外源性心脏营养素1：保护PC12细胞和许旺细胞的可能性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.41.012

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (41): 7265-7271.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.41.012

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外源性心脏营养素1：保护PC12细胞和许旺细胞的可能性

辛泽团¹，刘湘泽²，张明进²，李伟²，陈伯华²，马学晓²

¹青岛市城阳区人民医院骨科，山东省青岛市 266100；²青岛大学医学院附属医院脊柱外科，山东省青岛市 266003

收稿日期:2013-06-09 修回日期:2013-07-30 出版日期:2013-10-08 发布日期:2013-11-01
通讯作者: 马学晓，博士，副主任医师，副教授，硕士研究生导师，青岛大学医学院附属医院脊柱外科，山东省青岛市 266003 ma_xuexiao@126.com
作者简介:辛泽团，男，1973年生，山东省青岛市人，汉族，1998年青岛医学院毕业，主治医师，主要从事骨科的研究。
基金资助:
山东省自然科学基金(Y2008C41)资助*

Exogenous cardiotrophin-1: The possibility to protect PC12 cells and Schwann cells

Xin Ze-tuan¹, Liu Xiang-ze², Zhang Ming-jin², Li Wei², Chen Bo-hua², Ma Xue-xiao²

¹Department of Orthopedics, People’s Hospital in Chengyang District, Qingdao 266100, Shandong Province, China; ²Department of Spinal Surgery, Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, Shandong Province, China

Received:2013-06-09 Revised:2013-07-30 Online:2013-10-08 Published:2013-11-01
Contact: Ma Xue-xiao, M.D., Associate chief physician, Associate professor, Master’s supervisor, Department of Spinal Surgery, Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, Shandong Province, China ma_xuexiao@126.com
About author:Xin Ze-tuan, Attending physician, Department of Orthopedics, People’s Hospital in Chengyang District, Qingdao 266100, Shandong Province, China
Supported by:
Natural Science Foundation of Shandong Province, No. Y2008C41*

摘要/Abstract

摘要：

背景：外周神经损伤后的很短时间内，神经和肌肉已经开始发生不可逆的退变。如何延缓外周神经损伤后的退变过程，并创造一定的微环境作为其恢复的基础。
目的：探讨外源性心脏营养素1保护PC12细胞和许旺细胞的作用。
方法：获得并培养许旺细胞和PC12细胞，分别进行完全培养基培养、无血清培养基培养和50 ℃高温培养，心脏营养素1组中加入一定量的外源性心脏营养素1溶液，对照组中加入等量无菌DMEM溶液培养24 h。应用CCK-8比色法测定PC12细胞和许旺细胞的存活率，乳酸脱氢酶试剂盒测定上清液中乳酸脱氢酶活性，硫代巴比妥酸法测定丙二醛浓度，黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶活性。
结果与结论：加入心脏营养素1后PC12细胞和许旺细胞存活率明显增高，乳酸脱氢酶释放量、丙二醛浓度明显减少，超氧化物歧化酶活性显著增加。证实外源性心脏营养素1能够明显减轻缺血和热应激刺激对PC12细胞和许旺细胞的损伤从而起到保护作用，其作用机制可能与心脏营养素1与细胞表面受体结合激活了抗凋亡蛋白的表达有关。

关键词: 组织构建, 组织构建细胞学实验, 生物活性因子, 心脏营养素1, PC12细胞, 许旺细胞, CCK-8, 乳酸脱氢酶试剂盒, 硫代巴比妥酸法, 黄嘌呤氧化酶法, 保护作用, 省级基金

Abstract:

BACKGROUND: Restoration of neurological functions after the damaged peripheral nerve is reconstructed is a hot topic in existing research. Within a short term following peripheral nerve injury, nerve and muscle begin to develop irreversible degeneration. Restoration of the damaged nerve requires delayed degeneration and basic microenvironment.
OBJECTIVE: To investigate the protective effect of cardiotrophin-1 on PC12 cells and Schwann cells.
METHODS: Schwann cells and PC12 cells were obtained and cultured in complete medium, serum-free medium and 50 ℃ medium, respectively. Cells in cardiotrophin-1 group were treated with exogenous cardiotrophin-1 solvent, while those in the control group were treated with equivalent Dulbecco’s modified Eagle’s medium, for 24 hours. The survival rate for PC12 cells and Schwann cells was determined using Cell Counting Kit-8 colorimetric method. The lactate dehydrogenase activity in supernatant was detected by lactate dehydrogenase kit, and the malondialdehyde content and superoxide dismutase activity were measured by thiobarbituricaicd and xanthine oxidese method respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: The survival rate of PC12 cells and Schwann cells in cardiotrophin-1 group was obviously increased, lactate dehydrogenase releasing and malondialdehyde content were obviously decreased, superoxide dismutase activity was dramatically improved compared with control group. Exogenous cardiotrophin-1 reduces the injury caused by ischemia and heat stress stimulation for PC12 cells and Schwann cells. The mechanism of protection may be related to the expression of anti-apoptosis protein activated by the combination of cardiotrophin-1 and its receptors.

