小型猪牙周膜干细胞在羟基磷灰石支架材料上的生长

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.29.005

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (29): 5290-5295.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.29.005

• 组织工程口腔材料 tissue-engineered oral materials • 上一篇下一篇

小型猪牙周膜干细胞在羟基磷灰石支架材料上的生长

马路平¹，钟良军²，张源明³，张远⁴，张鹏涛⁴

新疆医科大学第一附属医院，¹口腔科，³心脏中心，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054；²杭州师范大学临床医学院口腔医学系，浙江省杭州市 310015；⁴杭州师范大学附属医院口腔科，浙江省杭州市 310015

收稿日期:2013-04-16 修回日期:2013-06-07 出版日期:2013-07-22 发布日期:2013-07-22
通讯作者: 张源明，教授，博士生导师，新疆医科大学第一附属医院心脏中心，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054 zymdxx@163.com
作者简介:马路平★，女，1982年生，汉族，湖南省人，新疆医科大学第一附属医院在读硕士，主要从事牙周病的防治工作。 yayamlp@qq.com
基金资助:
自治区科技支疆项目(201091144)

Periodontal ligament cells from miniature swine grow on a hydroxyapatite scaffold

Ma Lu-ping¹, Zhong Liang-jun², Zhang Yuan-ming³, Zhang Yuan⁴, Zhang Peng-tao⁴

¹Department of Stomatology, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; ²Department of Stomatology, Clinical College of Hangzhou Normal University, Hangzhou 310015, Zhejiang Province, China; ³Department of Cardiology, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; ⁴Department of Stomatology, Affiliated Hospital of Hangzhou Normal University, Hangzhou 310015, Zhejiang Province, China

Received:2013-04-16 Revised:2013-06-07 Online:2013-07-22 Published:2013-07-22
Contact: Zhang Yuan-ming, Professor, Doctoral supervisor, Department of Cardiology, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China zymdxx@163.com
About author:Ma Lu-ping★, Studying for master’s degree, Department of Stomatology, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China yayamlp@qq.com
Supported by:
Project of Science and Technology Supporting to Xinjiang Uygur Autonomous Region, No. 201091144*

摘要/Abstract

摘要：

背景：牙周组织工程技术为修复牙周炎骨组织缺损提供新思路和新方法。
目的：体外培养小型猪牙周膜干细胞，并与羟基磷灰石进行骨组织构建，研究其与羟基磷灰石支架材料的生物相容性。
方法：采用组织块法获得小型猪牙周膜干细胞，用免疫荧光法检测细胞中基质细胞抗原1的表达。取第3代小型猪牙周膜干细胞接种在羟基磷灰石支架材料上复合培养，分别在培养第1，3，7天用扫描电镜观察细胞在羟基磷灰石上的生长情况。
结果与结论：原代培养的小型猪牙周膜干细胞生长良好，细胞中基质细胞抗原1免疫荧光呈阳性。扫描电镜结果表明，培养第1，3，7天，牙周膜干细胞在羟基磷灰石上生长良好。证实，实验采用组织块法成功体外分离培养了小型猪牙周膜干细胞，可在羟基磷灰石支架材料上良好的生长。

关键词: 生物材料, 组织工程口腔材料, 牙周膜干细胞, 体外培养, 羟基磷灰石, 扫描电镜, 小型猪, 省级基金

Abstract:

BACKGROUND: Periodontal tissue engineering technology provides new ideas and new ways for periodontitis-induced bone defect repair.
OBJECTIVE: To develop a culture model for the periodontal ligament cells of miniature swine, which was constructed with hydroxyapatite, to investigate the biocompatibility with hydroxyapatite.
METHODS: Periodontal ligament cells from miniature swine were harvested by using tissue explant method. Immunofluorescence was used to detect the expression of stromal cell antigen 1 in the periodontal ligament cells of miniature swine. The third passage cells were co-cultured with a three-dimension hydroxyapatite scaffold, and the biological characteristics of the cells were observed under a scanning electron microscope at days 1, 3, 7 of co-culture.
RESULTS AND CONCLUSION: The pirmary miniature swine periodontal ligament cells grew well, and they were positive for stromal cell antigen 1. Under the scanning electron microscope, the periodontal ligament cells of miniature swine grew well on the hydroxyapatite scaffold at days 1, 3, 7 of co-culture. These prove that the miniature swine periodontal ligament cells, which can be separated using tissue explant method and cultured successfully in vitro, can grow well on the hydroxyapatite scaffold.

