透骨消痛颗粒含药血清诱导骨髓基质干细胞向软骨细胞分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.32.018

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (32): 5863-5870.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.32.018

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透骨消痛颗粒含药血清诱导骨髓基质干细胞向软骨细胞分化

刘伯龄¹，李西海²，肖丽春¹，梁珪清¹，吴广文²，李照辉¹，陈其勇¹

1福建中医药大学附属福州中西医结合医院(福州市第二医院)，福建省福州市 350007
2福建中医药大学中西医结合研究院，福建省福州市 350108

收稿日期:2012-11-19 修回日期:2012-12-12 出版日期:2013-08-06 发布日期:2013-08-06
作者简介:刘伯龄☆，男，1976年生，江西省新干县人，汉族，2006年苏州大学毕业，博士，主治医师，主要从事骨关节疾病基础与临床研究。 liuboling2000@126.com
基金资助:
国家自然科学基金资助(81001530)；福建省自然科学基金(2011J05074)；福州市科技计划项目(2011-S-67-1)。

Tougu Xiaotong Granule containing serum induces cartilage differentiation of bone marrow stromal stem cells

Liu Bo-ling¹, Li Xi-hai², Xiao Li-chun¹, Liang Gui-qing¹, Wu Guang-wen², Li Zhao-hui¹, Chen Qi-yong¹

1Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine (Second Hospital of Fuzhou), Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350007, Fujian Province, China
2Academy of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350108, Fujian Province, China

Received:2012-11-19 Revised:2012-12-12 Online:2013-08-06 Published:2013-08-06
About author:Liu Bo-ling, M.D., Attending physician, Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine (Second Hospital of Fuzhou), Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350007, Fujian Province, China liuboling2000@126.com
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81001530*; Natural Science Foundation of Fujian Province, No. 2011J05074*; Scientific Plan Projrct of Fuzhou City, No. 2011-S-67-1*

摘要/Abstract

摘要：

背景：骨髓基质干细胞根据环境而有不同的分化路径，在特定的环境中有分化为透明软骨细胞的趋势，可能为治疗骨性关节炎提供新思路。
目的：观察透骨消痛颗粒含药血清对骨髓基质干细胞向软骨分化的影响。
方法：取SD大鼠四肢建立体外培养的骨髓基质干细胞，取第3代骨髓基质干细胞进行干预，分为生理盐水血清组、透骨消痛颗粒水提物血清组、透骨消痛颗粒醇提物血清组、诱导软骨剂组、透骨消痛颗粒水提物血清+诱导软骨剂组、透骨消痛颗粒醇提物血清+诱导软骨剂组。Real time PCR及Western Blot检测Sox9、collagen Ⅱ、collagen Ⅹ mRNA及蛋白表达。
结果与结论：含药血清干预14 d后，Sox9、 collagen Ⅱ、collagen Ⅹ mRNA及蛋白表达水平，透骨消痛颗粒水提物血清组、透骨消痛颗粒醇提物血清组、诱导软骨组、透骨消痛颗粒水提物血清+诱导软骨剂组、透骨消痛颗粒醇提物血清+诱导软骨剂组明显高于生理盐水血清组(P < 0.05，P< 0.01)，诱导软骨组、透骨消痛颗粒水提物血清+诱导软骨剂组、透骨消痛颗粒醇提物血清+诱导软骨剂组明显高于透骨消痛颗粒水提物血清组、透骨消痛颗粒醇提物血清组(P < 0.01)，其中Sox9表达透骨消痛颗粒水提物血清+诱导软骨剂组高于诱导软骨。说明透骨消痛颗粒含药血清通过上调Sox9的表达，加速骨髓基质干细胞细胞向软骨细胞分化。

