脑缺血合并高脂血症模型大鼠脑组织的病理改变

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.33.013

中国组织工程研究

• 组织构建实验造模 experimental modeling in tissue construction • 上一篇下一篇

脑缺血合并高脂血症模型大鼠脑组织的病理改变

张振强¹，宋军营¹，贾亚泉¹，李澎涛²，潘彦舒²

1河南中医学院，河南省郑州市 450046；2北京中医药大学东直门医院，北京市 100029

收稿日期:2013-04-16 修回日期:2013-06-05 出版日期:2013-08-13 发布日期:2013-08-13
通讯作者: 李澎涛，博士，教授，博士生导师，北京中医药大学东直门医院，北京市 100029 Lipengtao0413@hotmail.com
作者简介:张振强☆，男，1971年生，河南省伊川市人，汉族，2012年北京中医药大学毕业，医学博士，副教授，主要从事中西医结合防治脑病基础研究。
基金资助:
国家科技重大专项(2009ZX09502-014)，项目名称：新药研究开发关键技术研究；河南基础与前沿技术计划研究项目(122300410026)，项目名称：不同基础病变条件下脑缺血大鼠模型病理差异性分析。

Pathological changes of brain tissue in a rat model with coexistence of hyperlipidemia and cerebral ischemia

Zhang Zhen-qiang¹, Song Jun-ying¹, Jia Ya-quan¹, Li Peng-tao2, Pan Yan-shu²

1Henan University of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, Henan Province, China; 2Dongzhimen Hospital Affiliated to Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China

Received:2013-04-16 Revised:2013-06-05 Online:2013-08-13 Published:2013-08-13
Contact: Li Peng-tao, M.D., Professor, Doctoral supervisor, Dongzhimen Hospital Affiliated to Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China Lipengtao0413@hotmail.com
About author:Zhang Zhen-qiang☆, M.D., Associate professor, Henan University of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, Henan Province, China
Supported by:
Key State Science and Technology Projects of China, No. 2009ZX09502-014*; Henan Basic and Advanced Technology Research Projects, No. 122300410026*

摘要/Abstract

摘要：

背景：大多数脑缺血是在高血压、高脂血症、糖尿病等基础病变条件下发生的。因此，构建高脂血症复合脑缺血大鼠模型，研究基础性病变对脑缺血的影响具有重要意义。
目的：观察高脂血症复合脑缺血大鼠模型脑组织病理学改变，及其高脂血症病理因素对脑缺血的影响。
方法：实验以高脂饲料喂养大鼠制备高脂血症大鼠模型，然后线栓法制备局灶性脑缺血大鼠模型，建模成功后3，7 d，采用TTC染色的方法，观察各组大鼠脑组织缺血部位体积，苏木精-伊红染色观察各组大鼠脑组织缺血边缘区组织病理学改变，透射电镜观察各组大鼠脑组织缺血边缘区细胞超微结构改变。
结果与结论：TTC染色结果显示高脂+脑缺血7 d组大鼠的脑缺血部位体积明显减小。苏木精-伊红染色结果显示所有脑缺血模型都呈典型的缺血性改变，脑缺血7 d的小胶质细胞数量比3 d的明显减少，高脂+脑缺血7d相对于3 d的变化更明显。超微结构显示所有脑缺血模型的神经元和胶质细胞核膜皱缩，线粒体嵴基本完全消失，内皮细胞线粒体减少，神经突触的突触小泡大部分溶解，缺血7 d，尤其是高脂+脑缺血7 d的上述损伤减轻，神经元变性、坏死减少，线粒体损伤恢复，线粒体嵴也明显增多，神经突触的突触小泡明显恢复。说明高脂血症促进了脑缺血损伤的恢复，其原因可能是高脂血症因素激活了体内某种保护机制。

关键词: 组织构建, 组织构建实验造模, 高脂血症, 单纯脑缺血, 基础性病变, 脑组织, 病理学分析, 脑缺血, TTC染色, 苏木精-伊红染色, 部级基金

Abstract:

