸对膝骨关节炎家兔模型关节软骨病理改变的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.05.001

摘要/Abstract

摘要：

背景：膝骨关节炎的病理学改变不可逆转，属中医“痹证”范畴，治疗目的是缓解或解除症状，延缓关节退变。健膝强骨丸方是武汉大学基础医学院荆州市第三人民医院的经验方，可补益肝肾，祛风散寒，除湿通络，强骨健膝。
目的：观察健膝强骨丸对膝骨关节炎兔模型膝骨关节软骨的保护作用，及其对软骨细胞骨形态发生蛋白7表达的影响。
方法：36只新西兰兔随机分为3组，每组12只，分别运用改良Hulth术制备兔膝骨关节炎模型。造模后第6周，给药组予健膝强骨丸0.1 g/kg灌胃，模型组和正常对照组予等量生理盐水灌胃。给药4周后通过软骨Mankin’s评分方法行兔膝关节软骨评分，电镜下观察软骨形态，免疫组化法检测膝关节软骨细胞骨形态发生蛋白7表达情况。
结果与结论：给药组兔膝关节软骨病理退变程度较其他2组轻，膝关节软骨细胞骨形态发生蛋白7的表达量较其他2组高，差异有显著性意义(P < 0.05)。提示健膝强骨丸可增强膝骨关节炎模型兔关节软骨细胞骨形态发生蛋白7的表达，从而促进膝关节软骨再生，减少软骨变形坏死，达到治疗关节炎的目的。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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关键词: 实验动物, 组织构建, 膝骨关节炎, 健膝强骨丸, 软骨细胞, 骨形态发生蛋白7

Abstract:

BACKGROUND: Knee osteoarthritis is characterized by inreversible pathological changes, belonging to arthragia syndrome. The goal of the treatment is to release or relieve symptoms and delay joint degeneration. Jianxi Qianggu Pill is an empirical formula developed by the Third People’s Hospital of Jingzhou, School of Basic Medical Science, Wuhan University, China. This prescription can nourish liver and kidney, eliminate wind and disperse cold, expel wet and dredge the collaterals, consolidate bone and reinforce knee.

OBJECTIVE: To observe the protective effect of Jianxi Qianggu Pill on joint cartilage and expression of bone morphogenetic protein 7 in rabbits with knee osteoarthritis.
METHODS: A total of 36 New Zealand rabbits were randomly divided into three groups, with 12 ones in each. The involved rabbits were applied to establish the model of knee osteoarthritis by using the modified Hulth’s method. At 6 weeks after modeling, the drug group was given 0.1 g/kg Jianxi Qianggu Pill via intragastric administration, while model group and normal control group received equal volume of saline. At 4 weeks after drug administration, rabbit articular cartilage was evaluated with Mankin’s scoring method. The cartilage morphology was observed under electron microscopy, and bone morphogenetic protein 7 expression was detected using immunohistochemistry.
RESULTS AND CONCLUSION: The pathological degeneration degree of articular cartilage in the drug group was significantly lighter, and bone morphogenetic protein 7 expression was significantly higher than the other two groups (P < 0.05). Experimental findings indicate that, Jianxi Qianggu Pill can promote the expression of bone morphogenetic protein 7 in articular cartilage of knee osteoarthritis rabbits, thereby promoting articular cartilage regeneration and reducing cartilage deformation or necrosis for the treatment of arthritis.

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Key words: osteoarthritis, knee, chondrocytes, bone morphogenetic protein 7, model, animals

中图分类号:

R318

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图/表（结果） 2

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引言

骨关节炎是一种以关节软骨退行性变和继发性骨质增生为特征的慢性关节疾病，多见于中老年人，女性多于男性。好发于负重较大的膝关节、髓关节、脊柱及远侧指间关节等部位，该病亦称为骨关节病、退行性关节炎、增生性关节炎等。病因原发性骨关节炎的发病原因迄今尚未完全明了。骨关节炎的发生发展是一种长期、慢性、渐进的病理过程，诸如有软骨营养、代谢异常；生物力学方面的应力平衡失调；生物化学的改变；酶对软骨基质的异常降解作用；累积性微小创伤；肥胖、关节负载增加等因素。一般认为骨关节炎是多种致病因素包括机械性和生物性因素的相互作用所致，其中年龄是主要高危因素，其他因素包括外伤、肥胖、遗传、炎症、代谢等，其主要病理改变是关节软骨受损、破坏和继发性骨质增生。膝骨关节炎是中老年人群中的常见病，在60岁以上的人口中发病率高达49%^[1-2]。