Key words: nervous system, cell survival, culture media, serum-free, Schwann cells, tissue engineering

中图分类号:

R318

辛泽团，刘湘泽，张明进，李伟，陈伯华，马学晓. 外源性心脏营养素1：保护PC12细胞和许旺细胞的可能性[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(41): 7265-7271.

Xin Ze-tuan, Liu Xiang-ze, Zhang Ming-jin, Li Wei, Chen Bo-hua, Ma Xue-xiao. Exogenous cardiotrophin-1: The possibility to protect PC12 cells and Schwann cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(41): 7265-7271.

图/表（结果） 7

2.1 心脏营养素1对PC12细胞的保护作用

2.1.1 心脏营养素1对PC12细胞存活率的影响 缺血环境下培养24 h后发现PC12细胞数量减少明显，细胞计数板计数分析显示细胞存活率为60%，加入心脏营养素1溶液组PC12细胞存活率为80%，见图1。高温环境下细胞的存活率仅为不到50%，而加入了心脏营养素1溶液组细胞存活率为75%左右，见图1。CCK-8比色法检测细胞存活率，酶标仪检测A值见表1。心脏营养素1组细胞存活率高于对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)。说明心脏营养素1对细胞有保护作用。

2.1.2 心脏营养素1对PC12细胞培养液中乳酸脱氢酶活性的影响 缺血对照组和高温对照组的PC12细胞培养液中的乳酸脱氢酶活性较正常组乳酸脱氢酶浓度明显增高，为正常组的2.94、2.72倍，而加入心脏营养素1的缺血心脏营养素1组和高温心脏营养素1组的乳酸脱氢酶活性增高程度较对照组降低，为正常组的1.75、1.94倍，结果见表2。心脏营养素1组与对照组相比差异有显著性意义(P < 0.05)，说明心脏营养素1对细胞有保护作用。

2.1.3 心脏营养素1对PC12细胞丙二醛浓度的影响 缺血对照组和高温对照组的PC12细胞培养液中的丙二醛浓度较正常组丙二醛浓度分别增加1.47、1.64倍，缺血心脏营养素1组和高温心脏营养素1组的丙二醛浓度增高程度较对照组降低，为正常组的1.18、1.35倍，结果见表3。心脏营养素1组与对照组相比差异有显著性意义(P < 0.05)，说明心脏营养素1对细胞有保护作用。

2.1.4 心脏营养素1对PC12细胞培养液中超氧化物歧化酶活性的影响 缺血对照组和高温对照组的PC12细胞培养液中的超氧化物歧化酶活性较正常组超氧化物歧化酶活性明显降低，分别占正常组40.26%，55.52%，加入心脏营养素1的缺血心脏营养素1组和高温心脏营养素1组的超氧化物歧化酶活性增高程度较对照组明显增高，为正常组的71.75%，81.82%，结果见表4。心脏营养素1组与对照组相比差异有显著性意义(P < 0.05)，说明心脏营养素1对细胞有保护作用。

2.3 心脏营养素1对许旺细胞的保护作用

2.3.1 心脏营养素1对许旺细胞存活率的影响 细胞计数板计数分析显示缺血环境下许旺细胞存活率为60%，加入心脏营养素1组细胞存活率为85%，见图3。热应激作用下细胞的存活率仅为40%，心脏营养素1组细胞存活率为80%，见图3。酶标仪检测得到的A值见表5。加入了心脏营养素1的实验组对细胞的保护作用与对照组相比差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.3.2 心脏营养素1对许旺细胞培养液中乳酸脱氢酶活性的影响 缺血对照组和高温对照组的许旺细胞培养液中的乳酸脱氢酶活性较正常组乳酸脱氢酶活性明显增高，为正常组的3.97、2.87倍，加入心脏营养素1的缺血心脏营养素1组和高温心脏营养素1组的乳酸脱氢酶活性增高程度较对照组明显降低，为正常组的1.74、1.97倍，结果见表6。心脏营养素1组与对照组相比差异有显著性意义 (P < 0.05)，说明心脏营养素1对细胞有保护作用.