Key words: biomaterials, tissue-engineered oral materials, periodontal ligament cells, in vitro culture, hydroxyapatite, scanning electron microscope, miniature swine, provincial grants-supported paper

中图分类号:

R318

马路平，钟良军，张源明，张远，张鹏涛. 小型猪牙周膜干细胞在羟基磷灰石支架材料上的生长[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(29): 5290-5295.

Ma Lu-ping, Zhong Liang-jun, Zhang Yuan-ming, Zhang Yuan, Zhang Peng-tao. Periodontal ligament cells from miniature swine grow on a hydroxyapatite scaffold[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(29): 5290-5295.

图/表（结果） 4

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引言

目前，牙周组织工程作为重建牙周缺失组织、产生新组织的技术，已经成为牙周组织再生的理想方法。组织工程技术的基本原理是将体外培养的具有分化和增殖能力的活细胞与生物相容性良好的支架材料复合培养，再将此细胞支架复合物植入体内特定部位或在体外继续培养，通过细胞之间的相互黏附、生长繁殖分泌细胞外基质，细胞在生物材料逐渐被机体降解吸收的过程中形成新的具有特定形态、结构和功能的相应组织或器官，达到促进组织再生、修复创伤和重建功能的目的。组织工程的核心技术是建立由细胞与生物支架材料构成的三维复合体，而理想的种子细胞和生物支架材料是组织工程的两大要素。作为种子细胞之一的牙周膜干细胞是来源于牙周韧带组织的成体干细胞，具有成体干细胞的基本特点, 即具有自我更新和多向分化潜能，能增殖分化成牙周组织^[1-2]。

羟基磷灰石是脊椎动物的骨骼和牙齿的主要组成部分，也是最常见的一种生物活性材料，在临床上被广泛应用于骨缺损修复和口腔科手术。研究表明羟基磷灰石生物陶瓷具有较好的生物相容性，植入体内安全、无毒，并且可以传导骨生长即新骨可以从羟基磷灰石植入体与原骨结合处沿着其表面或内部贯通性孔隙攀附生长^[3-4]。

实验从小型猪牙周组织中分离培养牙周膜干细胞，探索其体外培养方法并初步鉴定，将牙周膜干细胞接种在羟基磷灰石支架材料上复合培养，进行牙周膜干细胞/羟基磷灰石的骨组织构建，并在第1，3，7天用扫描电镜观察其生长情况，以期为组织工程化的种子细胞-支架材料复合体的构建提供实验依据，并为临床应用提供大型动物的实验依据，为组织工程技术在牙周病学领域的应用奠定一定的基础。

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2011年11月至2012年5月在新疆医科大学第一附属医院实验研究中心完成。

材料：

实验动物：健康贵州近交雄性小型猪6只，6-12月龄，体质量15-25 kg，由四川成都硕达生物科技有限公司提供，动物合格证号：SCXK(川)2008-24。

实验对动物的处理方法符合中华人民共和国科学技术部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见》^[5]。

支架材料：实验选取的支架材料是羟基磷灰石生物陶瓷，由北京意华科健商贸有限公司生产，是采用天然珊瑚为原料经加工制成的骨科填充材料。羟基磷灰石生物陶瓷是一种具有良好生物相容性，骨传导性以及异种骨移植材料的多孔生物陶瓷，其孔隙结构与人体松质骨相似。实验所使用的羟基磷灰石支架材料的直径规格为0.25-1.00 mm，孔径为10-600 μm，孔隙率为30%-70%。