BACKGROUND: Cerebral ischemia often occurs in underlying pathological conditions, such as hypertension, hyperlipidemia and diabetes. Therefore, it is of great significance to construct a cerebral ischemia rat model with hyperlipidemia and to study the effect of basic pathological changes on the cerebral ischemia.
OBJECTIVE: To observe the brain tissue pathological changes of rat models with coexistence of hyperlipidemia and cerebral ischemia, and the effect of hyperlipidmia on cerebral ischemia.
METHODS: The rats were fed with high-fat diet to establish the hyperlipidmia models, and then focal cerebral ischemia models were prepared with suture method. At 3 and 7 days after modeling, the 2,3,5- triphenyltetrazolium chloride staining was used to observe the volume of brain tissue ischemia, and hematoxylin-eosin staining was performed to observe pathological change of the margin of the brain tissue ischemia zone.
RESULTS AND CONCLUSION: 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride staining staining results showed that the volume of cerebral ischemia was significantly reduced in the hyperlipidemia+cerebral ischemia 7 day group. Hematoxylin-eosin staining results showed there was typical ischemic changes in all the cerebral ischemia models, and the number of microglial cells after cerebral ischemia for 7 days was significantly smaller than that after cerebral ischemia for 3 days, and the changes were more obvious in the hyperlipidemia+7-day cerebral ischemia group when compared with the hyperlipidemia+3-day cerebral ischemia group. Ultrastructure showed there were neuronal and glial nuclear membrane shrinkage in all the cerebral ischemia models, mitochondria cristae was disappeared completely, endothelial cell mitochondria was decreased, most of the synaptic vesicles of nerve synapse were dissolved; the damages above were improved after ischemia for 7 days, especially hyperlipidemia+cerebral ischemia for 7 days, the neuronal degeneration and necrosis were reduced, the mitochondrial damage was repaired, the number of mitochondrial cristae was increased significantly, and the synaptic vesicles of nerve synapse were recovered significantly. The results indicate that hyperlipidemia can promote the recovery of cerebral ischemic injury, probably because the hyperlipidemia factors can activate the protection mechanism.

Key words: tissue construction, experimental modeling in tissue construction, hyperlipidemia, single cerebral ischemia, basic pathological changes, brain tissue, pathological analysis, cerebral ischemia, 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride staining, hematoxylin-eosin staining, ministerial grants-supported paper

中图分类号:

R318

张振强，宋军营，贾亚泉，李澎涛，潘彦舒 . 脑缺血合并高脂血症模型大鼠脑组织的病理改变[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.33.013.

Zhang Zhen-qiang, Song Jun-ying, Jia Ya-quan, Li Peng-tao, Pan Yan-shu. Pathological changes of brain tissue in a rat model with coexistence of hyperlipidemia and cerebral ischemia[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.33.013.

图/表（结果） 4

2.1 实验动物数量分析一共有100只大鼠，8只在制备脑缺血大鼠模型时或之后死亡，12只因为苏醒后进行神经功能评分为0分或4分而淘汰。共有80只大鼠进入最后结果分析。
2.2 血脂4项检测结果见表2。

与正常组大鼠相比较，高脂组大鼠血清中总胆固醇、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白水平显著增高 (P < 0.05)，而三酰甘油显著降低(P < 0.05)。
2.3 脑缺血合并高脂血症大鼠脑组织缺血体积变化见表3和图1。
脑缺血的大鼠脑组织缺血体积在20%左右。与单纯脑缺血3 d组、单纯脑缺血7 d组及高脂+脑缺血3 d组相比，高脂+脑缺血7 d组大鼠的脑缺血部位体积明显减小，差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.4 脑缺血合并高脂血症大鼠缺血边缘区脑组织病理学变化
2.4.1 苏木精-伊红染色结果见图2。

