骨髓单个核细胞移植后心肌梗死区的血管生成及细胞因子分泌

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.32.015

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (32): 5840-5846.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.32.015

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骨髓单个核细胞移植后心肌梗死区的血管生成及细胞因子分泌

唐洁^1，2，陈涛²，米杰²，徐爱国²，王勇德²，张健²，齐向前²

1武警后勤学院附属医院武警病房，天津市 300162
2天津医科大学心血管病临床学院泰达国际心血管病医院内二科，天津市 300457

收稿日期:2013-04-08 修回日期:2013-06-05 出版日期:2013-08-06 发布日期:2013-08-06
通讯作者: 齐向前，博士，教授，主任医师，天津医科大学心血管病临床学院泰达国际心血管病医院内二科，天津市 300457 Qixq@tedaich.com
作者简介:唐洁☆，女，1979年生，湖南省永州市人，汉族，2008年天津医科大学毕业，博士，主要从事干细胞移植方面的研究。 amtangtang@163.com
基金资助:
天津市卫生局课题(04KY63)基金资助。

Effect of bone marrow mononuclear cell transplantation on angiogenesis and expression of cytokines following myocardial infarction

Tang Jie^{1, 2}, Chen Tao², Mi Jie², Xu Ai-guo², Wang Yong-de², Zhang Jian², Qi Xiang-qian²

1Armed Police Forces Ward, the Affiliated Hospital of Logistics University of Chinese People’s Armed Police Forces, Tianjin 300162, China
2Second Department of Cardiovascular Diseases, TEDA International Cardiovascular Hospital, Tianjin Medical University, Tianjin 300457, China

Received:2013-04-08 Revised:2013-06-05 Online:2013-08-06 Published:2013-08-06
Contact: Qi Xiang-qian, M.D., Professor, Chief physician, Second Department of Cardiovascular Diseases, TEDA International Cardiovascular Hospital, Tianjin Medical University, Tianjin 300457, China Qixq@tedaich.com
About author:Tang Jie☆, M.D., Armed Police Forces Ward, the Affiliated Hospital of Logistics University of Chinese People’s Armed Police Forces, Tianjin 300162, China; Second Department of Cardiovascular Diseases, TEDA International Cardiovascular Hospital, Tianjin Medical University, Tianjin 300457, China amtangtang@163.com
Supported by:
the Project of Tianjin Health Bureau, No. 04KY63*

摘要/Abstract

摘要：

背景：干细胞移植为治疗心肌梗死带来新的希望，但研究结果不一致，存在争议。细胞移植能否长期持久地改善心脏功能、改善缺血心功能的机制这些问题均不明确。
目的：观察经冠状动脉自体骨髓单个核细胞移植对急性心肌梗死犬心功能、血管生成和细胞因子分泌的影响。
方法：杂种犬分为骨髓单个核细胞组(n=10)和生理盐水组(n=6)，前上嵴或髂后上棘穿刺分离得到骨髓单个核细胞，结扎冠状动脉前降支建立急性心肌梗死模型，于心肌梗死后2 h分别经冠状动脉内移植骨髓单个核细胞和生理盐水，心肌梗死后2 h及6周时分别测定超声心动图指标，骨髓单个核细胞移植后6周vWF免疫组化染色检测心肌组织的毛细血管密度，RT-PCR检测血管内皮生长因子(血管内皮生长因子188、血管内皮生长因子164)、碱性成纤维细胞生长因子、基质金属蛋白酶9 mRNA的表达。
结果与结论：经冠状动脉自体骨髓单个核细胞移植后6周，超声心动图显示，骨髓单个核细胞组射血分数和每搏输出量比生理盐水组显著升高；梗死边缘区新生血管数量明显高于生理盐水组。骨髓单个核细胞组梗死区血管内皮生长因子188、血管内皮生长因子164和碱性成纤维细胞生长因子mRNA表达水平显著高于生理盐水组。骨髓单个核细胞组梗死区基质金属蛋白酶9 mRNA 表达水平显著低于生理盐水组。结果说明自体骨髓单个核细胞经冠状动脉内注射移植，改善急性心肌梗死后心功能，促进梗死边缘区血管生成，提高促血管生长因子血管内皮生长因子188、血管内皮生长因子164和碱性成纤维细胞生长因子的mRNA表达水平，减少基质金属蛋白酶9 mRNA表达水平。