膝骨关节炎发生后，随着年龄的增长，其病理学改变不可逆转。治疗目的是缓解或解除症状，延缓关节退变，最大限度地保持和恢复患者的日常生活。目前的治疗方法有：①非药物治疗：开展多种形式的宣传教育，让患者了解疾病的性质和治疗目的；适度关节功能锻炼，减轻体质量，避免关节过度负重或活动；可配合局部物理疗法以缓解疼痛^[3-5]。②药物疗法：活血化癖中草药内服或外部热敷、熏洗、浸泡等可缓解症状，延缓病程。非类固醇消炎镇痛药物可以缓解疼痛。部分药物如维骨力、硫酸软骨素可参与软骨代谢，延缓软骨退变，关节内注射透明质酸钠，可起到润滑关节，保护关节软骨和缓解疼痛的作用。关节内注射皮质激素类药物，虽然可在短期内缓解症状，但对软骨的损害却随注射次数增加而加重，故一般情况下不作常规使用。③手术疗法：对于早中期患者，保守治疗无效可行关节清理，在关节镜下清除关节内的炎性因子、游离体和增生滑膜；出现畸形和持续性疼痛，可行截骨矫形，以减轻症状，如膝内翻畸形可行胫骨上端高位截骨；骨关节炎晚期依年龄、职业及生活习惯等可选用人工关节置换。

祖国医学认为膝骨关节炎的病机属中医“骨痹”范畴，多由肝肾亏虚，正气不足，筋脉失濡，复感风寒湿邪，气血淤积所致，中药可改善膝关节血脉循环，调节不正常的细胞因子水平，抑制细胞基质降解酶和通过多种方式来减缓关节软骨退变，促进软骨的修复。武汉大学基础医学院荆州市第三人民医院研制的健膝强骨丸具有解毒化瘀、消肿止痛、改善局部血液运行，扶正祛邪、补肾益精之功效。在解毒化瘀、清除病灶的基础上，具有补气活血、滋肝补肾、固精填髓、固本益气、坚骨生肌之功效，可促进骨质恢复。

文章旨在观察健膝强骨丸对膝骨关节炎模型兔膝骨关节软骨的保护作用，及其对软骨细胞骨形态发生蛋白7表达的影响。

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材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：于2012年5月至2013年6月在荆州市第三人民医院病理科病理实验中心完成。

材料：

实验动物：36只新西兰大白兔用于膝骨关节炎模型的制备，五至六月龄，体质量2.5-3.0 kg，雌雄不拘，由武汉同济医学院实验动物中心提供。

实验过程中对动物的处置方法符合2009年《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的条例。

药物健膝强骨丸：由续断、豹骨、枸杞子、牛膝、木瓜、菟丝子、龟甲(醋制)等组方，本院经验方，荆州市第三人民医院药剂科提供。

方法：

兔膝骨关节炎模型的制备：将36只新西兰大白兔按随机数字表法分为3组，即给药组、模型组和正常对照组，每组12只。依托咪酯(10 mg/kg)麻醉后，给药组、模型组行单侧改良式Hulth术^[6]，即取实验兔膝关节内侧长约3 cm 的纵型切口，探查兔膝关节腔内无原发病变后切断膝关节内侧副韧带，膝关节前后交叉韧带；并完整切除内侧半月板，注意勿损伤关节软骨面，彻底止血，冲洗关节腔，抽屉实验(+)膝关节前后交叉韧带；并完整切除内侧半月板，注意勿损伤关节软骨面，彻底止血，冲洗关节腔，抽屉实验(+)后，逐层缝合；正常对照组新西兰兔采用同样的方法切开暴露相同时间冲洗缝合兔膝。每笼一兔饲养，造模后每天肌肉注射先锋Ⅴ号1 g，连续3 d预防感染，伤口换药，每天驱赶1 h。

造模后6周，拍实验兔双侧膝关节X射线片初步证实动物模型建立。第6周开始给药组给予健膝强骨丸0.1 g/kg灌胃，模型组和正常对照组分别给予等量生理盐水灌胃，给药4周。

取材、膝软骨标本制备：给药4周后，将3组实验兔随机各抽取3只，麻醉后常规正常处死，即刻解剖兔膝关节腔，首先大体观察兔膝关节液颜色、关节积液量，关节软骨颜色、磨损程度，滑膜颜色，厚度。然后用手术刀片分别切取膝关节组成骨软骨组织0.5 cm×0.5 cm×0.2 cm的组织块，制备标本并脱钙。苏木精-伊红染色，甲苯氨蓝染色，制作切片。