正常组神经细胞、胶质细胞和内皮细胞形态和数量正常。假手术组神经细胞和内皮细胞形态和数量正常，胶质细胞数量较正常稍多，呈正常形态结构。高脂及高脂+假手术组神经细胞和内皮细胞形态和数量基本正常，胶质细胞数量稍有增加，形态结构正常。所有脑缺血模型都呈现脑组织疏松，神经元大量嗜酸性坏死，呈典型的缺血性改变，胞体缩小，尼氏小体消失，胞核固缩呈三角形或扇形，核仁消失，部分细胞核膜模糊，水肿明显；星形胶质细胞反应增生明显，体积增大，数量增多，部分细胞核膜模糊，胞浆内出现空泡；小胶质细
胞数量发生改变。血管内皮细胞肿胀，细胞间隙增大，细胞间连接破坏。然而，脑缺血7 d的小胶质细胞数量比3 d的明显减少，血管内皮细胞肿胀有所减轻，细胞间连接破坏部分得到恢复，见有少量形态结构正常的神经元。高脂+脑缺血7 d相对于3 d有同样的变化，但更明显，见有较多形态结构基本正常的神经元。
2.4.2 超微结构结果见图3。

电镜下，高脂及高脂+假手术组神经元大部分线粒体嵴正常，有部分线粒体嵴完全消失；粗面内质网明显减少；内皮细胞线粒体嵴变短或减少；神经突触小泡有所减少，线粒体嵴少数变短。所有脑缺血模型的神经元和胶质细胞核膜皱缩，核染色质稀疏，线粒体嵴基本完全消失，嵴间腔明显呈空泡状；粗面内质网减少；内皮细胞线粒体减少；神经突触的突触小泡大部分溶解，线粒体嵴少数变短，嵴间腔扩大或消失。但是，缺血7 d，尤其是高脂+脑缺血7 d的上述损伤减轻，神经元变性、坏死减少，线粒体损伤恢复，线粒体嵴也明显增多，神经突触的突触小泡明显恢复。

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引言

许多研究表明高脂血症是脑卒中、心脏猝死、心肌梗死和冠心病重要而独立的危险因素，即高脂血症与脑血管疾病的发生密切相关^[1-3]。血脂紊乱是动脉粥样硬化发生的始动因素，有研究表明，血脂紊乱可明显损伤动脉内皮细胞，造成内皮脱落、超微结构损害，刺激内膜增生^[4]。即血浆中含量过高的脂质沉积在动脉内膜并刺激结缔组织增生；低密度脂蛋白、高胆固醇血症能够诱发血管内皮功能障碍。血管内皮细胞是高脂血症作用的重要靶细胞，也是内皮细胞损伤的起始环节，损伤的内皮细胞分泌炎症因子和生长因子，如单核细胞趋化蛋白、血小板源性生长因子、转化生长因子β等。

脑缺血本身可激发自身保护机制，包括热休克蛋白，内源性抗氧化剂，抗炎因子及生长因子等^[5-6]。近年研究表明炎症机制在脑缺血损伤发生发展过程中起重要作用，其主要涉及血脑屏障的破坏、脑水肿的发生、炎性细胞的浸润、细胞因子黏附分子的表达，炎症递质的释放以及转录因子的活化等病理环节。脑缺血时，星形细胞、小胶质细胞以及内皮细胞产生的细胞因子，如肿瘤坏死因子α、血小板活化因子，以及白细胞聚集、浸润，蛋白水解酶的作用，自由基及其它效应因子，均可导致毛细血管内皮细胞及其基底膜破坏，诱发血管源性脑水肿^[7-9]。细胞因子对白细胞又有趋化作用，促使白细胞和内皮细胞表达黏附分子，白细胞通过其毒性产物、巨噬细胞作用和免疫反应加重缺血性损伤^[10]。各因素间彼此交织，相互影响，从而形成一个复杂的网络体系。