关键词: 干细胞, 干细胞与中医药, 骨性关节炎, 透骨消痛颗粒, 骨髓间充质干细胞, 软骨分化, 含药血清, 水提物, 醇提物, 补肾活血, 软骨细胞, 种子细胞, 国家自然科学基金, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Bone marrow stromal stem cells have multilineage differentiation capacity and can differentiate into transparent chondrocytes under certain conditions, which can provide new thoughts for treatment of osteoarthritis.
OBJECTIVE: To investigate the effects of Tougu Xiaotong Granule containing serum on the cartilage differentiation of bone marrow stromal stem cells.
METHODS: Bone marrow stromal stem cells from Sprague-Dawley rat limbs were cultured in vitro, and those cells at passage 3 were used in the study. Cells were divided into six groups: saline serum group, Tougu Xiaotong Granule water extract group, Tougu Xiaotong Granule alcohol extract group, chondroinductive group, Tougu Xiaotong Granule water extract and chondroinductive group, Tougu Xiaotong Granule alcohol extract and chondroinductive group. The Sox9, collagen Ⅱ, and collagen X mRNA and protein expression levels were tested by real-time polymerase chain reaction and western blot analysis.
RESULTS AND CONCLUSION: After cells were intervened with drug-containing serum for 14 days, the Sox9, collagen Ⅱ, and collagen X mRNA and protein expression in Tougu Xiaotong Granule water extract group, Tougu Xiaotong Granule alcohol extract group, chondroinductive group, Tougu Xiaotong Granule water extract and chondroinductive group, Tougu Xiaotong Granule alcohol extract and chondroinductive group were significantly higher than that in saline serum group (P < 0.05, P < 0.01). In addition, the chondroinductive group, Tougu Xiaotong Granule water extract serum and chondroinductive group, Tougu Xiaotong Granule alcohol extract and chondroinductive group showed significantly higher expression levels than Tougu Xiaotong Granule water extract serum group, Tougu Xiaotong Granule alcohol extract group (P < 0.01). Sox9 expression in Tougu Xiaotong Granule water extract serum and chondroinductive group were significantly higher than that in the chondroinductive group. Experimental findings indicate that, Tougu Xiaotong Granule containing serum can accelerate bone marrow stromal stem cells differentiate into cartilage cells by up-regulation of Sox9 expression.

Key words: stem cells, stem cells and traditional Chinese medicine, osteoarthritis, Tougu Xiaotong Granule, bone marrow mesenchymal stem cells, cartilage differentiation, drug-containing serum, water extract, alcohol extract, invigorate the kidney and promote blood flow, cartilage cells, seed cells, National Natural Science Foundation of China, stem cell photographs-containing paper

中图分类号:

R394.2

刘伯龄，李西海，肖丽春，梁珪清，吴广文，李照辉，陈其勇 . 透骨消痛颗粒含药血清诱导骨髓基质干细胞向软骨细胞分化[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(32): 5863-5870.

Liu Bo-ling, Li Xi-hai, Xiao Li-chun, Liang Gui-qing, Wu Guang-wen, Li Zhao-hui, Chen Qi-yong . Tougu Xiaotong Granule containing serum induces cartilage differentiation of bone marrow stromal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(32): 5863-5870.

图/表（结果） 9

2.1 实验动物数量分析 在制备含药血清过程中，实验共纳入108只SD大鼠，在灌胃过程中，因药物溶液返流导致透骨消痛颗粒水提物低剂量组、透骨消痛颗粒醇提物高剂量组及生理盐水组各有1只误吸死亡，其余大鼠均进入结果分析。
2.2 含药血清干预后骨髓基质干细胞的形态变化 生理盐水组细胞形态见图1。

透骨消痛颗粒水提物血清组及醇提物血清组，可见少量骨髓基质干细胞细胞向软骨细胞分化，见图2，3。

诱导软骨剂组骨髓基质干细胞的形态发生明显的变化，可见大量骨髓基质干细胞向软骨细胞分化，见图4。

透骨消痛颗粒水提物血清及醇提物血清+诱导软骨剂组，骨髓基质干细胞向软骨细胞分化的数量明显增多，见图5，6。

2.3 含药血清干预后骨髓基质干细胞 Sox9、collagen Ⅱ、collagen Ⅹ mRNA表达的变化 含药血清干预14 d后，Sox9 mRNA表达水平，透骨消痛颗粒水提物血清组、透骨消痛颗粒醇提物血清组、诱导软骨组、透骨消痛颗粒水提物血清+诱导软骨剂组、透骨消痛颗粒醇提物血清+诱导软骨剂组明显高于生理盐水血清组 (P < 0.05，P < 0.01)，诱导软骨组、透骨消痛颗粒水提物血清+诱导软骨剂组、透骨消痛颗粒醇提物血清+诱导软骨剂组明显高于透骨消痛颗粒水提物血清组、透骨消痛颗粒醇提物血清组(P < 0.01)，透骨消痛颗粒水提物血清+诱导软骨剂组高于诱导软骨组(P < 0.05)，见图7。
collagen Ⅱ、collagen Ⅹ mRNA表达水平，透骨消痛颗粒水提物血清组、透骨消痛颗粒醇提物血清组、诱导软骨组、透骨消痛颗粒水提物血清+诱导软骨剂组、透骨消痛颗粒醇提物血清+诱导软骨剂组明显高于生理盐水血清组(P < 0.05，P < 0.01)，诱导软骨组、透骨消痛颗粒水提物血清+诱导软骨剂组、透骨消痛颗粒醇提物血清+诱导软骨剂组明显高于透骨消痛颗粒水提物血清组、透骨消痛颗粒醇提物血清组(P < 0.01)，见图8，9。

