低频电磁场在基因修饰表皮干细胞移植修复创面中的作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.32.013

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (32): 5827-5833.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.32.013

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低频电磁场在基因修饰表皮干细胞移植修复创面中的作用

梁玲¹，李新平²，白文芳²，白利明²，朱洪翔²，许伟成²，冯玉³，王鑫¹，陈艺3，张鸣生^1，2

1暨南大学第一临床学院，广东省广州市 510630
2广东省人民医院康复医学科，广东省老年医学研究所，广东省广州市 510080
3南方医科大学，广东省广州市 510515

收稿日期:2013-04-26 修回日期:2013-05-10 出版日期:2013-08-06 发布日期:2013-08-06
通讯作者: 张鸣生，博士，主任医师，教授，博士生导师，广东省人民医院，广东省广州市 510080 mszrch@163.com
作者简介:梁玲★，女，1986年生，湖南省邵阳市人，汉族，暨南大学第一临床学院在读硕士，主要研究方向：表皮干细胞和创面愈合。 Liangling1986@hotmail.com
基金资助:
广东省自然科学基金(S2012010009498)；广东省自然科学基金(S2012010009308)。

Effects of low-frequency electromagnetic fields on skin wound healing after the transplantation of gene modified epidermal stem cells

Liang Ling¹, Li Xin-ping², Bai Wen-fang², Bai Li-ming², Zhu Hong-xiang², Xu Wei-cheng², Feng Yu³, Wang Xin¹, Chen Yi³, Zhang Ming-sheng^{1, 2}

1The First Clinical College, Jinan University, Guangzhou 510630, Guangdong Province, China
2Guangdong Geriatric Institute, Guangdong Academy of Medical Sciences, Guangdong General Hospital, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China
3Southern Medical University , Guangzhou 510515, Guangdong Province, China

Received:2013-04-26 Revised:2013-05-10 Online:2013-08-06 Published:2013-08-06
Contact: Zhang Ming-sheng, M.D., Chief physician, Professor, Doctoral supervisor, the First Clinical College, Jinan University, Guangzhou 510630, Guangdong Province, China; Guangdong Geriatric Institute, Guangdong Academy of Medical Sciences, Guangdong General Hospital, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China mszrch@163.com
About author:Liang Ling★, Studying for master’s degree, the First Clinical College of Jinan University, Guangzhou 510630, Guangdong Province, China Liangling1986@hotmail.com
Supported by:
the Natural Science Foundation of Guangdong Province, No. S2012010009498*, S2012010009308*

摘要/Abstract

摘要：

背景：烧伤、慢性创面等大面积皮肤缺损的创面修复是临床上亟待解决的难题。表皮干细胞和角质化细胞生长因子可为创面的治疗提供新的策略。低频电磁场作为一种非侵入性物理刺激在创面修复中已被认为较佳的方法。
目的：探讨低频电磁场在角质化细胞生长因子基因修饰的表皮干细胞移植促进小鼠皮肤全层缺损创面修复中的作用。
方法：体外分离培养SD乳鼠表皮干细胞，用5-溴脱氧尿核苷进行标记，成功转染角质化细胞生长因子基因腺病毒表达载体后，移植于昆明小鼠全层缺损创面。建立全层缺损创面小鼠模型，分别进行表皮干细胞移植，角质化细胞生长因子修饰的表皮干细胞移植，角质化细胞生长因子修饰的表皮干细胞移植外加低频电磁场干预。
结果与结论：移植后第9，16天，低频电磁场干预的角质化细胞生长因子基因修饰的表皮干细胞移植组创面收缩率优于其他各组(P < 0.05)。移植后第9天，免疫荧光染色法检测显示，各组组创面中均有5-溴脱氧尿核苷阳性细胞分布。移植后第16天，Western blot检测显示，低频电磁场干预的角质化细胞生长因子基因修饰的表皮干细胞移植组和角质化细胞生长因子基因修饰的表皮干细胞移植组创面组织中角质化细胞生长因子蛋白表达高于表皮干细胞移植组(P < 0.05)；移植后第16，30天，苏木精-伊红染色结果显示，低频电磁场干预的角质化细胞生长因子基因修饰的表皮干细胞移植组的创面组织上皮化现象较明显。结果证实，低频电磁场有促进角质化细胞生长因子基因修饰的表皮干细胞移植修复小鼠皮肤全层缺损创面的作用。

