组织工程心脏瓣膜种子细胞：来源及应用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.02.019

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (2): 277-282.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.02.019

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组织工程心脏瓣膜种子细胞：来源及应用

蒲磊，李亚雄，蒋立虹

昆明医科大学附属延安医院心脏大血管外科，云南省昆明市 650051

收稿日期:2013-10-29 出版日期:2014-01-08 发布日期:2014-01-08
通讯作者: 蒋立虹，博士，教授，博士生导师，昆明医科大学附属延安医院心脏大血管外科，云南省昆明市 650051
作者简介:蒲磊，男，1986年生，云南省昆明市人，汉族，昆明医科大学在读硕士，主要从事心血管组织工程研究。
基金资助:
云南省自然科学基金资助项目(2010C119)；国家自然科学基金资助项目(31160230)；云南省科技厅-昆明医学院联合专项基金资助项目(2010CD210)；云南省科技厅-昆明医学院联合专项基金资助项目(2011FB166)

Seed cells for tissue-engineered heart valves: source and application

Pu Lei, Li Ya-xiong, Jiang Li-hong

Department of Cardiovascular Surgery, Yan’an Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650051, Yunnan Province, China

Received:2013-10-29 Online:2014-01-08 Published:2014-01-08
Contact: Jiang Li-hong, M.D., Professor, Doctoral supervisor, Department of Cardiovascular Surgery, Yan’an Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650051, Yunnan Province, China
About author:Pu Lei, Studying for master’s degree, Department of Cardiovascular Surgery, Yan’an Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650051, Yunnan Province, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Yunnan Province in China, No. 2010C119; the National Natural Science Foundation of China, No. 31160230; the Associated Special Foundation of Yunnan Province Technology Department and Kunming Medical College, No. 2010CD210, 2011FB166

摘要/Abstract

摘要：

背景：应用机械瓣和生物瓣行瓣膜置换是治疗终末期瓣膜病的有效手段，然而他们的临床应用受到多个因素的限制。具备生物活性的组织工程心脏瓣膜有潜力克服机械瓣和生物瓣的不足，选择适宜的种子细胞是组织工程心脏瓣膜研究的一个重要方面，许多成熟的体细胞和干细胞已被用于构建组织工程心脏瓣膜，然而尚未获得理想的结果。
目的：以构成瓣膜的细胞成分为基础，对用于构建组织工程心脏瓣膜的种子细胞、体外细胞种植方法的研究进行综述。
方法：由第一作者基于PubMed数据库和万方数据库应用计算机检索2000年1月至2012年12月相关的文章，英文检索词为“Tissue engineering，Heart valves，Cell”，中文检索词为“组织工程，心脏瓣膜，细胞”，优选文章内容与组织工程心脏瓣膜种子细胞直接相关，具备针对性和权威性，发表在权威杂志的文章共39篇进行综述。
结果与结论：瓣膜的细胞成分主要是内皮细胞和间质细胞，早期人们常用内皮细胞和成纤维细胞构建组织工程瓣膜，随着干细胞研究的深入，应用搏动性生物反应器种植间充质干细胞具有构建的组织工程瓣膜的潜力。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

全文链接：

关键词: 组织构建, 组织工程, 心脏瓣膜, 种子细胞, 干细胞, 细胞种植, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Application of mechanical valve and bioprosthetic valve replacement is an effective means for the treatment of end-stage valve disease. However, their clinical application is constrained by multiple factors. Tissue-engineered heart valves with biological activity hold the potential to overcome the defect of the mechanical valves and bioprosthetic valves. Choosing appropriate cells for cell seeding is a significant aspect for the research of tissue-engineered heart valves. A growing number of somatic cells and stem cells have been used for construction of tissue-engineered heart valves, however, not yet achieve the desired result.
OBJECTIVE: To review the studies on seed cells for tissue-engineered heart valves and the cell seeding methods in vitro on the basis of the cellular components of heart valves.
METHODS: First author searched PubMed and Wanfang database with computer for related articles published from January 2000 to December 2012. The keywords were “tissue engineering, heart valves, cell”. Preferred articles concerned seed cells of tissue-engineered heart valves with the relevance and authority. A total of 39 articles published in the prestigious journals were reviewed.
RESULTS AND CONCLUSION: Endothelial cells and interstitial cells were mainly valvular cellular components. In the early stage, endothelial cells and fibroblasts were used to construct tissue-engineered heart valves. With deep stem cell research, the application of pulsatile bioreactor cultivation mesenchymal stem cells holds a great potential to produce tissue-engineered heart valves.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