2.4 含药血清干预后骨髓基质干细胞 Sox9、collagen Ⅱ、collagen Ⅹ 蛋白表达的变化 含药血清干预14 d后，各组Sox9、collagen Ⅱ、collagen X蛋白表达水平，见图10。Sox9 蛋白表达水平，透骨消痛颗粒水提物血清组、透骨消痛颗粒醇提物血清组、诱导软骨组、透骨消痛颗粒水提物血清+诱导软骨剂组、透骨消痛颗粒醇提物血清+诱导软骨剂组明显高于生理盐水血清组(P < 0.01)，诱导软骨组、透骨消痛颗粒水提物血清+诱导软骨剂组、透骨消痛颗粒醇提物血清+诱导软骨剂组明显高于透骨消痛颗粒水提物血清组、透骨消痛颗粒醇提物血清组(P < 0.01)，透骨消痛颗粒水提物血清+诱导软骨剂组高于诱导软骨组(P < 0.05)，见图11。

collagen Ⅱ、collagen X蛋白表达水平，透骨消痛颗粒水提物血清组、透骨消痛颗粒醇提物血清组、诱导软骨组、透骨消痛颗粒水提物血清+诱导软骨剂组、透骨消痛颗粒醇提物血清+诱导软骨剂组明显高于生理盐水血清组(P < 0.01)，诱导软骨组、透骨消痛颗粒水提物血清+诱导软骨剂组、透骨消痛颗粒醇提物血清+诱导软骨剂组明显高于透骨消痛颗粒水提物血清组、透骨消痛颗粒醇提物血清组(P < 0.01)，见图12,13。

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引言

材料方法

设计：细胞学对比观察实验。

时间和地点：2012年6月25日在福建中医药大学实验动物中心鼠类实验室及中西医结合研究院完成。

材料：

实验动物：健康清洁级雄性SD大鼠108只，2月龄，体质量(220±10) g，制备含药血清；健康清洁级雄性SD大鼠10只，4周龄，体质量(80±5) g，用于制备骨髓基质干细胞。SD大鼠均购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK(沪)2007-0005。福建中医学院实验动物中心鼠类实验室提供清洁级医学实验动物环境设施(合格证号：医动学第23-016号)。实验过程中对动物的处置符合医学伦理学标准。

透骨消痛颗粒含药血清对骨髓基质干细胞向软骨分化影响实验的主要试剂及仪器：

实验方法：

透骨消痛颗粒水提物与醇提物制备：透骨消痛颗粒的原方由巴戟天、白芍、川芎、肿节风组成，药物均购自福建中医药大学附属第二人民医院。①水提取物的制备：取药物粉碎后加双蒸水，浸泡2 h，每次煮沸 1 h，共3次，合并药液，以3 000 r/min离心30 min，离心半径13.5 cm，取上清，浓缩至1 g/mL，4 ℃冰箱保存。②醇提取物的制备：取药物粉碎，以体积分数95%乙醇回流提取3次，每次1 h，回收乙醇至尽，得到浸膏，再加双蒸水，制成1 g/mL生药的混悬液，4 ℃冰箱保存。

透骨消痛粒水提物与醇提物含药血清的制备：108只SD大鼠随机摸球法均分为生理盐水组、透骨消痛方水、醇提物组(n=36)，各组再分别分为水、醇提物低、中、高剂量组(n=12)。用药剂量相当于临床等效剂量，根据“人和动物体表面积折算的等效剂量比率表”计算^[4]，中剂量水、醇提物组分别将透骨消痛颗粒临床等效剂量 0.29 g/(kg•d)灌胃，低剂量组给予0.145 g/(kg•d)灌胃，高剂量组给予0.58 g/(kg•d)灌胃，生理盐水组低中高剂量均给予等量生理盐水，2次/d，连续灌胃给药3 d，第4天1次服用全天剂量，采血前禁食12 h，末次给药3 h后腹主动脉采血，以3 000 r/min离心15 min，离心半径13.5 cm，分离血清，56 ℃水浴30 min，灭活，抽滤，-20 ℃冰箱保存备用。根据课题组前期实验结论^[7-9]，实验后续研究选用中剂量0.29 g/(kg•d)生理盐水和水、醇提物进行。