关键词: 干细胞, 干细胞移植, 骨髓单个核细胞, 经冠状动脉注射, 心功能, 毛细血管密度, 基质金质层白酶, 细胞因子, 省级基金, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Cell transplantation offers a new promise of rebuilding the damaged myocardium. But the results of them are not consistent. It is not clear if the transplanted cells can permanently improve heart function and the mechanism underlying this therapeutic effect.
OBJECTIVE: To study the effect of intracoronary autologous bone marrow mononuclear cell transplantation on cardiac function, and angiogenesis and cytokine production in canines with acute myocardial infarction.
METHODS: Left anterior descending coronary artery ligation was used to produce acute myocardial infarction models in hybrid canines. Bone marrow mononuclear cells were harvested by using puncture of anterior crest and posterior superior iliac spine to prepare cell suspension. Sixteen hybrid canines were randomly divided into transplantation group (n=10) and control group (n=6). Bone marrow mononuclear cells (transplantation group, n=10) or normal saline (control group, n=6) were intracoronarily infused into infarction-related arteries 2 hours after acute myocardial infarction. To evaluate the heart function, we used echocardiography at 2 hours and 6 weeks after acute myocardial infarction. Capillary density was assessed 6 weeks after transplantation by using von Willebrand factor test. The mRNA levels of vascular endothelial growth factor 188, vascular endothelial growth factor 164, basic fibroblast growth factor and matrix metalloproteinase-9 in the infarct area were determined by reverse transcription-PCR at 6 weeks after transplantation.
RESULTS AND CONCLUSION: In contrast to the control group, ejection fraction and stroke volume at 6 weeks after transplantation increased significantly in the transplantation group. The transplantation group had a greater amount of new vessels in the peri-infarct area than the control group. Compared with the control group, the mRNA levels of vascular endothelial growth factor 188, vascular endothelial growth factor 164, and basic fibroblast growth factor significantly increased in the transplantation group, but the mRNA level of matrix metalloproteinase-9 significantly decreased in the transplantation group. These findings suggest that intracoronary transplantation of autologous bone marrow mononuclear cells may improve the cardiac function, and increase capillary density, especially in the border zone of infarcted myocardium. Otherwise, bone marrow mononuclear cell transplantation can increase the mRNA levels of vascular endothelial growth factor 188, vascular endothelial growth factor 164, and basic fibroblast growth factor, but decrease the mRNA level of matrix metalloproteinase-9.

Key words: stem cells, stem cell transplantation, bone marrow mononuclear cell, intracoronary infusion, cardiac function, capillary density, matrix metalloproteinase-9, cytokine, provincial grants-supported paper, stem cell photographs-containing paper

中图分类号:

R394.2

唐洁，陈涛，米杰，徐爱国，王勇德，张健，齐向前 . 骨髓单个核细胞移植后心肌梗死区的血管生成及细胞因子分泌[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(32): 5840-5846.

Tang Jie, Chen Tao, Mi Jie, Xu Ai-guo, Wang Yong-de, Zhang Jian, Qi Xiang-qian. Effect of bone marrow mononuclear cell transplantation on angiogenesis and expression of cytokines following myocardial infarction[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(32): 5840-5846.

图/表（结果） 3

2.1 实验动物数量分析 研究共16只犬进入实验，无脱失，且全部资料完整，全部纳入最后结果分析。各组实验动物间平均体质量的差异无显著性意义(P > 0.05)。
2.2 超声心动图指标的测定 见表1。

生理盐水组心肌梗死后6周和心肌梗死后2 h比较各项指标的差异均无显著性意义(P > 0.05)，骨髓单个核细胞组心肌梗死后6周(移植后6周)左室收缩末容积、左室舒张末容积、左室收缩末内径、射血分数、短轴缩短率、每搏输出量均较心肌梗死后2 h(移植前)有明显改善，差异有显著性意义(P < 0.05)，骨髓单个核细胞组心肌梗死后6周左室收缩末容积、左室舒张末容积、射血分数、每搏输出量与同期生理盐水组相比，亦有明显改善，差异有显著性意义(P < 0.05)。其中骨髓单个核细胞组心肌梗死后6周射血分数较同期生理盐水组提高7%左右。
2.3 血管密度的免疫组织化学染色 免疫组织化学染色情况下，vWF抗原阳性的微血管呈棕黄色。在实验中，vWF作为内皮细胞的标志物用于检测梗死区及其边缘毛细血管的存在和数量。选取外直径< 50 μm、环形的阳性区域，作为判断毛细血管的标准。骨髓单个核细胞移植后6周，骨髓单个核细胞组有明显的血管新生，棕黄色的微血管分布于残存心肌细胞之间，梗死边缘区多于梗死中心区。骨髓单个核细胞组梗死边缘区血管新生数量明显多于生理盐水组(P < 0.01)，而2组的梗死中心区的微血管密度的差异无显著性意义(P > 0.05)，见图1和表2。

