胰岛素样生长因子1促进创伤性关节炎软骨细胞的体外增殖

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.02.004

摘要/Abstract

摘要：

背景：早期受损的软骨细胞在体外培养时容易产生去分化，表型不稳，常需添加一定的生长因子。
目的：观察胰岛素样生长因子1对成年兔创伤性关节炎早期关节软骨细胞体外增殖的促进作用。
方法：采用改良Hulth法制备成兔创伤性关节炎模型，造模成功后无菌条件下片状切取股骨远端及胫骨近端，用消化培养法培养软骨细胞。将软骨细胞随机分为2组，对照组加入含体积分数10%胎牛血清因子的DMEM培养液培养；实验组在对照组的基础上加入100 μg/L的胰岛素样生长因子1。通过细胞形态学、细胞计数、细胞活性检测胰岛素样生长因子1对创伤性关节炎关节软骨细胞增殖的影响。
结果与结论：成功培养出早期创伤性关节炎兔软骨细胞，细胞多数为小细胞，形态有小梭形、小圆形及小多边形。苏木精-伊红染色显示实验组细胞数量多于对照组，MTT实验证实实验组细胞的吸光度值大于对照组 (P < 0.01)。结果提示，胰岛素样生长因子1能促进早期创伤性关节炎模型兔软骨细胞的体外增殖。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 软骨组织构建, 胰岛素样生长因子1, 种子细胞, 软骨细胞, 创伤性关节炎, 兔

Abstract:

BACKGROUND: The early damaged chondrocytes are susceptible to de-differentiate and exert unstable phenotype during the in vitro culture, thus needing some growth factors.
OBJECTIVE: To observe the promotion effect of insulin-like growth factor 1 on the in vitro proliferation of chondrocytes in adult rabbits with traumatic arthritis.
METHODS: Traumatic arthritis models of adult rabbits were established by using the modified Hulth method. After the models were successfully established, the distal femur and proximal tibia were harvested under sterile conditions, the chondrocytes were cultured. The cultured cells were divided into two groups: control group was cultured with Dulbecco’s modified Eagle’s medium containing 10% fetal bovine serum, while experimental group was cultured with Dulbecco's modified Eagle’s medium containing 100 μg/L insulin-like growth factor 1. The effect of insulin-like growth factor 1 on the proliferation of chondrocytes in adult rabbits with traumatic arthritis was determined through the cytomorphology, cell counting, and cell activity.
RESULTS AND CONCLUSION: The chondrocytes in adult rabbits with traumatic arthritis were successfully cultured, the majority of cells were mini-cells, presenting small fusiform, round or polygonal shape. Hematoxylin-eosin staining showed that the number of cells in experimental group was higher than that in control group. MTT assay found that the absorbance of cells in experimental group was greater than that in control group (P < 0.01). Our findings indicate that, insulin-like growth factor 1 can promote the in vitro proliferation of chondrocytes in adult rabbits with traumatic arthritis.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Key words: insulin-like growth factor I, arthritis, model, animals, chondrocytes, cell proliferation

中图分类号:

R318

赵广，荆吉峰，张治宇，朱佳俊，崔岩. 胰岛素样生长因子1促进创伤性关节炎软骨细胞的体外增殖[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(2): 183-186.

Zhao Guang, Jing Ji-feng, Zhang Zhi-yu, Zhu Jia-jun, Cui Yan. Insulin-like growth factor 1 promotes in vitro proliferation of chondrocytes in traumatic arthritis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(2): 183-186.