建立骨髓基质干细胞体外培养：4周龄SD大鼠处死后，无菌条件下分离四肢，体积分数75%乙醇浸泡 15 min，用含体积分数10%FBS的DMEM培养基冲洗四肢的骨髓腔，细胞以2×10⁹ L^-¹的浓度接种于培养瓶，37 ℃体积分数5%CO₂常规培养。72 h后首次换液，以后每2 d换液1次，细胞生长至80%-90%时，0.25%胰蛋白酶消化，细胞计数板计数，调整细胞浓度，传代培养。

透骨消痛方水提物与醇提物含药血清的干预方法：取第3代骨髓基质干细胞，按照不同的干预方式分为生理盐水血清组、透骨消痛颗粒水提物血清组、透骨消痛颗粒醇提物血清组、诱导软骨剂组、透骨消痛颗粒水提物血清+诱导软骨剂组、透骨消痛颗粒醇提物血清+诱导软骨剂组，其中诱导软骨剂各组添加正常血清软骨诱导剂(转化生长因子3 10 µg/L、维生素C 50 mg/L、地塞米松 10 mol/L)，体积分数10%含药血清干预，培养14 d收集细胞，采用显微镜观察骨髓基质干细胞细胞的形态变化，Real time PCR检测骨髓基质干细胞中Sox9、collagen Ⅱ、collagen Ⅹ mRNA表达，Western Blot检测检测骨髓基质干细胞中Sox9、collagen Ⅱ、collagen Ⅹ蛋白表达。

Real time PCR检测骨髓基质干细胞中Sox9、collagen Ⅱ、collagen Ⅹ mRNA表达：干预14 d，Trizol法提取骨髓基质干细胞总RNA，核酸-蛋白定量仪检测RNA的纯度，取2 μg RNA反转录成cDNA，以此cDNA为模板行Real time PCR扩增Sox9(forward 5’-ATC TGA AGA AGG AGA GCG AG-3’ and reverse 5’- TTC AGC AGT CTC CAG AGC TTG-3’，264 bp)、collagen Ⅱ(forward 5’-TCC CTC TGG TTC TGA TGG TC-3’ and reverse 5’-CTC TGT CTC CAG ATG CAC CA-3’，161 bp)、collagen Ⅹ(forward 5’- GAA ACA GG TGT CTG ACT TAC-3’ and reverse 5’- TAC TTC CAG TGG AAT AGA AG-3’，141 bp)、β-actin (forward 5’-CGT TGA CAT CCG TAA AGA CC-3’ and reverse 5’-GGA GCC AGG GCA GTA ATC T-3’， 108 bp)，Primer5.0设计引物序列。

PCR扩增反应条件：94 ℃ 4 min，(94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s)，40循环。溶解曲线分析Real time PCR的特异性。基因表达的差异分析，以β-actin为内参照基因，采用2^-^ΔΔ^Ct法计算。

Western Blot检测骨髓基质干细胞中Sox9、collagen Ⅱ、collagen Ⅹ的蛋白表达：骨髓基质干细胞干预14 d，裂解细胞提总蛋白，采用BCA法蛋白定量。制备分离胶、浓缩胶，加入等体积的上样缓冲液混匀，煮沸处理10 min后，即行SDS-PAGE电泳分离蛋白，用半干转膜仪将分离后的蛋白转移至PVDF膜上，体积分数5% BSA溶液封闭转移膜，加入一抗Sox9、collagen Ⅱ、collagen Ⅹ、β-actin，4 ℃过夜，洗膜后，加入HRP标记的IgG二抗，室温孵育1 h，以Bio-rad ChemiDoc XRS System凝胶成像系统分析蛋白表达的差异，采用目的蛋白的吸光度值/β-actin的吸光度值。

主要观察指标：各组骨髓基质干细胞向软骨分化及细胞表型稳定的情况。

统计学分析：采用SPSS 13.0统计软件处理数据，计量资料采用x(_)±s表示，组间比较用单因素方差分析，多重比较用SNK-q检验，P < 0.05表示差异有显著性意义。