全文链接：

Key words: tissue engineering, heart valves, heart valve prosthesis, endothelial cells, stromal cells, stem cells

中图分类号:

R318

蒲磊，李亚雄，蒋立虹. 组织工程心脏瓣膜种子细胞：来源及应用[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(2): 277-282.

Pu Lei, Li Ya-xiong, Jiang Li-hong. Seed cells for tissue-engineered heart valves: source and application[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(2): 277-282.

图/表（结果） 1

瓣膜置换治疗终末期瓣膜病能显著提高患者的生活质量并延长寿命，然而，目前临床应用的机械瓣、生物瓣和冻存的同种瓣膜存在各种缺陷，机械瓣耐久性良好，但伴随有出血和血栓栓塞的风险；生物瓣和冻存的同种瓣膜能提供优于机械瓣的血流动力学性能，然而，生物瓣使用寿命有限，冻存的同种瓣膜供体匮乏，二者均存在钙化、退化、内膜增生、血管翳生长等风险导致瓣膜功能障碍，需要再次手术干预^[1]。生物瓣和机械瓣缺乏生物活性，在儿科和青年患者人群中应用受到极大限制。

组织工程心脏瓣膜是模拟正常心脏瓣膜的结构和功能，基于种子细胞和生物相容性良好的支架材料，应用搏动性生物反应器体外构建具生物活性的瓣膜替代物，用于修复和置换病变的瓣膜组织，组织工程心脏瓣膜具备重塑、生长和修复等生物特性，有潜力克服机械瓣和生物瓣的不足^[2]。目前，组织工程心脏瓣膜研究的开展主要集中于支架材料、种子细胞、生物反应器、动物实验、体内重塑及其分子机制等方面，理解组成心脏瓣膜的细胞成分是组织工程心脏瓣膜研究的前提，因此，本文将对心脏瓣膜的基本细胞组成和用于构建组织工程心脏瓣膜的种子细胞及体外细胞种植技术的研究进展进行综述。

2.1 心脏瓣膜细胞成分心脏瓣膜的细胞成分是血流接触面的内皮细胞和位于细胞外基质间的瓣膜间质细胞，理解其生理功能及生物学特性是种子细胞选择的先决条件。

2.1.1 内皮细胞心脏瓣膜内皮细胞具有调节血小板黏附、激活和纤维蛋白溶解形成抗血栓表面，通过调节中性粒细胞黏附调控炎症反应，调节血液和周围组织的物质交换，调节内皮下间质细胞的生长和发育。内皮细胞是血液剪切力的重要调节者，其能感知并快速适应局部的机械力学条件和血流动力学环境；内皮细胞是多种瓣膜病的病灶起始点^[3-4]。瓣膜内皮细胞与剪切力呈现出适应性形态，心室面内皮细胞接触较高的剪切力，多发生细菌性和血栓性心内膜炎；而瓣叶纤维膜面内皮细胞接触相对低的剪切力和较高的震荡压力，多发生钙化和粥样硬化性退化，内皮细胞所处的血流动力学环境决定内皮细胞的形态、功能、生理和病理^[3]。