2.4 梗死区各细胞因子的mRNA 表达水平 骨髓单个核细胞移植后6周，骨髓单个核细胞组梗死区血管内皮生长因子188、血管内皮生长因子164和碱性成纤维细胞生长因子的mRNA表达水平显著高于生理盐水组(P < 0.05或P < 0.01)。骨髓单个核细胞组梗死区基质金属蛋白酶9的mRNA 表达水平显著低于生理盐水组，差异有显著性意义(P < 0.05)。见图2和表3。

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引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2010年2月至2011年5月于天津医科大学心血管病临床学院泰达国际心血管病医院完成。

材料：

动物：杂种成年犬(15-25 kg)16只，雌雄不限，由天津医科大学心血管病临床学院泰达国际心血管病医院实验动物中心提供。

经冠状动脉骨髓单个核细胞移植及相关检测所有主要试剂和设备：

实验方法：

骨髓单个核细胞的分离^[9]：实验犬分为骨髓单个核细胞组(10只)及生理盐水组(6只)。骨髓单个核细胞组髂实验犬前上嵴或髂后上棘穿刺，分数点共抽取25-30 mL骨髓，用Ficoll淋巴细胞分离液(密度1.077 g/mL)，密度梯度离心法分离获得骨髓单个核细胞，制成含细胞数约为3×10¹⁰-1×10¹¹ L^-¹的细胞悬液1 mL。

建立心肌梗死模型^[10]：实验犬全麻，手术区消毒，于左胸4，5肋间开胸，分离冠状动脉前降支中段，在暴露的冠状动脉前降支第一对角支以下处穿4-0滑线，持续阻断冠状动脉前降支循环2 h。

细胞移植^[10]：结扎冠状动脉前降支2 h后，松开血管恢复再流。骨髓单个核细胞组模拟临床上经导管介入治疗后移植细胞，于冠状动脉结扎线远端注射自体骨髓单个核细胞悬液1 mL(3×10⁷-1×10⁸个)，生理盐水组注射 1 mL生理盐水，最后完全结扎冠状动脉前降支。关胸，送回笼中饲养。

超声心动图检查：由一两名有经验的超声医师于术后2 h和术后6周测量超声心动图指标。取心尖四腔、两腔和心尖左室长轴、短轴切面，连续记录3个完整心动周期的左室图像。测量射血分数、短轴缩短率和每搏输出量，左室舒张末内径、左室收缩末内径、左室舒张末容积、左室收缩末容积，取3个心动周期的平均值作为结果。

vWF免疫组织化学染色：骨髓单个核细胞移植后6周，静脉推注氯化钾法处死实验犬，待心脏停止搏动，迅速取出心脏，以生理盐水冲洗干净，从苍白左室梗死中心区、梗死边缘区及正常区取心肌组织，体积分数4%的甲醛固定，石蜡包埋，制成5 μm厚切片，组织切片行vWF免疫组化染色。免疫组织化学染色的微血管呈棕黄色，400倍光镜下选取3个血管最高的区域进行计数，取平均值为毛细血管密度。光学显微镜下观察并选取典型视野摄片。

RT-PCR检测细胞因子血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、基质金属蛋白酶9 mRNA的表达：取心肌梗死区游离心室壁标本，液氮冻存。取新鲜或-70 ℃组织，抽提总RNA，RT-PCR法检测血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、基质金属蛋白酶9 mRNA的表达。PCR引物由上海英俊生物工程有限公司合成。

引物序列：血管内皮生长因子(Product 405，534，606 bp)： 5’-Primer：5’-TTC TGT ATC AGT CTT TCC TGG TGA G-3’，3’-Primer：5’-CGA AGT GGT GAA GTT CAT GGA TG-3’；碱性成纤维细胞生长因子(Product 161bp)：5’-Primer：5’-GGA GTA TGT GCA ATC GCT AT -3’，3’-Primer：5’-CGT TTC AGT GCC ACA TAC CA -3’；基质金属蛋白酶9(Product 246 bp)：5’-Primer：GGG TAA GGT GCT GCT GTT CAG，3’-Primer：TGC AAA ATG TCA AAG GTC ACG；GAPDH (Product 225 bp)：5’-Primer：5’-GCC AAA AGG GTC ATC ATC TC-3’，3’-Primer：5’-GCC CAT CCA CAG TCT TCT-3’。