主要观察指标：

大体观察：大体观察关节软骨磨损程度、关节积液量、关节液颜色、滑膜颜色厚度情况。按Brittberg软骨退变分级标准进行评分^[7]。

组织形态学观察：切片行苏木精-伊红染色，应用奥林巴斯光学显微镜观察，并摄片保存。2个独立观察者按Mankin’s组织学分级标准对软骨组织学切片进行评分。

免疫组化检测软骨中骨形态发生蛋白7的表达部位和数量结果判断：每一批免疫组化均设有用PBS代替一抗的对照片，观察切片至少3个具有代表性的高倍视野，对免疫组化进行评估。判断方法为镜下观察，根据棕黄色阳性信号的面积判断结果：阳性细胞<5%为阴性表达(-)，记为0分；5%-33.3%为弱阳性表达(+)，记为1分；33.4%-66.7%为中阳性表达(++)，记为2分；>66.8%为强阳性表达(+++)，记为3分。

统计学分析：本文作者使用 SPSS 13.0软件进行数据统计，数据均以x(_)±s表示，大体评分用秩和检验，其余组间比较用t 检验。以P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

骨关节炎是一种慢性关节疾病，它的主要改变是关节软骨面的退行性变和继发性的骨质增生，主要表现是关节疼痛和活动不灵活，X射线表现关节间隙变窄，软骨下骨质致密，骨小梁断裂，有硬化和囊性变，关节边缘有唇样增生，后期骨端变形，关节面凹凸不平，关节内软骨剥落，骨质碎裂进入关节，形成关节内游离体。骨关节炎又叫退行性关节炎，实际并非炎症，主要为退行性变，属关节提前老化，特别是关节软骨的老化。骨关节炎代表着关节的衰老，故称之为老年性关节炎。

膝骨关节炎的诊断标准如下：①有过膝部软组织损伤，但大多数人当时并未引起注意而无记忆。②膝关节疼痛和发僵，早晨起床时较明显，活动后减轻，活动多时又加重，休息后症状缓解。③后期疼痛持续，关节活动明显受限，股四头肌萎缩，关节积液，甚至出现畸形和关节内游离体。④膝关节屈伸活动时可扪及摩擦音。⑤膝关节正、侧位X射线片显示髌骨、股骨髁、胫骨平台关节缘呈唇样骨质增生，胫骨髁间隆突变尖，关节间隙变窄，软骨下骨质致密，有时可见关节内游离体。

本实验结果表明，给药组新西兰兔模型膝关节软骨的病理改变最轻，软骨结构最完整，软骨细胞形态改变最小，其次是正常对照组，最差是模型组，说明改良Hulth法造模符合膝骨关节炎的病理改变，适合进行膝关节炎的实验研究。

Urist^[8]在1965年做了用脱钙骨基质诱导异位宿主间充质细胞分化成新骨并且分离出一种具有骨诱导活性的蛋白质——骨形态发生蛋白。骨形态发生蛋白能够诱导动物或人体间充质细胞分化为骨、软骨、韧带、肌腱和神经组织。其与胚胎骨骼形成有关的蛋白质，在骨形成的数个阶段均起作用，由形态发生的早期阶段开始，并延续至出生后，在中枢神经的发生中也起着关键作用。Urist在研究中发现，把脱钙的皮质骨植入动物的肌肉中，一两周后会有新骨形成。他的结论是，植入的骨虽是死的，但其中可能含有某种物质在诱导新骨的形成。Urist从皮质骨中提取物获得了对成骨至关重要的“骨形态发生蛋白”，在全世界范围内掀起了成骨诱导研究的热潮。骨形态发生蛋白在临床的价值无可限量。

近年来基因重组的骨形态发生蛋白2和骨形态发生蛋白7的安全性和有效性得到了充分的证实，美国FDA也于2002年7月批准重组骨形态发生蛋白2用于脊柱融合。基于骨形态发生蛋白的安全性和高效诱导成骨活性被越来越多的实验所证实，在一些国家骨形态发生蛋白已进入大规模的临床试验阶段。