关键词: 干细胞, 干细胞移植, 低频电磁场, 表皮干细胞, 角质细胞生长因子, 皮肤全层缺损创面, 创面愈合, 省级基金, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: The repair and management of full-thickness skin defects resulting from burns and chronic wounds remain a significant unmet clinical challenge. Using epidermal stem cells and keratinocyte growth factor for full-thickness wound repair is a promising approach. Low-frequency electromagnetic fields which are a non-invasive physical stimulation therapy have been recognized as a good method to enhance wound healing.
OBJECTIVE: To develop a new strategy to accelerate wound healing by transplanting transfected epidermal stem cells and keratinocyte growth factor and treating with low-frequency electromagnetic fields in a mouse model.
METHODS: Epidermal stem cells from Sprague-Dawley neonatal rats were isolated and cultured in vitro, then the cells were labeled with 5-bromo-2-deoxyuridine and transfected by Ad-KGF, a recombinant adenovirus carrying the keratinocyte growth factor. Mice were given to create full thickness skin wound on the dorsum and randomly assigned to four groups: control group, transplantation of epidermal stem cells group, transplantation of keratinocyte growth factor gene modified epidermal stem cells group, and transplantation of keratinocyte growth factor gene modified epidermal stem cells plus low-frequency electromagnetic field exposure group.
RESULTS AND CONCLUSION: The best healing pattern was observed in the keratinocyte growth factor gene modified epidermal stem cells plus low-frequency electromagnetic field exposure group (P < 0.05) at days 9 and 16. 5-Bromo-2-deoxyuridine labeled cells existed in the wound in the treated groups at day 9. A significantly increased expression of endogenous keratinocyte growth factor was detected in the transplantation of Keratinocyte Growth Factor gene modified epidermal stem cells group, and transplantation of keratinocyte growth factor gene modified epidermal stem cells plus low-frequency electromagnetic field exposure group at day 16. A well-advanced epithelialization was observed in transplantation of keratinocyte growth factor gene modified epidermal stem cells plus low-frequency electromagnetic field exposure group at days 16 and 30. These results suggest that low-frequency electromagnetic fields enhanced wound healing following the transplantation of keratinocyte growth factor gene modified epidermal stem cells.

Key words: stem cells, stem cell transplantation, low-frequency electromagnetic field, epidermal stem cells, keratinocyte growth factor, full-thickness skin wound, wound healing, provincial grants-supported paper, stem cell photographs- containing paper

中图分类号:

R394.2

梁玲，李新平，白文芳，白利明，朱洪翔，许伟成，冯玉，王鑫，陈艺，张鸣生. 低频电磁场在基因修饰表皮干细胞移植修复创面中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(32): 5827-5833.

Liang Ling, Li Xin-ping, Bai Wen-fang, Bai Li-ming, Zhu Hong-xiang, Xu Wei-cheng, Feng Yu, Wang Xin, Chen Yi, Zhang Ming-sheng. Effects of low-frequency electromagnetic fields on skin wound healing after the transplantation of gene modified epidermal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(32): 5827-5833.

图/表（结果） 5

2.1 实验动物数量分析 纳入小鼠60只，最终计入结果分析的数量60只，无脱落。
2.2 角质化细胞生长因子基因修饰表皮干细胞鉴定结果 实验成功获得表达表皮干细胞标志物β1整合素的细胞，见图1。Ad-角质化细胞生长因子转染表皮干细胞 24 h后细胞形态未变，95%以上的细胞都有荧光表达，见图2。