反应条件：GAPDH：94 ℃ 解链，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸 30 s，循环28次；血管内皮生长因子：94 ℃解链，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，循环40次，末次延长5 min；碱性成纤维细胞生长因子：94 ℃解链，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，循环30次，末次延长5 min；基质金属蛋白酶9：94 ℃ 解链，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，循环40次，末次延长5 min。取PCR反应产物10 μL，2%琼脂糖凝胶电泳，75 V，40 min，紫外透射仪下观察，采用美国Kodak digital Science ID 数字凝胶成像分析系统将凝胶图像扫描输入计算机，并对电泳条带进行吸光度分析，以GAPDH作为内参照，被测基因mRNA 表达水平=被测基因扩增吸光度值/GAPDH 扩增吸光度值。

主要观察指标：经冠状动脉自体骨髓单个核细胞移植后，心功能、心肌组织的毛细血管密度，与心室重塑有关的细胞因子血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子以及基质金属蛋白酶9的mRNA的表达水平。

统计学分析：数据以x(_)±s表示。所有分析均在SPSS 13.0统计软件包完成，对数据采用成组t 检验。统计结果以P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

骨髓单个核细胞属于骨髓干细胞的一种，是一个细胞群体的总称，含有多种具有多分化潜能的细胞，是常用的移植细胞。骨髓单个核细胞具有提取方便、细胞数量充足、移植后细胞成活率高、没有免疫排斥反应、多向分化潜能、合乎伦理学等诸多优点，具有其他干细胞不可比拟的优势^[11-13]。将骨髓单个核细胞作为移植细胞不仅能提供具有多分化潜能的细胞，而且提供多细胞间相互依赖分化生存的诱导微环境^[14]。

目前临床最常用的移植方式是经冠状动脉内移植，因为这种移植方式较为直接，同时创伤较小；又有新型的介入设备问世，使操作更简便。经冠状动脉移植干细胞是在经皮冠状动脉介入治疗的同时，经导管将干细胞移植入梗死相关血管的远端，注射的干细胞在局部微环境的作用下经毛细血管迁移到缺血损伤的心肌中发挥作用^[15]。实验选择经冠状动脉移植干细胞，可基本模拟急性心肌梗死的临床治疗过程。但是，应当在什么时候进行骨髓干细胞移植才能使机体获益最大?这个问题一直是细胞移植领域备受关注的课题。研究表明，心肌梗死后第1天，炎症反应最强，即刻细胞移植可能起负性效应；而梗死后2周获益最大，可能与将细胞移植时间点选择在炎症反应消退、瘢痕形成前有关^[16]；但也有研究表明，心肌梗死超急性期进行细胞移植，移植的干细胞可能通过释放一些细胞因子更有益于衰竭心脏功能恢复^[17-19]。实验选择在结扎冠状动脉后超急性期进行细胞移植，避免了移植细胞时二次开胸，从而保证了实验动物的存活率，更符合临床使用的实际。心肌梗死后一两周为急性炎症期，2-4周为左室重构期，6周左右左室重构已基本完成，心功能基本趋于稳定，故实验对心功能改善的评价时间选择在移植后6周。

研究结果显示，心肌梗死后6周，超声心动图结果显示，骨髓单个核细胞组左室收缩末容积、左室舒张末容积、射血分数、每搏输出量均较移植前有明显改善，与同期生理盐水组相比也均有明显改善。其中骨髓单个核细胞组移植后6周射血分数较同期生理盐水组提高7%左右。提示经冠状动脉骨髓单个核细胞移植可提高心肌梗死后心脏收缩功能。既往研究结果显示，骨髓干细胞移植改善心功能的主要机制可能是骨髓干细胞移植到宿主内，可分化为心肌细胞，从而减少了梗死区有功能心肌细胞的下降程度。然而，干细胞是否具有横向分化能力目前是基础和临床研究领域中最大的争议问题。有人认为非选择性冠状动脉内注射骨髓单个核细胞不能分化为心肌细胞、内皮细胞和血管平滑肌细胞，仅能分化为瘢痕区的成纤维细胞^[20]，目前认为，干细胞的分化与心肌内微环境、细胞因子及信号转导通路等多种因素密切相关。