高脂血症从发病机制的特点来看，一方面已经发生了脑组织的相对缺血缺氧及炎症反应，另一方面引起血管损伤并激活血管内皮细胞。这些特征与急性脑缺血的主要病理过程相似，但是，目前还不清楚缺血前脑部的特异性病理改变已有哪些？是否已经激活了相应的大脑保护机制而出现“预处理”或“预适应”效果？缺血后脑部的特异性病理改变又有哪些？脑损伤因素及脑保护因素是否有累积效应？因此，对高脂血症及高脂血症复合脑缺血的病理基础的研究成为近些年国内外研究的热点之一，但是关于高脂血症复合脑缺血的病理学分析尤其超微结构的改变的研究鲜有报道。实验在前期研究的基础上，通过组织病理学，超微结构观察分析高脂血症对脑缺血大鼠脑部组织的影响。

材料方法

设计：体内动物实验，形态组织学观察。

时间及地点：实验于2011年6月至2012年3月在河南中医学院动物实验研究中心和病理实验研究中心完成。

材料：

实验动物：健康雄性SPF级Wistar大鼠100只，体质量280-300 g，购买于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号为：SCXK(京)2007-0001，质量合格证号：0243109。

研究脑缺血合并高脂血症模型大鼠脑组织病理改变所用主要仪器与试剂：

实验方法：

实验动物分组：实验大鼠随机分为8组，正常组、高脂血症组、假手术组、高脂+假手术组，每组10只；单纯脑缺血3 d组、单纯脑缺血7 d组、高脂+脑缺血3 d组、高脂+脑缺血7 d组，每组15只。各组处理方法见表1。脑缺血3 d和7 d是分别在脑缺血造模3 d和7 d后取材进行检测。

高脂血症大鼠模型制备：大鼠每天以高脂饲料(组成：3.5%胆固醇、10%猪油、0.2%丙硫氧嘧啶、0.5%胆酸钠、5%白糖、80.8%基础饲料)喂养，4周后对照组与高脂血症组分别断尾取血0.5-1.0 mL，检测血脂4项，高脂血症组血脂指标与对照组相比较具有明显区别，则说明模型制备成功，否则继续饲养。同时，对照组以清洁级正常饲料喂养。

脑缺血大鼠模型制备：高脂血症模型制备成功后，禁食8 h，开始制作脑缺血模型。根据Longa^[11]报道的线栓法建立大鼠局灶性脑缺血模型，以10%水合氯醛溶液 (3 mL/kg)腹腔注射麻醉。麻醉后将大鼠仰位固定，颈部正中切口，暴露左侧颈动脉三角，逐层分离组织，依次分离左侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉。分离颈外动脉的分支甲状腺动脉，并电刀凝闭；分离颈外与颈内动脉之间的枕动脉，电刀凝闭。结扎游离颈外动脉主干，分离颈内动脉主干至翼鳄动脉，用无损动脉夹分别夹闭左侧颈总动脉、颈内动脉和翼鳄动脉，用虹膜剪在颈外动脉残端剪一楔形小口，由此插入钓鱼线(直径约 0.25 mm，头端加热呈直径为0.3 mm的圆球形)，轻推钓鱼线使之由颈外动脉通过分叉部进入颈内动脉，至大脑中动脉的起点，插入深度为18-22 mm，阻断大脑中动脉的血液供应，缝合颈部切口。假手术组手术过程相同，分离出左侧颈总动脉及颈外动脉，颈内动脉，但仅结扎游离颈外动脉。动物苏醒后进行神经功能评分，根据评分结果进行下一步实验。

血脂4项检测：模型制备成功后，每组各取动物5只，以10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉，背位固定于鼠板上，腹主动脉取血5 mL，静置30 min，以3 000 r/min离心15 min，离心半径12 cm。取上清液，-20 ℃冰箱冷冻备用。血清中总胆固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白含量，用全自动生化分析仪进行检测。

