设计:随机对照动物实验。
时间及地点:实验于2010年1月至2011年2月在吉林大学医学部动物实验室完成。
材料:
实验动物:健康清洁级成年新西兰大耳白兔30只,雌雄不限,体质量2.2-2.4 kg,由吉林大学医学部动物实验场提供,动物许可证号:SCXK-(吉)2008-0005,动物饲养2周后进行实验。
实验对动物的处理方法符合中华人民共和国科学技术部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见》[10]。
兔骶神经根超微结构及病理形态学变化检测相关试剂及仪器:
实验方法:
分组及干预:将30只清洁级新西兰兔,随机抽取10只测量骶神经根直径,制成与其直径相匹配的套筒型刺激电极。
将剩余20只实验兔随机分为2组,对照组及植入组,每组10只。对照组不做任何处理正常饲养,植入组麻醉后将刺激电极植入S2及S3神经根前处。
刺激电极的制备:刺激电极采用三极电极(一阴二阳),设定3个钛金属环接触点,接触点厚度0.01 cm,宽 0.1 cm,每个金属接触点相隔0.2 cm。
将钛金属环镶嵌在医用硅胶制成的绝缘管中,绝缘管成圆筒形,一侧留有豁口,其内部直径0.05 cm,电极总长约0.7 cm,电极材料由丹麦奥尔堡大学生物工程系提供,具体见图1,2。
兔骶神经前根直径测量:实验兔采用速眠新Ⅱ(长春市军需大学兽医研究所生产)0.15 mL/kg麻醉,于L1-3棘突为中心竖切口,并切取实验兔双侧S2-3前根[7],所得神经组织立即置入中性甲醛溶液中固定,组织石蜡块连续性切片制成4 μm厚的组织薄片,在二甲苯中脱蜡5- 10 min,染色、脱水和封固,Olympus-BX51电子显微镜下测量骶神经前根直径,取平均值。
刺激电极植入:植入兔以S1-4棘突为中心,切开皮肤、皮下组织,切除椎板后分别显露骶神经前、后根。使用显微外科技术在双侧支配逼尿肌的优势神经根处各植入1枚刺激电极,轻轻压紧钛环,缝合固定刺激电极,见图3。导线缝合固定于皮下,植入后第2天摄腰椎正侧位X射线片,观察刺激电极位置是否良好,见图4。植入后实验兔均单独归于兔笼中饲养,铺好垫料,每日更换;105 U/kg青霉素肌注,连用5 d;切口每日换药1次。
取材:①对照组:实验兔速眠新麻醉后直接取双侧S2及S3前根,取下部分组织采用戊二醛、中性甲醛溶液固定,其他组织放入液氮中备用。②植入组:兔骶神经根刺激电极植入后连续饲养半年,再次复查X射线片,确认电极无脱落后速眠新麻醉,切开原刀口,暴露椎管,观察放置电极处组织有无排斥反应、有无水肿、瘢痕形成及积液。镜下仔细解剖分离骶神经根,以放置电极处为中心切取骶神经根,组织处理方式同对照组。
兔骶神经根超微结构及病理形态学观察:透射电镜下观察,神经轴突有无变化,髓鞘有无松散、脱落或肿胀,粗面内质网和胶元分泌情况,线粒体结构有无变化,许旺细胞有无肿胀,观察粗面内质网(核糖体)变化,神经元是否有核萎缩,核凹陷和异染色质增多等现象。
光学显微镜显微镜下观察兔骶神经根病理学形态,主要观察有无神经结构破坏、出血及炎症细胞浸润;有无神经细胞肿胀,有无囊腔形成及胶质瘫痕。
免疫组织化学染色:将兔神经根组织经石蜡包埋后,按免疫组织化学常规处理石蜡切片,PBS洗10 min;体积分数0.3%H2O2-甲醇处理30 min;高压修复5 min;加入稀释的一抗胶质纤维酸性蛋白、细胞凋亡相关蛋白Bcl-2及Bax、Caspase-3抗体(1∶50),覆盖整个样本,避免干涸,盖保湿盒盖,4 ℃孵育过夜;PBS淋洗样本后加入、辣根过氧化酶标记的二抗(1∶100)防止前带效应的出现,加入过量的二抗;制备DAB显色剂;将样品染色架浸入DAB溶液中,染色15 min;取出样品染色架,双蒸水洗涤3次, 1 min/次;苏木精复染3 min;将样品置于氢氧化铵水溶液中10 s,使核呈蓝色;将样品置于体积分数100%乙醇中脱水;样品置于二甲苯中透明4次,2 min/次。用封片胶封固,干燥后观察,阳性反应为棕黄色颗粒,核为浅蓝色。
采用IDA2000图像分析系统进行图像半定量分析,物镜放大20倍视野下,随机取5个视野,计数每个视野内染色的阳性细胞数,以其平均值作为结果测定值。
主要观察指标:电极植入后各组兔植入处骶神经前根形态,胶质纤维酸性蛋白、Bax、Bcl-2及Caspase-3的表达。
统计学分析:计量资料均以x±s表示,应用SPSS 17. 0统计软件进行统计学分析,组间数据差异的比较采用单因素方差分析和两样本t 检验,P < 0. 05为差异有显著性意义。