2.3 小鼠创面组织中5-溴脱氧尿核苷阳性细胞的表达 移植后第9天，组织切片中各实验组均可在创面中观察到5-溴脱氧尿核苷阳性细胞，低频电磁场干预的角质化细胞生长因子基因修饰的表皮干细胞移植组和角质化细胞生长因子基因修饰的表皮干细胞移植组可见阳性细胞较多，且低频电磁场干预的角质化细胞生长因子基因修饰的表皮干细胞移植组5-溴脱氧尿核苷阳性细胞分布广泛，见图3。

2.4 小鼠创面愈合情况 对照组于移植后第5天开始创面缩小，第9天收缩明显，第18天大致收缩愈合，未见明显新生上皮，移植后第30天周边毛发覆盖。低频电磁场干预的角质化细胞生长因子基因修饰的表皮干细胞移植组移植后第3天后动物创面面积开始缩小，表面颜色红润，移植后第5天时创面形成较硬的痂皮，突出正常皮面，第9天时创缘新生表皮生成，第16天时部分创面完全愈合，部分新生皮肤呈暗红色韧性增加，第30天时大部分创面毛发覆盖。表皮干细胞移植组、角质化细胞生长因子基因修饰的表皮干细胞移植组和低频电磁场干预的角质化细胞生长因子基因修饰的表皮干细胞移植组第9和16天创面收缩率优于对照组(P < 0.05)，并且低频电磁场干预的角质化细胞生长因子基因修饰的表皮干细胞移植组效果更明显(P < 0.05)。见表1。

2.5 小鼠创面组织中角质化细胞生长因子蛋白的表达见图4。

Western blot分析显示，移植后第16天，角质化细胞生长因子基因修饰的表皮干细胞移植组和低频电磁场干预的角质化细胞生长因子基因修饰的表皮干细胞移植组创面中的角质化细胞生长因子表达较高(P < 0.05)。

2.6 移植后小鼠创面组织上皮化情况 见图5。

移植后第16天，对照组上皮与真皮连接稀疏，上皮细胞层次欠佳，含5-11层细胞，厚薄不均。其他各组上皮与真皮连接紧密，上皮细胞排列层次清楚，其中表皮干细胞移植组和角质化细胞生长因子基因修饰的表皮干细胞移植组上皮厚度一致，低频电磁场干预的角质化细胞生长因子基因修饰的表皮干细胞移植组上皮厚度均匀，上皮与真皮连接处有少量波浪形钉突形成，而移植后第30天时对照组上皮含五六层细胞，各层次仍不明显；表皮干细胞移植组基底层可见少量波浪形钉突；角质化细胞生长因子基因修饰的表皮干细胞移植组上皮层厚薄不均，向真皮延伸；低频电磁场干预的角质化细胞生长因子基因修饰的表皮干细胞移植组新生上皮趋向于正常皮肤。

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引言

创伤、烧伤、慢性溃疡等大面积皮肤缺损的创面修复是较棘手的临床难题^[1-2]。随着社会老龄化的出现以及糖尿病等因素的增多，难愈性伤口的发生率将越来越高，其愈合过程也将越来越成为社会关注的内容。如何快速使创面愈合、减少并发症的发生、是否能达到功能修复是皮肤修复治疗亟待解决的难题。目前临床上治疗创面的方法有很多^[3-4]，其中自体皮肤移植是常用的治疗方法，但是存在自体皮缘的不足以及取皮后遗留创面修复等问题困扰。

针对表皮干细胞的研究是当今研究的一大热点，其在皮肤创面修复、组织工程皮肤的构建、基因治疗等方面的作用研究均已取得了显著进展，具有广阔的应用前景^[5]，但仍存在很多问题有待于进一步解决。如何促进表皮干细胞在创面增殖分化，如何增加体外培养的表皮干细胞在移植修复创面的成活率等，是利用表皮干细胞修复难愈性创面所面临的难题^[6-7]。

低频电磁场在临床中运用越来越广泛，它在促进创面愈合、骨折愈合以及其他方面的作用越来越受到重视。在创面治疗过程中，低频电磁场可以通过减轻炎症反应、促进细胞分泌生长因子、促进细胞增殖以及细胞外基质合成而促进创面愈合^[8]。课题组前期实验还通过制作裸鼠全层皮肤缺损模型，经低频电磁场干预后，光镜和电镜下观察到各实验组再生皮肤具备完整的表皮层和真皮层、细胞层次增多、表皮层明显增厚、附件丰富、表皮细胞间有桥粒、半桥粒、粗张力微丝。以上数据说明，低频电磁场在创面愈合过程中的使用有着广泛的应用前景。