2.3.3 心脏营养素1对许旺细胞丙二醛浓度的影响 缺血对照组和高温对照组的许旺细胞培养液中的丙二醛浓度较正常组丙二醛浓度明显增高，为正常组的1.39、1.79倍，而加入心脏营养素1的缺血心脏营养素1组和高温心脏营养素1组的丙二醛浓度增高程度较对照组明显降低，为正常组的1.15、1.25倍，结果见表7。心脏营养素1组与对照组相比差异有显著性意义(P < 0.05)，说明心脏营养素1对细胞有保护作用。

缺血对照组和高温对照组的许旺细胞培养液中的超氧化物歧化酶活性较正常组超氧化物歧化酶活性明显降低，为正常组的41.16%、55.45%，加入心脏营养素1的缺血心脏营养素1组和高温心脏营养素1组的超氧化物歧化酶活性增高程度较对照组明显增高，为正常组的71.29%，84.16%。心脏营养素1组与对照组相比差异有显著性意义(P < 0.05)，说明心脏营养素1对细胞有保护作用。

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引言

材料方法

设计：细胞学体外实验。

时间及地点：实验于2008年7月至2009年6月在青岛大学医学院附属医院中心实验室完成。

材料：PC12低分化细胞来自中科院上海细胞库。

动物：10只新生三四天的swiss乳鼠，雌性，体质量(12±2) g，购于北京利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2006-0009。

研究心脏营养素1保护神经细胞的主要试剂及仪器：

方法：

PC12细胞培养：PC12细胞置于液氮中冻存，用时临时复苏。置于含体积分数10%胎牛血清、100 U/mL的青霉素、50 U/mL链霉素的DMEM高糖培养基中培养，待约长满培养瓶单层后，用0.25%胰蛋白酶消化，传代于96孔培养板，保存在37 ℃，95%湿度、体积分数5%的CO₂培养箱中。

许旺细胞的获取及培养：许旺细胞取自swiss乳鼠坐骨神经。新生三四天的swiss乳鼠10只，脱颈处死，无菌条件下取双侧坐骨神经并剪碎，无菌PBS洗涤多次，移入含有3 mL 0.25%胰酶和3 mL 0.2% Ⅰ型胶原酶的离心管中，37 ℃条件下混合消化1 h，1 500 r/min离心 10 min，离心半径10 cm，弃上清，向沉淀中加5 mL含体积分数20%胎牛血清的MEM培养基，吹打混匀，移入提前铺有多聚赖氨酸的2.5 mL培养瓶中，37 ℃体积分数5%CO₂培养箱中差速贴壁30 min，取上清液加入到另一培养瓶中培养。重复差速贴壁操作3次后将上清液加入到另一培养瓶中培养。向培养瓶中加入100 μL 阿糖胞苷(100 mg/L)作用24 h待细胞长满瓶底，用0.125 g/L胰蛋白酶消化传代，倒置显微镜下见上层成双极状细胞突起回缩、突起所形成的网络中断后，终止消化， 1 500 r/min离心5 min，离心半径10 cm，弃上清，加入含体积分数10%FBS的DMEM培养液吹打成细胞悬液，计数后传代培养。

心脏营养素1给药：将对数生长的PC12细胞和许旺细胞稀释为1.0×10⁸ L^-1，100 μL/孔种植于96孔板，分正常组、缺血对照组、缺血心脏营养素1组、高温对照组、高温心脏营养素1组5组，每组7孔，待细胞完全贴壁后继续培养12 h。正常组中加入完全培养基(含体积分数10%FBS的DMEM培养基)100 μL；缺血实验中，缺血对照组中加入无血清培养基(纯DMEM培养基)90 μL+心脏营养素1溶媒(无菌DMEM溶液)10 μL；缺血心脏营养素1组中加入无血清培养基90 μL+心脏营养素1溶液(1.0 mg/L) 10 μL；正常组、缺血对照组、缺血心脏营养素1组培养温度为37 ℃。高温实验中，以50 ℃的高温进行培养，高温对照组中加入完全培养基90 μL+心脏营养素1溶媒(无菌DMEM溶液)10 μL，高温心脏营养素1组中加入完全培养基90 μL+心脏营养素1溶液(1.0 mg/L) 10 μL。于细胞培养箱中继续培养24 h后于倒置显微镜下观察细胞生长情况。