血管新生是指从原有毛细血管发芽长出新的毛细血管和小的非肌性血管的过程。血管新生是组织修复的重要特征。梗死区的血管新生通常始于心肌梗死后第3天，在随后的2周更为显著^[21]。心肌梗死后心肌缺血，依靠自身生理性血管再生形成侧支循环缓解心肌局部的缺血、缺氧，但血管新生并不能充分满足冠状动脉阻塞造成的血流损失^[22]。直接诱导血管再生是治疗缺血性心脏病的新手段^[23-24]。研究表明，骨髓单个核细胞中的血管内皮祖细胞通过迁移、增殖、分化直接参与了出生后的血管再生，而其中的骨髓间充质细胞增强了前者的血管再生作用，其可能机制是这些细胞分泌了多种血管生长因子参与了出生后的血管再生^[25-28]。实验应用免疫组化法，检测了vWF因子阳性内皮细胞，研究结果显示，细胞移植后6周，骨髓单个核细胞组有明显的血管新生，骨髓单个核细胞组梗死边缘区新生血管数量明显高于生理盐水组，而2组的梗死中心区的新生血管数量无明显差异，说明骨髓单个核细胞移植能诱导形成新生血管，促进缺血心肌的血管新生。

在血管生成的调节因子中，目前对于促进血管生成因子(血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子)的研究较为充分。血管内皮生长因子是促进血管生长的主要因子之一，它不仅在生理状态下促进新生血管形成，而且在病理状态下的新生血管形成中亦起作用一。正常心脏中血管内皮生长因子的表达很少，而在缺血心肌细胞中血管内皮生长因子的表达则明显增加，不过这种内源性血管内皮生长因子的升高为时短暂，不足以建立充分的侧支循环。碱性成纤维细胞生长因子对血管内皮细胞和平滑肌细胞均具有强烈促增殖作用，碱性成纤维细胞生长因子还通过旁分泌、自分泌机制诱导血管内皮祖细胞表达血管内皮生长因子，介导血管新生^[29]。实验检测了细胞移植后6周梗死区血管内皮生长因子164、血管内皮生长因子188和碱性成纤维细胞生长因子的mRNA表达水平，结果显示，血管内皮生长因子164、血管内皮生长因子188、碱性成纤维细胞生长因子的mRNA表达水平骨髓单个核细胞组较生理盐水组显著升高。由此作者推测，骨髓单个核细胞移植后，可能通过分泌多种促血管生成因子，诱导新生血管形成。这种细胞因子的分泌可能与细胞移植改善梗死后心功能有关。

基质金属蛋白酶是细胞外基质降解所必需的锌离子依赖性的内源性蛋白酶家族，是细胞外基质的主要生理性调节物质，在基质成分合成和降解的过程中起着重要的作用。近年的研究表明：基质金属蛋白酶9能持续降解间质的纤维类胶原，在细胞外基质重塑中具有重要作用，参与多种生理及病理损伤过程。己有研究发现，敲除小鼠基质金属蛋白酶9基因能缓解心肌梗死后左室重构^[30]，在心肌梗死大鼠模型、自发性高血压心力衰竭动物模型中，应用基质金属蛋白酶抑制剂能缓解左室扩张和重构^[31-33]，表明基质金属蛋白酶9具有降解变性胶原的作用，参与心室重构过程。实验检测了细胞移植后6周梗死区基质金属蛋白酶9的mRNA表达水平，结果显示，基质金属蛋白酶9的mRNA表达水平骨髓单个核细胞组较生理盐水组显著降低，提示骨髓单个核细胞移植可能通过抑制心肌细胞基质金属蛋白酶9的表达缓解心肌梗死后心室重构，从而改善梗死后心功能。

综上所述，自体骨髓单个核细胞经冠状动脉内注射移植后，改善急性心肌梗死后心功能，促进梗死边缘区血管生成，提高促血管生长因子血管内皮生长因子188、血管内皮生长因子164和碱性成纤维细胞生长因子的mRNA表达水平，减少基质金属蛋白酶9 mRNA表达水平。作者推测骨髓单个核细胞移植通过以下机制改善心功能。①促进梗死后血管生成：骨髓单个核细胞包括血管内皮祖细胞，故其提供了大量有活性的血管内皮祖细胞在梗死区动员、增殖、分化和重塑形成新的血管。②旁分泌效应：可通过分泌血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子等多种生长因子，提供促进血管新生的诱导因素，刺激梗死边缘区血管形成。③移植的骨髓单个核细胞可削弱梗死区基质金属蛋白酶9对细胞外基质成员的降解活性，抑制左室重构。

骨髓单个核细胞移植后心肌梗死区的血管生成及细胞因子分泌

Effect of bone marrow mononuclear cell transplantation on angiogenesis and expression of cytokines following myocardial infarction

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