在创面愈合过程中，上皮细胞-间质细胞相互作用起着相当重要的作用，而两者相互作用的桥梁主要包括各种生长因子和细胞因子等在内的多种因素参与^[9]。在间质细胞-上皮细胞之间的相互联系过程中，最先产生的生长因子之一是角质化细胞生长因子，角质化细胞生长因子可促进表皮干细胞的增殖。Lombaert等^[10]对来源于唾液腺中的干细胞研究中发现，角质化细胞生长因子可以促进上皮干细胞的增殖，且可以对抗损伤因子而起到保护干细胞的作用。虽然低频电磁场和角质化细胞生长因子都在促进创面修复过程中发挥着重要的作用，能显著促进创面的愈合和促进表皮干细胞增殖。然而，在创面愈合过程中低频电磁场是否能够促进角质化细胞生长因子修饰表皮干细胞移植的对创面愈合，目前国内外未见相关报道。

实验通过建立全层缺损创面模型，采用角质化细胞生长因子基因修饰的表皮干细胞移植治疗全损皮肤创面，并添加低频电磁场干预，观察低频电磁场在角质化细胞生长因子基因修饰的表皮干细胞移植修复创面过程中的作用。

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：于2011年9月至2012年12月在广东省人民医院医学研究中心完成。

材料：

实验动物：健康三四周龄SPF级雄性昆明小鼠60只，体质量(25±5) g；健康鼠龄1-3 d的SPF级SD乳鼠25只，雌雄不分，均由中山大学动物实验中心提供，许可证号：SCXK(粤)2011-0029。

实验对动物的处理方法符合中华人民共和国科学技术部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见》^[11]。

表皮干细胞移植修复创面相关的主要试剂及仪器：

实验方法：

角质化细胞生长因子基因修饰表皮干细胞：选用新生1-3 d的SD乳鼠，无菌条件下取下背部皮肤，中性蛋白酶Ⅱ和胰酶两步消化法进行分离，Ⅳ型胶原快速贴壁获得表皮干细胞^[12]，加入角质细胞无血清培养基培养基后在37 ℃、CO₂培养箱中培养，免疫荧光染色检测表皮干细胞标志物β1整合素在表皮干细胞中的表达。取第2代表皮干细胞，细胞浓度达到90%丰度以上时，加入终浓度为10 μmol/L 5-溴脱氧尿核苷，同时加入4 μL的课题组前期构建成功的角质化细胞生长因子腺病毒表达载体Ad-角质化细胞生长因子液^[13]，体外培养24 h后，体积分数0.25%胰酶室温下消化，1 000 r/min离心5 min收集细胞用于动物实验。

全层缺损创面小鼠模型的建立：昆明小鼠60只用氯胺酮(5 mg/kg)和安定(2 mg/kg)腹膜内注射麻醉，背部剃毛，近尾部正中全层切除皮肤及肌筋膜，制作1 cm× 1 cm的全层缺损创面，然后固定边缘皮肤。所有小鼠均于制作创面的同时将相应的细胞涂抹于创面，每只小鼠细胞数约6×10⁸个^[14]；所有小鼠均以胶原海绵(广州创尔公司提供)和凡士林纱布覆盖创面。各小鼠单笼饲养，维持环境温度22 ℃，保持12 h白光/12 h黑夜光照循环，水和食物供给充足。

分组和干预：在小鼠背部制作全层缺损创面模型后，将60只小鼠随机分成对照组、表皮干细胞移植组、角质化细胞生长因子基因修饰的表皮干细胞移植组和低频电磁场干预的角质化细胞生长因子基因修饰的表皮干细胞移植组，每组15只。