讨论

关节软骨因损伤而导致退变，甚至发生退行性骨关节炎，随着人口的老龄化骨关节炎的发病率正在逐渐增加。由于没有神经、血管和淋巴的分布，软骨虽然有一定的自我修复能力，但是大于5 mm以上的局部软骨损伤就很那进行自我修复，关节炎类软骨疾病一直不能得到很好的手术治疗^[10-11]。软骨组织的传统修复方法是自体组织分离的软骨细胞经体外培养，但是却面临着成熟软骨组织扩增能力有限，随着传代次数的增加，细胞逐渐老化而丧失增殖能力，难以满足组织构建需要和逐渐丧失其原有特性而分化成其他组织的问题。而骨髓干细胞具有自我更新和多功能分化潜能的特性，在适当培养条件下可被诱导分化成软骨细胞，通过体细胞核转移技术有可能提供无免疫原性的“通用型”种子细胞，这将为软骨疾病的治疗提供大量的健康备用组织^[12-14]。因此，干细胞向软骨细胞的分化成为医学界的热点研究问题之一。

关节及其软骨属“奇恒之腑”，其形成与功能与先天之肾和后天脾胃之气血密切相关。关节退变疾病中、后期多有“血瘀肾亏”的表现。所谓“积劳受损，经脉之气不及贯穿”、“肾不生则髓不能满”，导致“不荣则痛”和“不通则痛”等症状体征。此外，“肝主筋”，而“筋”又涵盖软骨，故而软骨与肝血的关系最为密切^[15]。对于关节软骨损伤(退变)，最为密切的即为骨性关节炎，其病机主要是肾精亏虚，瘀血痹阻。针对这一理论，在治疗骨性关节炎时，有人用补肾活血的方法进行研究，得出：补肾中药与活血中药均能保护软骨细胞及维持软骨的完整性，延缓软骨内胶原的破坏及性质改变，抑制滑膜炎症及增生^[16]。透骨消痛颗粒是福建中医学院附属第二人民医院的院内制剂，由巴戟天、杭白芍、川芎和肿节风组成，具有补肝肾、强筋骨、止痹痛的功效，长期用于临床，治疗骨性关节炎(早、中期)有较好疗效^[17-18]。该方以“肾主骨”、“肝主筋”等中医理论为依据，以补肾作为治疗骨性关节炎的根本法则(药以巴戟天补肾治本)，佐以四要：①补肾要养肝，肝肾同源，肝肾同健痹自歼(白芍养血柔肝以助固本)。②补肾要活血，血行痹自解(川芎活血行血，血行风自灭)。③补肾要止痛，痛解痹自停(川芎能活血通络，白芍能柔肝止痛）。④补肾要祛邪，邪去痹自灭(肿节风祛风除湿而止痹痛)^[19]。此外，川芎和白芍两者合用，活血、养血兼顾，疏肝、柔肝并举，使其活血而不伤正，疏肝开郁而不损肝阴。

软骨细胞分化通过许多细胞因子、生长因子和分子信号进行调节，不同生长因子对产生软骨细胞的作用能力不同。骨形成蛋白家族和SOX9在促进软骨分化和增殖中起着很重要的作用，其中Sox9通过自身直接或间接作用，以及参与其他信号共同调节软骨细胞的增殖和分化，在胚胎早期软骨内成骨中发挥重要的调控作用。在胚胎发育的过程中，软骨前体细胞及软骨细胞均表SOX9^[20-21]。体外培养的干细胞失去SOX9功能后导致分化软骨细胞缺陷，而异位SOX9的表达可以使非软骨组织表达collagen Ⅱ、SOX基因家族的另外两个成员L-SOX5、SOX6和SOX9联合作用可以成功诱导干细胞向软骨细胞分化，此诱导不受培养条件的影响，同时还抑制肥大细胞的分化过程。目前研究表明，cAMP（环腺苷酸）能够促进软骨细胞Ⅱ型胶原特异性增殖基因Col2a1的mRNA表达，通过cAMP依赖性PK A磷酸化Sox9后，Sox9与Col2a1的结合能力增加，Col2a1在软骨细胞中的表达与Sox9的浓度呈正比关系，证实Col2a1是Sox9依赖性的软骨细胞特异性增殖基因^[22-23]。Col2a1是软骨细胞表型基因之一，也是软骨细胞的特异性标志蛋白之一。本实验结果显示，透骨消痛颗粒单独使用具有较弱的诱导骨髓基质干细胞向软骨细胞分化，跟软骨诱导剂合用时，能明显增强干细胞向软骨细胞的分化，且明显促进Sox9的表达，提示透骨消痛能通过促进sox9的表达诱导骨髓基质干细胞向软骨细胞分化，同时还能增加细胞的collagen Ⅱ、collagen X表达。

透骨消痛颗粒含药血清诱导骨髓基质干细胞向软骨细胞分化

Tougu Xiaotong Granule containing serum induces cartilage differentiation of bone marrow stromal stem cells

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