脑组织TTC染色计算缺血部位体积：取血后，快速断头，小心快速取出全脑，置-20 ℃冰箱冷冻20 min，取出第1刀在脑前极与视交叉连线中点处；第2刀在视交叉部位；第3刀在漏斗柄部位；第4刀在漏斗柄与后叶尾极之间，切成五六片，每隔2 mm切一片。将切片置于1%TTC(四氮唑红)中，用锡箔纸盖住后，放入37 ℃水浴锅中避光染色10-30 min，不时翻动脑片，使均匀接触到染色液，染色后进行拍照，观察脑组织缺血坏死区面积的大小，未缺血坏死区颜色呈淡红色，已缺血坏死组织呈白色。移入40 g/L多聚甲醛中固定，24 h后用数码相机拍照，输入计算机，用图像处理软件(Adobe，Photoshop 5.0)计算梗死面积(粉红色区为正常脑组织，白色区为梗死区)，各脑片梗死面积和乘以厚度(2 mm)为总的梗死体积。

脑缺血部位体积比(%)=缺血部位体积/全脑体积

组织病理学观察：每组再各取动物5只，以10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉，背位固定于鼠板上，剪开胸腔，暴露出心脏，先用手术剪剪开右心耳，再用100 mL注射器进入左心室插进主动脉，先灌注生理盐水150 mL左右，再灌注多聚甲醛400 mL左右，断头取出全脑。脑部分为2部分，其中一部分置于40 g/L多聚甲醛固定，脱水、透明、浸蜡、包埋、冠状切片，厚4 μm，制作常规病理切片，进行苏木精-伊红染色后用光学显微镜观察；另一部分定位后取脑缺血侧顶叶取1 mm×1 mm×5 mm小块，并切成1 mm×1 mm×1 mm大小，用4%戊二醛固定，2 h后更换一次固定液，环氧树脂Epon-812包埋，制作电镜超薄切片，醋酸铀及柠檬酸铅双重染色，透射电镜观察并摄片。

主要观察指标：脑缺血合并高脂血症模型大鼠脑组织病理改变。

统计学分析：采用SPSS 13.0数据分析软件对所有实验数据进行统计处理。实验数据以x(_)±s表示，采用单因素方差分析比较组间差异，以P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

脑组织的坏死及神经功能的受损是脑缺血病变的主要特点。炎症反应、自由基损伤、钙离子超载等能够引发脑组织的神经元的凋亡和坏死^{[1-2, 12-13]}。高脂血症可引发主动脉病变，表现为血管紧张，血管壁变薄，内膜脂质沉积，内皮细胞损伤、脱落、增生，内弹性膜断裂，内弹性膜紧张，平滑肌细胞肌动蛋白表达增加，细胞外基质增多，外膜变薄^[14-16]。血管内皮细胞的完整性是维持正常血流状态、血管通透性及防御炎症反应的基础^[17]。高脂血症可引起内皮细胞损伤，尤其氧化型低密度脂蛋白是造成内皮细胞损伤、诱导内皮细胞促炎症分子表达的主要因素^[18]。另一方面，动脉硬化使血管管径狭窄，能够引起脑组织相对的、缓慢进程的缺血缺氧，诱发脑组织一系列的病理反应，包括胶质细胞、内皮细胞、基质成分等结构和功能的改变^[19]。笔者前期研究表明，高脂血症模型血清炎症因子单核细胞趋化蛋白、肿瘤坏死因子α等表达增高^[20]。高脂血症模型脑组织中神经元的线粒体嵴基本正常，部分线粒体嵴完全消失；粗面内质网明显减少；内皮细胞线粒体嵴变短或减少；神经突触小泡有所减少，线粒体嵴少数变短^[21]。高脂+脑缺血3 d缺血部位脑组织坏死严重，缺血边缘区均有大量神经元变性、坏死、肿胀，线粒体损伤明显；微血管内皮细胞肿胀，连接破坏，线粒体损伤。缺血7 d，其水肿减轻，线粒体损伤减轻，凋亡细胞较少；内皮细胞肿胀减轻，线粒体损伤恢复明显。这些结果表明高脂+脑缺血大鼠模型在缺血7 d，脑损伤比单纯脑缺血大鼠模型恢复较快，提示高脂血症病理因素可能激活了体内某种保护机制。