对照组不给于任何干预，表皮干细胞移植组进行表皮干细胞移植，角质化细胞生长因子基因修饰的表皮干细胞移植组进行角质化细胞生长因子修饰的表皮干细胞移植，低频电磁场干预的角质化细胞生长因子基因修饰的表皮干细胞移植组在角质化细胞生长因子修饰的表皮干细胞移植1 d后，用低频电磁场(50 Hz，5 mT)连续干预，1 h/d。

创面观察：密切观察创面的情况，并于移植后第9，16天时以标尺为坐标标志物，用无菌透明膜描印创面轮廓大小，按照公式计算创面收缩率，记录各组愈合时间。创面闭合时间以完全新生皮肤覆盖为准。创面收缩率(%)=[(A1-A2)/A1]×100%，其中A1代表原创面面积，A2代表不同时间观察创面面积^[15]。

小鼠创面组织标本的收集和处理：各组分别于第9，16，30天将5只动物处死，取含创缘1.0-2.0 mm的创面，一半用40 g/L多聚甲醛固定进行石蜡切片，另一半置于液氮中并转移至-70 ℃冰箱进行冰冻切片和总蛋白的提取。

用于石蜡切片的标本在40 g/L多聚甲醛固定24 h后流水冲洗1 h，转移到脱水系统处理，石蜡包埋机包埋后于石蜡切片机连续切片，切片厚度为3 μm，37 ℃水浴箱中展片及捞片，60 ℃干燥箱中干燥后，进行二甲苯透明和乙醇梯度脱水，水洗后置于4 ℃冰箱中保存备用。

免疫荧光染色检测小鼠创面组织5-溴脱氧尿核苷的表达：取移植后第9天冰冻组织制作连续冰冻切片，厚度为5 μm，按顺序加兔抗大鼠5-溴脱氧尿核苷单克隆抗体(1∶1 000)和羊抗兔FITC标记的二抗(1∶1 000)，以非特异性血清代替一抗做阴性对照，并使用DAPI染核，室温下孵育1 h，PBS洗片，封固，激光共聚焦显微镜下观察。

Western blot检测小鼠创面组织角质化细胞生长因子蛋白的表达：分别提取各组移植后第16天的组织蛋白，BCA法进行蛋白定量后，加入5×SDS凝胶加样缓冲液，沸水浴5 min，按照蛋白定量结果进行加样，行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，采用半干法将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，然后用硝酸纤维素膜用脱脂奶封闭1 h，加入角质化细胞生长因子羊抗人一抗(1∶600)或β-actin羊抗大鼠一抗(1∶1 000)工作液，4 ℃过夜，兔抗羊二抗(1∶2 000)于室温下孵育1 h，用ECL发光，X射线胶片显色，以β-actin作为内参照，用凝胶成像系统进行蛋白吸光度值分析。

苏木精-伊红染色检测小鼠创面组织上皮化情况：将移植后第16，30天已入蒸馏水后的切片放入苏木精水溶液中染色数分钟，体积分数1%盐酸乙醇分化液中分色数秒，流水冲洗后入蒸馏水30 min，伊红染色20 s，体积分数75%和100%乙醇中迅速脱水，二甲苯透明，中性树脂封固。光镜下观察组织愈合中上皮化情况。

主要观察指标：小鼠创面收缩率，创面组织5-溴脱氧尿核苷，角质化细胞生长因子蛋白表达及上皮化情况。

统计学分析：计量资料以x(_)±s表示，应用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，组间均数差异的比较采用单因素方差分析和LSD法，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

全层缺损创面可以模拟临床上常见的大面积皮肤缺损，因此，探索促进缺损创面愈合的治疗措施，对临床上治疗创伤、烧伤、慢性溃疡等大面积皮肤缺损有较好的指导意义。在全层缺损创面中毛囊等附属器成分及基底层都被破坏，仅靠创面周缘细胞迁移和肉芽组织形成来填充创面，则速度进行缓慢，甚至难以愈合，在治疗的过程中要充分考虑各方面因素的影响。