目前的研究表明，骨形态发生蛋白7不仅是一种具有强大骨诱导活性的成骨因子，同时对关节软骨也有明显的促进修复作用。Nishihara等^[9]做了重组人骨形态发生蛋白7在自体骨表面可以产生关节软骨面，以及可以修复软骨，肌腱和韧带的相关研究，随着研究的深入发现，骨形态发生蛋白7在骨折愈合、退行性关节炎相关骨骼疾病的预防起到了重要作用。Wu等^[10]发现，在培养第7天的生长板软骨细胞中加入骨形态发生蛋白7，可使细胞培养基中和基质/细胞层蛋白多糖的合成增加2倍，碱性磷酸酶活性也增加并同骨形态发生蛋白7剂量依赖性关系，第14天检测发现蛋白量也增加，这种刺激在无血清培养基中比在含血清培养基中要强。这种对生长板软骨细胞碱性磷酸酶活性和蛋白多糖合成的刺激提示骨形态发生蛋白7可诱导软骨细胞分化^[11]。骨形态发生蛋白7对细胞分裂影响较小，但在培养的早期发现有轻度的增加。单独使用时，骨形态发生蛋白7在2种培养基中均可增加矿物质(钙和磷)的含量(大约2倍)。在第14天，矿物质簇可以包围骨形态发生蛋白7处理的细胞。因此在体内通过培养的生长板软骨细胞骨形态发生蛋白7可以强烈的增加矿物质的形成。在无血清培养基中培养的猪关节软骨细胞上，重组骨形态发生蛋白7对蛋白多糖的合成和释放与蛋白多糖浓度的稳定维持具有一定影响^[12]。骨形态发生蛋白7处理过的关节软骨细胞蛋白多糖的合成是剂量依赖性的，同时蛋白多糖的释放减少。未处理的关节软骨内的蛋白多糖单体和氨基葡聚糖的组成同经骨形态发生蛋白7作用的关节软骨内的是相似的。新合成的蛋白多糖和外源性透明质酸结合形成聚合体的能力与牛鼻软骨蛋白多糖的能力是相似的。Grgic等^[13]的研究结果与上述实验类似，应用骨形态发生蛋白7填充NZW大鼠膝关节软骨全层软骨空洞，结果显示骨形态发生蛋白7可促进关节软骨修复，关节表面所形成的新软骨细胞同成熟关节软骨细胞相似。提示骨形态发生蛋白7在关节软骨蛋白多糖的维持方面具有一定的作用，有望在最大程度上对关节软骨进行修复。

大量文献表明骨形态发生蛋白7的生物活性使其对骨折、骨缺损、骨折延迟愈合、骨不连、骨质疏松症和其他骨疾病有很大的临床价值^[14]。由于天然的骨形态发生蛋白7在动物的骨骼中含量极低，利用骨形态发生蛋白7同其他生长因子间的相互协同作用，在不远的将来将重组人骨形态发生蛋白7同其他的生长因子复合在一起应用于临床将成为可能^[15-33]。

中医学认为：肾主骨，肝主筋，肝肾同源。随着年龄的增长，肾精肝血会有生理性衰退，若因各种病因加重肾精亏损会导致衰退的提前。于肝肾不足，所主之筋骨关节失于濡润，气血因虚而滞。肾亏则气化蒸腾之力不足，脾运失健，易生水湿，变生痰饮，流注关节，闭塞气血，瘀滞筋脉，故关节疼痛、僵硬、屈伸不利。骨节筋脉空虚，又易受外邪侵袭。故治疗上应以补益肝肾为主，兼以活血化瘀、舒筋通络、祛风除湿、化痰软坚等，以达到攻补合宜，标本兼治的目的。膝骨关节炎属中医“痹证”范畴^[34-39]，健膝强骨丸方是武汉大学基础医学院荆州市第三人民医院的经验方，可补益肝肾，祛风散寒，除湿通络，强骨健膝。本实验结果显示，本院研制的健膝强骨丸对实验兔膝关节炎起到了治疗作用，缓解了关节炎的病理改变，通过促进骨形态发生蛋白7的表达，从而促进软骨细胞的再生，修复关键软骨，达到治疗作用。即健膝强骨丸可通调节骨形态发生蛋白7的含量，而达到保护关节软骨免遭损伤的作用。本实验发现药物治疗组骨形态发生蛋白7的表达量高于正常对照组和模型组，药物治疗组的骨形态发生蛋白7的表达与模型组相比差异有显著性意义。并通过免疫组化图片仍可见治疗实验组骨形态发生蛋白7的表达明显较模型组及正常对照组强。研究结果表明武汉大学基础医学院荆州市第三人民医院的经验方健膝强骨丸能有效地促进关节软骨细胞分泌骨形态发生蛋白7，从而促进软骨修复，抑制破骨细胞的活性，增加成骨细胞活性。

综上，本实验结果表明，健膝强骨丸可以作用于膝关节软骨组织，调节膝关节软骨细胞骨形态发生蛋白7的表达，促进膝关节软骨再生，减少软骨变形坏死，达到治疗膝骨关节炎的目的。提示健膝强骨丸可能成为有效治疗膝骨关节炎的药物，值得进一步的临床研究，为研发新药治疗膝骨关节炎提供理论依据。