2.1.2 间质细胞瓣膜间质细胞普遍存在于瓣膜组织中，瓣膜间质细胞可呈现出成纤维细胞、平滑肌细胞、肌成纤维细胞的表型，这些细胞表型变化与周围的细胞外基质紧密联系并动态适应，瓣膜间质细胞表型变化决定细胞外基质合成，分泌基质金属蛋白酶类及其抑制剂调节细胞外基质修复和重塑，维持瓣叶的正常功能。目前普遍认为瓣膜间质细胞呈现出5种不同的动态表型：胚胎祖细胞样间质细胞、循环内皮细胞前体样间质细胞、成纤维细胞样间质细胞、成骨性的间质细胞、肌成纤维细胞样间质细胞，这5种细胞表型的表达与局部刺激和微环境相互适应，且部分细胞表型间可相互转化并适应环境条件^[5-6]。正常情况下，瓣膜间质细胞主要呈现出成纤维细胞形态，在瓣膜重塑和病理状态下对瓣膜间质细胞的研究显示，瓣膜间质细胞活化为肌成纤维细胞表型，α平滑肌-肌动蛋白表达增强。各种生物机械刺激和生化因子协同作用改变局部内环境导致瓣膜间质细胞表型变化，活化的瓣膜间质细胞合成细胞外基质蛋白、基质金属蛋白酶和基质金属蛋白酶抑制剂，基质金属蛋白酶和基质金属蛋白酶抑制剂参与基质重塑，瓣膜间质细胞参与瓣叶损伤修复和瓣膜病态重塑，如瓣膜狭窄、粘液瘤退化、瓣叶纤维化，瓣膜间质细胞在维持细胞外基质结构的完整性、稳定性等方面具有十分重要的功能^[7-9]。

2.2 种子细胞为了获得具有抗血栓特性、生物活性和满足机体生理功能的结构完整的组织工程心脏瓣膜移植物，选择合适的种子细胞代替瓣膜内皮细胞防止血栓形成，代替间质细胞合成细胞外基质。理想的种子细胞应具备以下特点：①细胞来源广泛，易于获取，可操作性强，不受伦理学和法律的限制。②细胞体外增殖、扩增、黏附力强，具有一定的分化潜能。③具有合成细胞外基质成分的生物性能。④临床应用安全、可靠、无免疫原性或低免疫原性，且能在体内存活、增殖、分化。⑤细胞生物学功能接近或能代替瓣膜间质细胞和瓣膜内皮细胞。目前，应用于组织工程心脏瓣膜研究的种子细胞大致可分为成熟体细胞、干细胞和前提细胞。

2.2.1 成熟体细胞目前研究较多的自体来源成熟体细胞有成纤维细胞、内皮细胞、血管平滑肌细胞等，这些细胞主要来源于自体动、静脉。2000年，哈佛医学院学者Steinhoff等在获取羊颈动脉后应用胶原酶消化法及组织块贴壁法分别分离、培养自体内皮细胞和成纤维细胞，将成纤维细胞和内皮细胞序贯种植于脱细胞的同种肺动脉瓣支架构建组织工程心脏瓣膜，正位植入羊肺动脉瓣位置，未种植细胞的作为对照组，移植治疗后3个月行组织学检查显示：组织工程心脏瓣膜膜结构完整，内皮细胞和成纤维细胞再植，细胞外基质合成，而对照组瓣膜结构退化，细胞再植不良，实验从瓣膜功能和体内细胞再植层面证实自体动脉来源细胞用于构建组织工程心脏瓣膜^[10]，然而，缺乏中远期结果，对内皮细胞的抗血栓性及组织工程心脏瓣膜是否伴发钙化有待进一步研究。2002年，德国学者Dohmen等^[11]报道了对一位43岁主动脉瓣狭窄患者行ROSS手术治疗，术中应用组织工程肺动脉瓣重建右室流出道，治疗前4周获取前臂静脉，分离、培养静脉内皮细胞，基于冰冻保存的同种脱细胞肺动脉瓣支架，种植自体内皮细胞构建组织工程心脏瓣膜，将其用于右室流出道重建，治疗后随访1年该瓣膜功能良好，该方案构建的组织工程心脏瓣膜应用于临床初步成功的结果振奋人心，然而同种瓣膜支架的匮乏将限制其开展，促使研究开始着力于寻求其他支架材料、提高体外种植的效率、获得完整的内皮细胞表面、增强细胞与支架材料间黏附等方面。