图/表（结果） 2

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引言

材料方法

设计：细胞学对比观察实验。

时间及地点：于2009年10月至2010年8月在中国医科大学附属第四医院中心实验室完成。

材料：

实验动物：健康清洁级22月龄的成年日本大耳白兔20只，体质量3.5-4.0 kg，雄性，购自中国医科大学动物实验室，实验前适应性喂养1周，未见异常，四肢活动良好。实验中对动物的处置符合动物伦理学标准。

胰岛素样生长因子1促进关节炎软骨细胞体外增殖实验用试剂及仪器：
试剂及仪器	来源
DMEM培养基低糖型，Ⅱ型胶原酶，胰蛋白酶	Gibco 公司生产，购于华美生物工程公司
胰岛素样生长因子1，MTT	Sigma 公司生产，购于华美生物工程公司
胎牛血清(FBS)	天津灏洋生物公司
二甲基亚砜	中国医科大学遗传教研室惠赠
电子显微镜、实验动物手术器械等	中国医科大学盛京医院儿骨教研室

实验方法：

兔创伤性关节炎模型的建立：随机选取16只白兔按照用改良的Hulth法制备成兔创伤性关节炎模型^[10]。其余4只兔不干预为正常兔。

创伤性关节炎模型具体的制备方法：将动物麻醉后仰卧于手术台上，取髌内侧切口长约2 cm，打开关节腔，将髌骨外翻，将双膝关节内侧副韧带、前后交叉韧带切断并切除内侧半月板，注意勿损伤关节软骨；冲洗关节腔后，逐层缝合切口。术后应用肌注青霉素2×10⁵ U/d，持续7 d，造模后不固定伤肢，每天分2次驱赶兔奔跑，1 h/d，连续8周。

取材鉴定：造模后8周，随机选取模型兔2只及正常兔2只，空气栓塞法处死，无菌条件下取双侧膝关节标本。正常兔软骨表面光滑，色泽正常，未见软骨表面裂纹及凹陷，无骨赘形成。模型兔软骨面色泽灰暗，表面粗糙糜烂，软骨下骨外露，骨赘增生明显，尤以胫骨内侧髁明显，证明制模成功。

软骨细胞的提取：提取模型兔，空气栓塞法处死后在无菌条件下片状切取股骨远端、胫骨近端，用消化培养法培养出原代软骨细胞^[11]。

具体方法：将切取获得的股骨远端、胫骨近端软骨剪碎，大小为1.0 mm×1.0 mm，加入10-15倍体积的0.25%胰蛋白酶，在37 ℃环境中消化30 min，终止消化，离心 10 min(1 300 r/min)，离心后弃上清液，用DMEM培养基清洗1次，再次离心后去上清液，加入10倍体积的0.2%Ⅱ型胶原酶，在37 ℃环境中消化3 h，振荡，然后静置2 min，小心取上清液移入另外的离心管中，离心10 min (1 300 r/min)，弃上清液，加含体积分数15%胎牛血清的DMEM养基轻轻吹打离心管底部及周围，进行细胞计数。将浓度(1.0-2.0)×10⁹ L^-1细胞悬液放入37 ℃，体积分数5% CO₂培养箱中培养48 h，细胞贴壁后换液，以后隔日换液。

软骨细胞的干预：将细胞浓度为5×10⁷ L^-1的创伤性关节炎模型兔软骨细胞悬液接种于2块24孔板，对照组加入DMEM培养液，实验组细胞培养时在模型组基础上加入100 μg/L的胰岛素样生长因子1。

苏木精-伊红染色：取各组细胞，按1∶2分瓶传代到第3代，用倒置显微镜观察细胞的形态及生长情况。并进行苏木精-伊红染色，光镜下观察细胞的生长情况。

软骨细胞的增殖情况：用血细胞计数板计数各组软骨细胞，取均数后，计算存活细胞总数，以培养时间为横轴、存活细胞总数为纵轴绘制软骨细胞的生长曲线，观察比较各组细胞的增殖情况。