细胞板细胞计数：将血球计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板上。无菌吸管吸取细胞悬液少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间，静置3 min。倒置显微镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。

CCK-8比色法检测细胞存活率：向每孔中加入10 μL的CCK-8溶液，继续培养4 h，酶标仪450 nm波长检测每孔A值，计算细胞存活率，并做统计学分析。

乳酸脱氢酶活性测定：损伤作用发生后的24 h，每组收集孔中上清液10 μL，置于细胞板中，取混合液 60 μL(底物缓冲液与氧化型辅酶I溶液体积比5∶1)加入各孔，摇匀，37 ℃水浴15 min。后加入2，4-二硝基苯肼溶液50 μL，摇匀，37 ℃水浴15 min。加入150 μL终止试剂，充分混合，室温放置5 min，440 nm波长处测定，结果做统计学分析。

丙二醛浓度测定：损伤作用发生24 h后，将孔中细胞消化、摇匀，每组收集混合液体2 mL于离心管，加入 2 mL硫代巴比妥酸溶液，摇匀后煮沸10 min，然后立刻放置冷水浴，待冷却后3 000 r/min离心15 min，离心半径10 cm，取上清液并测量体积，以0.5%的硫代巴比妥酸溶液作为空白对照，测定532 nm、600 nm、450 nm处吸光度值并计算丙二醛浓度。

超氧化物歧化酶活性测定：损伤作用发生24 h后，应用超氧化物歧化酶试剂盒，在波长550 nm处测定上清液中总超氧化物歧化酶活性，蒸馏水调零。按照公式计算超氧化物歧化酶活力：

统计学分析：实验数据应用统计分析软件SPSS 21.0，数据采用x(_)±s表示，多组资料均数间的比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t 检验，以P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

心脏营养素1是Pennica于1995年分离出的一种新的细胞因子，是白细胞介素6家族中的一员，最早因被发现具有营养心肌、促使心肌肥大的功能而得名。后来的研究发现，心脏营养素1的效应范围非常广泛，它不仅能够在不影响体质量的情况下增加小鼠心脏湿质量，而且能够刺激肝脏、肾脏、脾脏的生长，提高血液系统中红细胞、血小板、血红蛋白的含量^[5]，支持脊髓运动神经元和多巴胺能神经元和睫状神经节神经元的长期存活，减弱内毒素诱导的急性肺损伤的炎症反应，诱导肝脏的急性期反应等^[6-9]。有研究表明：编码心脏营养素1的mRNA广泛存在于人体多个组织中^[10]，即心脏营养素1在人体多个组织器官中都有表达。心脏营养素1的上述作用机制现已基本明确：心脏营养素1通过靶器官上的受体实现对靶器官的作用，其受体的主要构成成分是白血病抑制因子受体β(LIFR-β)和糖蛋白130(gp130)所形成的异二聚体^[11]；心脏营养素1以自分泌与旁分泌的方式作用于靶器官上的受体^[12]，通过gp130激活细胞内的丝裂素活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)途径或信号传导和转录激活蛋白3 (signal transducer and activator of transcription 3，JAK-STAT)途径，将信号传导到细胞核内，使目的基因转录激活，最终使细胞表现出一定的生物学活性。如激活的是JAK-STAT途径，可促进心肌纤维蛋白的合成，诱导心肌细胞的肥大，如激活的是P42/P44途径，则产生心肌保护作用。无论是用心脏营养素1抗体阻断心脏营养素1，还是用抗LIFR-β和gp130抗体阻断受体复合物，均可明显抑制外源性心脏营养素1对心肌的营养和保护作用。对心脏营养素1组织分布的研究中发现，心脏营养素1在骨骼肌中的表达量较高，是机体心脏营养素1的重要来源，心脏营养素1的两个受体亚基在骨骼肌中均有表达，这说明骨骼肌也是心脏营养素1的效应器之一^[13-14]。

动物实验发现，外源性心脏营养素1对成熟神经元细胞在体存活有重要促进作用，能支持运动神经元、多巴胺能神经元和交感神经元的存活，诱导交感神经元表型，促进大鼠背根节神经元存活，支持成年大鼠运动神经元存活^[15-21]。通过腺病毒心脏营养素1转染的方法治疗进行性运动神经元病小鼠，可以明显延缓运动神经元的死亡，以及运动神经的轴突变性；可以抑制进行性运动神经元病小鼠骨骼肌的失神经的速度，以及提高神经肌肉的功能^[22-24]。