2006年Lichtenberg等^[12]联合脱细胞的猪肺动脉瓣支架，应用搏动性生物反应器种植内皮细胞，未种植内皮细胞的作为对照组，正位植入幼羊肺动脉根部，分别术后4周和14周行心脏彩超检查和组织学检查，彩超结果显示两组肺动脉瓣功能均正常，但是，体外内皮细胞种植的组体内细胞再植状况明显优于体外未种植内皮细胞组，搏动性生物反应器动态种植提高细胞种植效率，形成完整的内皮表面，影响体内细胞再植。成熟体细胞易于分离获得，且具有一定的组织再生能力，随着研究的开展，人们发现这些细胞的增殖能力有限，获取自体血管分离成熟体细胞对机体造成一定损害，破坏血管完整性，此外，老年人群中瓣膜病发病率呈逐年增高趋势，人口老龄化给种子细胞的选择带来相应的难题，老年人组织活性差，自体细胞的增殖、分化、分泌能力相应减弱，机体病理状态导致细胞功能障碍、影响细胞活性和基因表达^[13]，可见成熟体细胞用于构建组织工程心脏瓣膜存在相应的缺陷。

2.2.2 干细胞随着人们对干细胞研究的深入，发现干细胞具有高度的自我更新能力、较强的多向分化潜能、来源广泛、低免疫原性、易于体外分离等优点已得到众多学者认可，能更好的满足种子细胞的要求，有望克服成熟体细胞的缺陷，干细胞以其独特的生物学特性逐渐成为组织工程心脏瓣膜研究最热门选择。

从骨髓、脂肪、外周血、皮肤、滑膜、肌肉中均能分离得到干细胞，其异于造血干细胞形成无性系，也被称为间充质干细胞，间充质干细胞具有贴壁生长、来源广泛、易于分离、自我复制更新和多向分化潜能等特性，能在短期内扩增达到一定数目用于构建组织工程心脏瓣膜；间充质干细胞主要表现出纺锤形、骰子形和成纤维细胞样形态，不表达造血干细胞表面标志：CD34、CD14，不表达白细胞共同抗原CD45、CD13、CD13等；阳性表达：CD29、CD71、CD105、CD166、CD54、CD55、CD13、CD44等细胞表面标志，低表达HLA-Ⅰ类分子，不表达HLA-Ⅱ类分子；间充质干细胞体外一定的诱导分化条件下可分化为多个细胞系并表达相应的细胞表面标志，如：中胚叶细胞系：成骨细胞、软骨细胞、内皮细胞；非中胚叶细胞系：神经细胞样细胞^[14]。间充质干细胞以其易于获取、低免疫原性、体外扩增能力强和多向分化潜能等特性，其已成为组织工程心脏瓣膜研究的主要种子细胞。

成人组织来源间充质干细胞：骨髓来源的间充质干细胞作为组织工程心脏瓣膜的种子细胞已被广泛研究，这类细胞能在组织工程心脏瓣膜支架材料上黏附、增殖，具有一定的抗血栓性能。有研究证实，一定的牵拉条件下，骨髓间充质干细胞与瓣膜间质细胞合成胶原成分的能力相近^[15]。分离培养幼羊自体骨髓间充质干细胞，在滚筒培养瓶内动态种植于聚合物支架构建组织工程心脏瓣膜，切除自体肺动脉瓣后于肺动脉干位置植入组织工程心脏瓣膜，结果显示：自体骨髓间充质干细胞能成为适宜的种子细胞，组织工程心脏瓣膜体内重塑获得于天然瓣膜相似的细胞外基质，未见血栓和钙化^[16]。将术前分离狒狒骨髓间充质干细胞，种植于可降解聚合物装配镍钛诺的支架材料构建自体组织工程心脏瓣膜，经介入途径植入后4周经胸心脏彩超检查显示瓣膜功能良好，组织学检查显示移植物重塑合成细胞外基质，重塑局部形成完整内皮细胞表面^[17]。自体来源的骨髓间充质干细胞用于构建组织工程心脏瓣膜具有一定前景，但是其体外增殖、分化及合成生理受到年龄和疾病状态的影响^[18]，老年患者骨髓间充质干细胞的应用将面临于成熟体细胞相似的难题。