有研究报道，高脂血症引起的炎症反应可能通过使兴奋性氨基酸增多，细胞内外离子失衡等一系列病理生理变化，可能激活星形胶质细胞^[22-23]。星形胶质细胞被炎症因子激活后，能够促进一系列基因的转录和翻译，可能抑制损伤蛋白的合成，并有利于保护新蛋白的合成^[12]。星形胶质细胞不仅具有修复功能，在外伤、缺氧等损伤中，星形胶质细胞激活，保护神经元损伤，促进神经元的存活^[24]。研究结果显示，高脂血症模型脑组织

中胶质细胞数量稍有增加，形态结构正常；高脂+脑缺血3 d的缺血边缘区星形胶质细胞广泛被激活，表现为数量明显增多、胞体增大、胞突变粗，出现较多小胶质细胞；这种病理改变在高脂+脑缺血7 d仍然存在，星形胶质细胞数量减少不明显，但是小胶质细胞明显减少，说明星形胶质细胞活性的增加可能在缺血后期的脑部保护中具有重要功能作用。高脂血症条件下胶质细胞的应激反应较为强烈，数量增多、形态变化较大，推测胶质细胞活性的增加可能起着重要作用。小胶质细胞为中枢神经系统炎症和免疫反应的效应细胞，对脑组织内微小的病理变化即发生强烈反应，在脑缺血和损伤时尤为显著^[25-26]。小胶质细胞在脑缺血早期参与缺血性神经元的损害过程^[27]。小胶质细胞的数量与神经元的数量相当，当其受到刺激后迅速被活化，形态和功能发生明显改变；急性脑缺血是导致小胶质细胞活化的重要因素之一^[28-29]。小胶质细胞的活化状态与脑内受损部位的炎症程度密切相关，而且，能够分泌细胞因子对神经发生进行调节^[30-31]。小胶质细胞也参与一系列神经退行性疾病的发生，其活化和神经炎症为神经病理学的主要特征。在急性神经系统性疾病(中风、脑缺氧、脑损伤)中，小胶质细胞表型发生改变，释放炎症递质，加重神经元损伤；恢复期释放的炎症介质主要为细胞因子和趋化因子，这些炎症介质主要对神经细胞的存活是有益的，能够使脑内的继发性损伤减轻，使受损的组织得到修复^{[29, 32]}。研究结果提示缺血早期小胶质细胞具有损伤作用，缺血晚期具有修复保护作用，这可能与高脂血症诱发体内炎症反应有关。在炎性因子慢性刺激作用下，小胶质细胞持续分泌细胞因子和趋化因子等生物活性物质，这些物质对神经元有保护作用，与相关研究报道一致。有研究表明，在脑损伤的中晚期，小胶质细胞可能具有重要的促进修复作用，对脑缺血晚期的血管形成、突触重组和轴突出芽有一定的影响^[33-34]。这也充分说明炎症反应参与了高脂血症高脂和脑缺血病理条件的改变，分子水平的实验结果与之一致。

总之，高脂血症复合脑缺血的炎症反应是一个更复杂的病理生理过程，实验从病理生理学上分析发现高脂血症促进了脑缺血损伤的恢复，为从其它方面更深入的研究其具体的发病机理提供可靠依据。

脑缺血合并高脂血症模型大鼠脑组织的病理改变

Pathological changes of brain tissue in a rat model with coexistence of hyperlipidemia and cerebral ischemia

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