小型猪牙周膜干细胞体外培养的主要仪器设备及试剂：

实验方法：

小型猪牙周膜干细胞的原代培养：采用组织块法进行原代培养。采用阿托品0.01-0.02 mg/kg，体积分数3%戊巴比妥钠30 mg/kg，盐酸氯胺酮15-20 mg/kg联合麻醉小型猪，碘伏常规消毒拔牙术区，铺洞巾，严格无菌操作下拔除下颌前牙4颗。牙齿拔出后，立即放入到含 1 000 U/mL青/链霉素的DMEM低糖培养基中，冰盒转运至干细胞实验室。置于4 ℃冰箱中，存放时间不超过3 h。超净台内取出牙齿，无菌PBS冲洗3遍后，轻柔刮取根中1/3牙周膜组织，均匀剪碎至约1 mm×1 mm× 1 mm大小组织块。将牙周膜组织块置入25 cm²细胞培养瓶内，加入5 mL体积分数15%的胎牛血清， 100 μmol/L的L-抗坏血酸，2 mmol/L L-谷胺酰胺， 100 U/mL青霉素，100 mg/L链霉素的DMEM培养基，37 ℃、体积分数5%CO₂孵育箱培养，培养前 3 d避免观察和晃动培养瓶，防止组织块脱壁。于首次培养7 d行半量换液，后行3 d次全量换液。

小型猪牙周膜干细胞的传代培养：待细胞在组织块边缘游出的细胞增多且密集到一定程度，倒置显微镜下观察到细胞开始复层生长时就进行首次传代：吸去培养液，无菌PBS反复冲洗2遍，加入1 mL 体积分数0.25%胰蛋白酶+EDTA消化，置于37 ℃恒温箱中孵育3 min后，轻轻拍打细胞培养瓶底部，倒置显微镜下观察，镜下见梭形细胞变为圆形或者椭圆形，在消化液中悬浮，立即加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM低糖培养基终止消化。将细胞悬液置入15 mL离心管室温下1 000 r/min，离心6 min，倾去上清液，加入10 mL DMEM培养基，置入CO₂细胞培养箱内，在饱和湿度、37 ℃、体积分数5%CO₂条件下孵育。

小型猪牙周膜干细胞的鉴定：取第3代对数期小型猪牙周膜干细胞，做基质细胞抗原1免疫荧光染色鉴定^[6]：吸去培养液，PBS冲洗3遍；40 g/L多聚甲醛室温下固定30 min；PBS荡洗3 min×3次；体积分数0.2% Triton X-100室温下孵育5 min；PBS荡洗3 min×3次；体积分数3%H₂O₂室温下处理孵育30 min；PBS荡洗3 min× 3次；山羊血清工作液室温下封闭30 min，倾去；取小鼠抗人基质细胞抗原1单克隆抗体母液2.5 μL，加入到100 μL无菌PBS中，混合均匀，滴加稀释抗体工作液，4 ℃湿盒内过夜；次日37 ℃温箱内复温60 min；PBS荡洗3 min×3次；滴加1∶100稀释的山羊抗小鼠FITC荧光二抗，37 ℃避光孵育60 min；PBS荡洗3 min×3次；Heochst工作液处理5 min，倾去；PBS荡洗3 min×3次；避光条件下，荧光倒置相差显微镜下观察。对照组以PBS代替一抗，其他步骤相同。选取所有基质细胞抗原1阳性细胞组进行扩增培养。

小型猪牙周膜干细胞/羟基磷灰石的组织构建：

羟基磷灰石支架材料的光镜及电镜观察：对羟基磷灰石支架材料进行大体观察和光学显微镜的观察。将羟基磷灰石支架材料用PBS冲洗2次，体积分数3%戊二醛固定，乙醇梯度脱水，临界点干燥，喷金，用扫描电子显微镜观察支架的微观结构。

羟基磷灰石支架材料的预处理：实验前1 d，将羟基磷灰石支架材料用环氧乙烷消毒，在超净台内将羟基磷灰石支架材料置于48孔板中，加入低糖DMEM液将其完全浸没，预湿备用，在细胞接种前吸去孔板中多余液体。