Colazzo等^[19]联合循环牵拉培养系统，比较脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、人主动脉瓣间质细胞合成胶原和弹性蛋白能力，结果显示循环牵拉促进脂肪来源和骨髓来源间充质干细胞合成胶原成分，此外，脂肪来源的间充质干细胞的在一定机械刺激下也具备重塑和合成细胞外基质能力。脂肪间充质干细胞来源广泛，易于分离、扩增，具多向分化潜能，但是，其用于构建自体组织工程心脏瓣膜尚需进一步研究。

胎儿附属物来源间充质干细胞：合并先天性瓣膜畸形的儿科患者，能从绒毛膜、羊水、脐带血、脐带组织等胎儿附属物中分离得到干细胞，这些干细胞可冰冻保存10-15年，可通过建立自体干细胞库，提出了一个新颖的治疗理念“儿科心脏瓣膜组织工程”，胎儿附属物来源的干细胞更原始，能跨越慢性病理状态影响自体细胞基因表达、细胞生物活性和异体免疫反应等障碍，有望成为理想的种子细胞来源，这个理念能构建自体组织工程心脏瓣膜能用于瓣膜病治疗^[20]。Schmidt和Hoerstrup等应用绒毛膜干细胞^[21]、羊水干细胞^[22]、脐血内皮祖细胞种植于聚合物支架^{[21, 23]}，体外构建组织工程心脏瓣膜，组织学和生物力学检测结果显示这些种子细胞合成细胞外基质、形成完整的类内皮细胞表面。Sodian等^[23]在多孔聚合物支架上连续的种植脐带组织来源成纤维细胞，体外培养7 d，结果显示，脐带组织来源成纤维细胞具备良好的增殖潜能和体外组织生成能力。但是，合成的细胞外基质量和生物机械力学与天然瓣膜组织存在一定差距，需要进一步研究。

前体细胞和其他干细胞：内皮前体细胞或内皮祖细胞是一类内皮细胞前体细胞系，具有促进血管新生、血管重塑和修复等特性，体外实验显示内皮祖细胞能分化为内皮细胞并表达相应表面标志^[24]。有学者分离绵羊的外周血内皮祖细胞，将其动态种植于聚合物支架，体外培养21 d，结果显示内皮祖细胞阳性表达α平滑肌肌动蛋白(肌成纤维细胞表面标志)和内皮细胞表面标志，内皮祖细胞能替代内皮细胞和间质细胞用于构建组织工程心脏瓣膜^[25]。有学者应用脱细胞的同种肺动脉瓣支架，种植自体内皮祖细胞，临床应用于两个儿科先天性肺动脉瓣畸形患者，术后监测3年余，组织工程肺动脉瓣功能良好，并呈现出适应性重塑和生长^[26]。外周血含有内皮祖细胞的数量非常低，其占外周血单个核细胞的比率约0.1%，使其研究及应用受到一定限制，有研究证实年龄增长导致内皮祖细胞功能障碍，影响其内皮重建功能^[27]。

胚胎干细胞被誉为全能型干细胞，其具备理想的多向分化潜能，然而，胚胎干细胞具有恶性分化潜能，它的研究和临床应用受到伦理的限制。2006年Takahashi等^[28]通过基因工程策略将0ct3/4、Sox2、Klf4、和c-myc等外源基因转入小鼠成纤维细胞，获得自体的诱导多潜能干细胞，其具备接近胚胎干细胞样的多向分化潜能，通过基因工程策略获得的诱导多潜能干细胞跨越了伦理学限制和异体免疫排斥的障碍，其已成功应用于药物筛选和疾病模型建立^[29]，理论上能成为适宜的种子细胞，但是，诱导多潜能干细胞有恶性分化潜能，外源基因的安全性及其应用于构建组织工程心脏瓣膜有待进一步研究。