创面修复是个复杂而又连续的过程，其中生长因子和各类型细胞在其过程中发挥着非常重要的作用。干细胞疗法和基因疗法用于治疗创面是目前研究的热点，许多研究借助于载体表达目的基因如血小板来源性生长因子、血管内皮生长因子、表皮生长因子等用于创面修复得到令人高兴的结果^[16-18]；近年来亦有多项研究认为干细胞移植如胚胎干细胞、间充质干细胞、脂肪干细胞可促进创面的愈合^[19]。基于干细胞的自我更新和多向分化能力，人们愈加期待以干细胞为种子细胞经基因修饰后移植用于研究修复皮肤创面的作用效果。实验将表皮干细胞作为种子细胞和基因载体，转染角质化细胞生长因子基因，移植治疗创面。这次实验发现，在创面愈合过程中，角质化细胞生长因子基因修饰的表皮干细胞移植后，5-溴脱氧尿核苷阳性细胞较对照组多，提示角质化细胞生长因子基因修饰可能在细胞移植后有保护细胞作用，角质化细胞生长因子可提高移植细胞对周围环境的耐受程度；而Ray等^[20]发现角质化细胞生长因子可以通过激活Akt通道对抗损伤因子而起到保护干细胞的作用，这与本次实验的研究结果相一致。创面愈合是上皮-间质相互作用的结果，其中众多生长因子包括角质化细胞生长因子是二者相互作用的桥梁；有研究表明角质化细胞生长因子可通过旁分泌途径作用于上皮细胞，促进上皮细胞的增殖和迁移从而在创面愈合发挥着重要作用^[21]；Clifford等^[22]发现角质化细胞生长因子能上调胰岛素样生长因子1、血管生长因子和成纤维生长因子从而促进细胞的增殖、迁移、胶原的合成和血管的形成，还能下调β转化生长因子抑制炎症的发生，最终促进创面的愈合。

这次实验结果亦表明，与单独表干细胞移植比较，角质化细胞生长因子基因修饰的表皮干细胞移植可以促进创面的修复，其上皮化程度较明显。角质化细胞生长因子基因修饰的表皮干细胞移植治疗创面是基于前期实验的一个新的探索，也获得了较好的治疗效果，为低频电磁场干预角质化细胞生长因子基因修饰的表皮干细胞移植治疗创面奠定了基础。

电磁场的应用在临床上有着悠久历史，大量研究表明电磁场能促进皮肤创面愈合^[22]。Mattsson等^[23]通过研究表明，电磁场作用于细胞膜内或膜外的受体，激活相关的分子信号通道，调节细胞氧化还原能力，通过自由基的释放作用于下游的细胞增殖、分化、生长因子分泌和抗炎等信号通道，从而促进创面的愈合。虽然低频电磁场和角质化细胞生长因子都在促进创面修复过程中发挥着重要的作用，能显著促进创面的愈合和促进表皮干细胞增殖^[24-25]。然而，在创面愈合过程中，低频电磁场是否能够增强角质化细胞生长因子基因修饰的表皮干细胞移植在修复小鼠全层缺损创面中的作用？

实验结果显示低频电磁场干预的角质化细胞生长因子基因修饰的表皮干细胞移植组的创面愈合率及上皮化程度效果均优于其他组。Ongaro等^[26]利用低频电磁场联合胰岛素样生长因子1作用于关节软骨观察蛋白多糖的合成，结果显示低频电磁场可增强胰岛素样生长因子1对关节软骨合成蛋白多糖的作用；Hopper等^[27]在研究血管内皮生长因子促进血管生成的实验中证实，低频电磁场可以明显提高血管内皮生长因子A促血管形成能力。以上数据表明，低频电磁场可增强多种生长因子的生物学效应，在促进创面愈合过程中有着广泛的应用前景。

组织工程皮肤研究是目前创面愈合治疗领域的焦点之一^[28-29]，但是它存在很多不足之处^[30]：①种子细胞移植到生物材料上后，存活率和分化能力低。②组织工程皮肤移植到创面后，接受率低，不具备完整的皮肤功能。③程序复杂，价格昂贵，不利于临床推广使用。