小型猪牙周膜干细胞的接种：取诱导培养的第3代牙周膜干细胞，体积分数0.25%胰酶消化，1 000 r/min离心5 min，收集细胞，细胞计数，调整细胞浓度为1×10⁹ L^-1。轻柔均匀的滴加在羟基磷灰石支架材料上，直至饱和，放入CO₂细胞培养箱。标准环境下静置培养四五小时，待细胞充分黏附于羟基磷灰石支架材料后，加入含体积分数15%FBS的DMEM培养液继续培养，每隔24 h换液1次。

扫描电镜观察羟基磷灰石与牙周膜干细胞复合物的超微结构：牙周膜干细胞接种于羟基磷灰石支架材料复合培养后第1，3，7天，分别取一块标本，PBS轻柔冲洗2次，体积分数3%戊二醛固定，乙醇梯度脱水，临界点干燥，喷金，扫描电镜观察牙周膜干细胞在羟基磷灰石支架材料上的黏附生长情况。

主要观察指标：体外培养的牙周膜干细胞形态及牙周膜干细胞/羟基磷灰石组织复合体的超微结构。

讨论

牙周组织的再生是牙周组织结构和功能的重建，是目前牙周病研究领域的重要课题。当前，牙周组织再生研究为临床修复牙周炎骨缺损提供了新思路，用组织工程学的技术和方法促进牙周组织再生已经成为这一领域的研究热点^[7]。

种子细胞和生物材料是组织工程的两大核心基础研究领域，在应用种子细胞和生物材料进行组织构建的过程中，必须综合考虑。同时，实验选择了贵州近交小型猪作为实验动物，因为其作为非啮齿类大型实验动物具有其他实验动物不可替代的研究价值。小型猪的外观特点是体型小，毛色黑亮光泽，有乳牙和恒牙两副牙列，其牙颌系统、牙体大小和形态、牙齿生长发育特点与人近似，且在消化系统、心血管系统、骨骼发育和营养代谢等方面均与人类有很大的相似性,且可以发生有自发性的牙周病，因此常被作为口腔疾病的动物模型^[8-9]。

3.1 小型猪牙周膜干细胞的培养与鉴定牙周膜干细胞由于其在牙周组织中存在的比较少，分离技术相对困难，所以是制约牙周膜干细胞研究的重要原因之一。直到Seo等^[8]首先从人牙周膜中分离出了一组有多向分化潜能的干细胞，为牙周组织再生提供了重要的细胞来源。牙周膜干细胞具有骨髓间充质干细胞的特性，发挥多种潜能，与牙髓干细胞具有相似特征，并能增殖分化成牙周组织^{[1-2, 10]}。

实验采用组织块法培养原代细胞，结果表明，该法培养的小型猪牙周膜干细胞生长状态良好，原代和传代生长的细胞均为梭型成纤维样细胞，细胞胞核呈圆形或椭圆形，核仁清晰，胞质丰富。但原代细胞培养的周期较长，一般在培养12-16 d方可首次传代。基质细胞抗原是早期间充质干细胞表达的表面标记物之一，常用来进行间充质干细胞的检测和鉴定^[11-12]。实验通过免疫荧光染色对细胞表面基质细胞抗原1进行检测，其阳性表达证明了用组织块法获取的牙周膜干细胞的干细胞属性。

实验表明，在用组织块法进行细胞原代培养和传代过程中需要注意以下几点：①取材时要注意无菌操作，控制污染源。大多数研究认为取材方法应刮取牙根中1/3的牙周膜，认为这样做可以避免细菌的污染和牙龈成纤维细胞的混入；取材是原代培养的关键环节^[13]。②在操作过程中应尽量保持牙周膜组织的湿润，切忌干藏，避免其失去活性。因此，拔牙后立即将其放入到4 ℃含1 000 U/mL 青/链霉素的DMEM低糖培养基中，冰盒转运至干细胞实验室。③组织块贴壁前避免晃动瓶体和频繁观察。④首次传代掌握合适时机。细胞传代一般公认的说法是当细胞长满培养瓶的80%时即可传代^[14]。但组织块法的首次传代如按常规的方法传代，细胞长满瓶底所需时间太长，会导致明显的细胞老化现象，细胞活性下降，且细胞数量较少，不易成活。因此，实验在组织块边缘游出的细胞增多且密集到一定程度，可观察到细胞开始复层生长时就进行首次传代。