2.3 体外细胞种植、培养策略体外细胞种植培养的目的在于增强种子细胞黏附于支架材料及促进细胞合成细胞外基质。目前，体外细胞种植培养主要包括静态或动态两种方式，多项研究显示应用搏动性生物反应器动态种植的策略优于静态种植，生物反应器作为构建组织工程心脏瓣膜的异种辅助设备，其主要思路在于模拟左室血流动力研发搏动性生物反应器，研究证实能够提高组织工程机构的机械强度和调节细胞功能，搏动性生物反应器有希望成为构建具备一定生物功能的组织工程心脏瓣膜的工具，动态种植条件的机械应力刺激能提高种植效率，有效增强细胞与细胞间、细胞与基质间的黏附力，增强细胞定位、定植、增殖和细胞迁移，并使相应的细胞表面分子蛋白表达增加^[30]。有学者应用脱细胞的肺动脉支架，应用搏动性生物反应器种植内皮细胞，动态种植环境能有效促进内皮细胞形成完整的内皮表面和增强细胞与细胞间、细胞与支架间黏附^{[12, 19]}。搏动生物反应器联合循环牵拉应力的研究显示，其能增强细胞间黏附和细胞合成细胞外基质^[31]，牵拉应力促进细胞表型改变及细胞外基质合成^[32]。体外细胞种植形成完整的内皮细胞表面有可能提高组织工程心脏瓣膜耐久性和功能，但有待长期动物实验研究证实，此外，生物反应器的搏动压力、搏动频率与细胞黏附、细胞外基质合成的关系有待研究。

在不同实验研究中选择的细胞种植剂量不同，有学者分别将低剂量(1×10⁵)、中剂量(1×10⁶)、高剂量(2×10⁶)的人主动脉瓣间质细胞静态和动态种植于脱细胞的肺动脉瓣叶及肺动脉，结果显示动态种植有助于细胞浸润到达支架内部，且中剂量获得更佳的结果^[33]，然而，对于其他细胞类型及相应支架材料的细胞种植剂量缺乏头对头的研究数据。

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引言

组织工程研究是一门新兴学科，为心脏瓣膜置换物研究提供了新的思路。组织工程心脏瓣膜有潜力克服机械瓣和生物瓣的不足，具有生长、修复和适应性重塑等特性，具有良好的研究价值和应用潜能。组织工程是应用工程学和生命科学的原理，结合材料科学、细胞生物学和细胞通讯，模拟目标组织和器官的结构、功能，体外构建组织结构用于改善、提高和置换病变组织结构，行使相应的生理功能。

种子细胞选择及种植是组织工程心脏瓣膜研究的一个重要方面，基于瓣叶的细胞组成及其生理功能，选择种子细胞。成熟体细胞、干细胞、前体细胞（祖细胞）用于构建组织工程心脏瓣膜已被广泛研究，它们虽然具有各自独特的优势，但也存在一定的缺陷，自体内皮细胞具有良好的生物相容性，但体外增殖能力有限，疾病和病理状态影响细胞的生物学性能；间充质干细胞来源广泛、体外增殖能力强、具备多向分化潜能，是目前研究应用最热门的细胞资源，但其细胞生物学特性受年龄和疾病状态的影响，虽然同种异体应用已获得成功，但其仍具有的一定的免疫原性，老龄和疾病状态也影响其功能；胚胎干细胞和诱导多能干细胞被誉为是全能干细胞，但二者均具分化成瘤的潜能，胚胎干细胞受到伦理和免疫排斥的限制，诱导多能干细胞跨越了伦理和免疫原性的限制，但是，目前它多在诱导分化为靶细胞的后才用于组织工程，且有待进一步研究；前体细胞研究中以内皮祖细胞最多，但内皮祖细胞分离得率低，有研究证实循环血液中内皮祖细胞的量随年龄增长而逐渐下降。理想状态下，具有良好增殖潜能、易于获得、来源广泛、低或无免疫原性和具备分化潜能的细胞能成为适宜的种子细胞，也是众多研究的目标。

文章以构成瓣膜的细胞成分为基础，对用于构建组织工程心脏瓣膜研究较多的种子细胞和体外细胞种植方法的相关研究进行综述。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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组织工程心脏瓣膜种子细胞：来源及应用

Seed cells for tissue-engineered heart valves: source and application

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