实验在治疗创面模型过程中，在一定程度上克服了组织工程皮肤存在的一些不足之处：①采用直接涂抹和胶原海绵覆盖法移植种子细胞，直接涂抹可以保持种子细胞的增殖能力和分化能力，胶原海绵覆盖可以为种子细胞的存活提供一个湿润的环境。②种子细胞携带角质化细胞生长因子基因，不仅可以保持移植细胞的活力，提高移植细胞对周围环境的耐受程度，还可以促进创面愈合。③低频电磁场可以增强角质化细胞生长因子修饰表皮干细胞修复创面的效果，促进上皮化，更有利于皮肤的重塑。④成本低，价格合适，便于普及。因此，实验为创面治疗提供了一个新的治疗策略，既是对前期实验一个新的探索，也对组织工程皮肤改良一个新的提示。

综上所述，文章有2个创新性点：第一，与单独表干细胞移植比较，角质化细胞生长因子基因修饰的表皮干细胞移植可以促进创面的修复，其上皮化程度较明显；第二，将角质化细胞生长因子基因修饰的表皮干细胞移植于全层缺损创面经低频电磁场干预可以有效促进创面愈合，效果明显优于其他各组，但其中的具体作用机制还有待进一步研究探讨。

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创伤、烧伤、慢性溃疡等大面积皮肤缺损的创面修复是较棘手的临床难题。随着社会老龄化的出现以及糖尿病等因素的增多，难愈性伤口的发生率将越来越高，其愈合过程也将越来越成为社会关注的内容。如何快速使创面愈合、减少并发症的发生、是否能达到功能修复是皮肤修复治疗亟待解决的难题。目前临床上治疗创面的方法有很多，其中自体皮肤移植是常用的治疗方法，但是存在自体皮缘的不足以及取皮后遗留创面修复等问题困扰。

针对表皮干细胞的研究是当今研究的一大热点，其在皮肤创面修复、组织工程皮肤的构建、基因治疗等方面的作用研究均已取得了显著进展，具有广阔的应用前景，但仍存在很多问题有待于进一步解决。如何促进表皮干细胞在创面增殖分化，如何增加体外培养的表皮干细胞在移植修复创面的成活率等，是利用表皮干细胞修复难愈性创面所面临的难题。

低频电磁场在临床中运用越来越广泛，它在促进创面愈合、骨折愈合以及其他方面的作用越来越受到重视。在创面治疗过程中，低频电磁场可以通过减轻炎症反应、促进细胞分泌生长因子、促进细胞增殖以及细胞外基质合成而促进创面愈合。本课题组前期实验还通过制作裸鼠全层皮肤缺损模型，经低频电磁场干预后，光镜和电镜下观察到各实验组再生皮肤具备完整的表皮层和真皮层、细胞层次增多、表皮层明显增厚、附件丰富、表皮细胞间有桥粒、半桥粒、粗张力微丝。以上数据说明，低频电磁场在创面愈合过程中的使用有着广泛的应用前景。

在创面愈合过程中，上皮细胞-间质细胞相互作用起着相当重要的作用，而两者相互作用的桥梁主要包括各种生长因子和细胞因子等在内的多种因素参与。在间质细胞-上皮细胞之间的相互联系过程中，最先产生的生长因子之一是角质化细胞生长因子，角质化细胞生长因子可促进表皮干细胞的增殖。Lombaert等对来源于唾液腺中的干细胞研究中发现，角质化细胞生长因子可以促进上皮干细胞的增殖，且可以对抗损伤因子而起到保护干细胞的作用。虽然低频电磁场和角质化细胞生长因子都在促进创面修复过程中发挥着重要的作用，能显著促进创面的愈合和促进表皮干细胞增殖。然而，在创面愈合过程中低频电磁场是否能够促进角质化细胞生长因子修饰表皮干细胞移植的对创面愈合，目前国内外未见相关报道。

低频电磁场在基因修饰表皮干细胞移植修复创面中的作用

Effects of low-frequency electromagnetic fields on skin wound healing after the transplantation of gene modified epidermal stem cells

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