实验采用低分化PC12细胞和许旺细胞，并使用CCK-8比色法检测分析细胞活性，检测实验组和对照组的乳酸脱氢酶活性、丙二醛浓度以及超氧化物歧化酶活性。分化后的PC12细胞在形态和功能上具有典型的神经元特性，作为神经细胞模型被广泛地用于神经细胞凋亡及神经细胞分化等方面的研究^[25]。许旺细胞参与构成了神经细胞的髓鞘并对神经细胞的生长和再生有重要的营养作用^[26-27]。CCK-8的主要成分为水溶性四唑盐(WST-8)，能够被细胞内脱氢酶氧化后生成有色可溶性的甲臜染料，较MTT法测定细胞活性灵敏度更高，细胞毒性更小^[28]。

已有的动物实验尚且无法证明外源性心脏营养素1对神经细胞的直接作用。实验采用体外培养的方式，研究PC12细胞及许旺细胞在外界刺激下的生长情况，以及心脏营养素1对两种细胞的保护作用，排除了在体研究的其他干扰因素，实验结果发现，心脏营养素1的应用提高了神经元在外界刺激下的细胞存活率与细胞活性、从而证实心脏营养素1对神经元的保护作用，其作用机制可能是心脏营养素1与gp130/LIFR复合物结合并激活了下游通路，诱导抗凋亡蛋白表达增加^[29-31]。也有证据表明心脏营养素1转染可减少谷氨酸损伤诱导的神经元细胞凋亡发生^[32]。

实验结果证实心脏营养素1对体外培养的神经元细胞具有保护作用，这一结果的发现进一步明确了心脏营养素1的应用可以延缓神经元退变，为研究心脏营养素1对周围神经损伤修复后的保护作用提供事实依据。已有文献报道，心脏营养素1对骨骼肌细胞具有一定的营养和保护作用。可以预见，心脏营养素1的应用对于神经损伤修复后的神经肌肉功能重建具有重要的促进作用。

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心脏营养素1是Pennica于1995年分离出的一种新的细胞因子，是白细胞介素6家族中的一员，最早因被发现具有营养心肌、促使心肌肥大的功能而得名。后来的研究发现，心脏营养素1的效应范围非常广泛，它不仅能够在不影响体质量的情况下增加小鼠心脏湿质量，而且能够刺激肝脏、肾脏、脾脏的生长，提高血液系统中红细胞、血小板、血红蛋白的含量，支持脊髓运动神经元和多巴胺能神经元和睫状神经节神经元的长期存活，减弱内毒素诱导的急性肺损伤的炎症反应，诱导肝脏的急性期反应等。有研究表明：编码心脏营养素1的mRNA广泛存在于人体多个组织中，即心脏营养素1在人体多个组织器官中都有表达。心脏营养素1的上述作用机制现已基本明确：心脏营养素1通过靶器官上的受体实现对靶器官的作用，其受体的主要构成成分是白血病抑制因子受体β(LIFR-β)和糖蛋白130(gp130)所形成的异二聚体；心脏营养素1以自分泌与旁分泌的方式作用于靶器官上的受体，通过gp130激活细胞内的丝裂素活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)途径或信号传导和转录激活蛋白3 (signal transducer and activator of transcription 3，JAK-STAT)途径，将信号传导到细胞核内，使目的基因转录激活，最终使细胞表现出一定的生物学活性。如激活的是JAK-STAT途径，可促进心肌纤维蛋白的合成，诱导心肌细胞的肥大，如激活的是P42/P44途径，则产生心肌保护作用。无论是用心脏营养素1抗体阻断心脏营养素1，还是用抗LIFR-β和gp130抗体阻断受体复合物，均可明显抑制外源性心脏营养素1对心肌的营养和保护作用。对心脏营养素1组织分布的研究中发现，心脏营养素1在骨骼肌中的表达量较高，是机体心脏营养素1的重要来源，心脏营养素1的两个受体亚基在骨骼肌中均有表达，这说明骨骼肌也是心脏营养素1的效应器之一。

外源性心脏营养素1：保护PC12细胞和许旺细胞的可能性

Exogenous cardiotrophin-1: The possibility to protect PC12 cells and Schwann cells

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