MTT法检测细胞活性：取培养的成兔关节炎软骨细胞悬液接种于96孔板，分为2组：对照组加入不含因子的DMEM培养液(含体积分数10%胎牛血清，青霉素 100 U/mL，链霉素100 mg/L)200 μL；实验组在对照组的基础上加入100 μg/L的胰岛素样生长因子1。将培养板放入37 ℃，体积分数5%的CO₂培养箱内培养。3 d后换液，5 d时加入5 g/L MTT液20 μL，继续培养4 h，每孔加入150 μL二甲基亚砜，于490 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度值。计算每组的平均值，因细胞存活数与吸光度成正比，通过比较吸光度来比较细胞存活数。

主要观察指标：胰岛素样生长因子1对创伤性关节炎关节软骨细胞增殖的影响。

统计学分析：由作者应用SPSS 11.5软件进行统计学处理，组间细胞数量及吸光度值比较采用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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讨论

高能量损伤可破坏关节组织完整性，直接导致软骨组织坏死，是形成创伤性关节炎的病理基础^[12]。研究表明关节软骨的损伤程度不仅取决于负荷强度，而且取决于作用时间。关节内骨折伴发关节面破坏，造成关节面不平整，不但增加了运动时关节面的摩擦力，而且导致关节面应力集中，结果出现软骨胶原纤维塑型，高应力侧的软骨变薄，最终导致创伤性关节炎形成。即使部分关节内骨折患者进行内固定手术治疗，关节面的平整性也难以达到完全恢复，随着关节的活动，进一步造成对关节软骨的破坏。组织工程学的产生，应用种子细胞与生物材料复合，为组织缺损的修复提供了新思维和新方法，为关节软骨缺损的治疗提供了新思路。

实验通过制备创伤性关节炎模型结合组织工程学的基本方法及原理，提取早期受损的软骨细胞进行培养，观察其在体外生长因子作用下的增殖分化能力。实验中发现，成年兔创伤性关节炎软骨细胞在体外无因子情况下可以成活，但表现出了细胞生长缓慢、增殖周期长、细胞表型维持不佳、细胞分泌功能减弱的特性。说明损伤的关节软骨组织中的部分软骨细胞是处于一种停止分化和增殖的静息状态，但仍有部分细胞保持一定的增殖能力，能够补充由于损伤或细胞老化造成的细胞减少^[13-15]。创伤性关节炎早期软骨细胞所保持的部分增殖能力，对于软骨的修复提供了最基本的条件。

胰岛素样生长因子1是胰岛素样生长因子系统中的主要因子之一，可调节糖原和蛋白质的合成与分解,参与细胞增殖、分化及凋亡过程。有研究发现胰岛素样生长因子1可通过MAPK/ERK信号通路促进软骨细胞增殖^[16-18]。魏立等^[19]的实验发现，在体外培养出生后1，28 d大鼠髁突软骨细胞后，加入100 μg/L重组大鼠胰岛素样生长因子1能促进细胞增殖，证实胰岛素样生长因子1能促进新生及青春期大鼠髁突软骨细胞增殖，抑制其凋亡，这种作用可能是通过上调抑凋亡基因bcl-2表达，降低促凋亡基因bax表达实现的。最近肖飞等^[20]观察了胰岛素样生长因子1在家兔骨折愈合过程中的作用，他们制备了去卵巢骨质疏松症新西兰兔左胫骨骨折模型，于骨折处分别注射1，10，100，1 000 g/kg不同剂量的胰岛素样生长因子1，行动态X射线、骨折处3点应力实验以及组织学观察，结果证实，胰岛素样生长因子1骨折局部注射能够明显促进骨质疏松骨折的愈合，且骨折愈合速度的快慢与胰岛素样生长因子1的注射剂量大小有关。以上研究均证实，胰岛素样生长因子1能促进软骨细胞增殖，进而加速骨与软骨的生长与改建。

本文的结果与以上研究相似，同时实验着重于软骨组织工程的实际应用研究，其目的为解决临床上最多见的关节损伤的早期修复问题。实验结果证明，添加一种生长因子(胰岛素样生长因子1)亦对创伤性关节炎软骨细胞的增殖有明显促进作用，对日后的软骨修复起到了重要作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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