3.2 支架材料的选择支架材料不仅为细胞提供结构支撑作用，而且起到诱导组织再生和控制组织结构的模板作用，是组织工程研究中的重点之一^[15]。研究表明羟基磷灰石生物陶瓷具有良好的生物相容性，植入体内不仅安全、无毒，还能传导骨生长，即新骨可以从羟基磷灰石植入体与原骨结合处沿着植入体表面或内部贯通性孔隙攀附生长^[16]。

据文献报道孔径为100-400 μm对于成骨细胞的长入有利^[17-18]，因为它可以提供合适的压力和张力作用于细胞的机械刺激感受器。实验使用的羟基磷灰石生物陶瓷的孔径为100-600 μm，孔隙率约60%，具有较好的生物相容性。

3.3 牙周膜干细胞/羟基磷灰石的组织构建及扫描电镜观察实验的牙周膜干细胞/羟基磷灰石的组织构建是利用组织工程技术的原理和方法，用种子细胞牙周膜干细胞和生物支架材料羟基磷灰石复合，形成和再生组织化骨的过程，其过程不是简单的牙周膜干细胞与支架材料羟基磷灰石的复合，而是涉及种子细胞牙周膜干细胞的培养、羟基磷灰石材料的预备、牙周膜干细胞的接种、复合培养等环节。实验将羟基磷灰石支架材料在接种前进行预湿，这样可促进接种的细胞悬液在生物材料内均匀流动，提高细胞接种的均匀度，但如果接种前支架材料内的液体含量过高，会降低细胞的黏附率。

实验将小型猪牙周膜干细胞接种到羟基磷灰石支架材料上复合培养后，分别在培养第1，3，7天用扫描电镜观察其黏附生长情况。观察可见细胞能紧密附着于材料表面，黏附生长，细胞胞体呈高度铺展，相互交联并堆积复层生长，增殖状态良好，最终覆盖材料表面，表明牙周膜干细胞和羟基磷灰石有较好的生物相容性。

实验结果为牙周骨组织修复和牙周组织工程研究提供了一定的实验依据，也为将来临床应用打下基础。但实验构建的牙周膜干细胞/羟基磷灰石组织工程化骨，能否在植入体内后修复牙周组织缺损，需后续动物实验进一步研究和验证。

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1文章构思特点
牙周组织的再生是牙周组织结构和功能的重建，是目前牙周病研究领域的重要课题。当前，牙周组织再生研究为临床修复牙周炎骨缺损提供了新思路，用组织工程学的技术和方法促进牙周组织再生已经成为这一领域的研究热点。种子细胞和生物材料是组织工程的两大核心基础研究领域，在应用种子细胞和生物材料进行组织构建的过程中，必须综合考虑。

2中文内容介绍
实验研究从小型猪牙周组织中分离培养牙周膜干细胞，探索其体外培养方法并初步鉴定，将牙周膜干细胞接种在羟基磷灰石支架材料上复合培养，进行牙周膜干细胞/羟基磷灰石的骨组织构建，并在第1、3、7天用扫描电镜观察其生长情况，以期为组织工程化的种子细胞-支架材料复合体的构建提供实验依据，并为临床应用提供大型动物的实验依据，为组织工程技术在牙周病学领域的应用奠定一定的基础。

3本文创新点

（1）提供证据：检索Pubmed, Medline, OVID, CNKI等数据库，检索时间2001-07至2012-12检索关键词为小型猪、牙周膜干细胞、羟基磷灰石、生物相容性，由最终检索认定实验具先进性。
（2）创新性说明：实验选择了贵州近交小型猪作为实验动物，其牙颌系统、牙体大小和形态、牙齿生长发育特点与人近似，且在消化系统、心血管系统、骨骼发育和营养代谢等方面均与人类有很大的相似性，为牙周组织再生修复提供大型动物模型的实验依据。通过组织块法分离获得小型猪牙周膜干细胞生长良好，有较好的体外增殖能力和自我更新能力。牙周膜干细胞与羟基磷灰石支架材料有较好的生物相容性，扫描电镜观察显示牙周膜干细胞在支架材料上能良好的黏附生长。

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