骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化前后基因及Ca2+浓度的变化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.27.020

摘要/Abstract

摘要：

背景：单唾液酸四己糖神经节苷脂(Monosialotetrahexosylganglioside，GM1)在神经细胞的生长发育、分化、再生和细胞内外信息传递等多种生理过程中发挥重要作用。
目的：探讨GM1对骨髓间充质干细胞按照Woodbury经典诱导方案将其诱导分化为神经元样细胞前后基因方面和细胞内游离Ca2+浓度的变化。
方法：分离纯化SD大鼠骨髓间充质干细胞进行传代培养，传至第5代时，待细胞融汇成致密单层后，加入50 mmol/L神经节苷脂设为GM1组，预培养24 h后按照Woodbury经典诱导方案进行诱导，设置对照组，采用免疫组化和Realtime PCR技术分别检测诱导前后生长相关蛋白43、神经元特异性烯醇化酶、神经丝蛋白和神经巢蛋白的蛋白和mRNA表达的变化，采用激光扫描共聚焦显微镜检测诱导前后细胞内游离钙离子浓度的变化。
结果与结论：①加入GM1组诱导分化后较对照组生长相关蛋白43、神经元特异性烯醇化酶、神经丝蛋白和神经巢蛋白表达水平增高(P < 0.05)，GM1能够促骨髓间充质干细胞诱导分化为神经元样细胞。②更换诱导液后，两组细胞内荧光强度逐渐增加，到100 s 达高峰值，其后逐渐减弱，但20 min 时细胞荧光强度仍高于诱导前，加入GM1组，细胞内游离Ca2+浓度较对照组有所增加(P < 0.05)。说明GM1能够促进细胞内Ca2+浓度增加，游离Ca2+在诱导过程中可能有促进作用。③诱导后生长相关蛋白43、神经元特异性烯醇化酶、神经丝蛋白和神经巢蛋白基因表达改变不显著，说明Woodbury经典诱导方案可能为转录后水平即蛋白水平的调控。

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 神经节苷脂, 骨髓间充质干细胞, 神经元样细胞, 诱导分化, 免疫组化, 聚合酶链反应, 激光扫描共聚焦显微镜, 细胞内游离钙离子, 生长相关蛋白43, 神经元特异性烯醇化酶, 神经丝蛋白, 神经巢蛋白, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Monosialotetrahexosylganglioside plays an important role in a variety of physiological processes, such as the nerve cell growth and development, differentiation, regeneration and intracellular and extracellular information transmission.
OBJECTIVE: To investigate the effects of monosialotetrahexosylganglioside on the changes of gene expression and calcium ion concentration in the course of inducing the mesenchymal stem cells into neuron-like cells with Woodbury’s method.
METHODS: The mesenchymal stem cells from Sprague Dawley rats were cultured after isolated and purified, After 5 passages in culture, the cell integrated into a dense monolayer, and treated with 50 mmol/L
monosialotetrahexosylganglioside for 24 hours as the monosialotetrahexosylganglioside group; then the mesenchymal stem cells were induced into neuron-like cells with the methods of Woodbury after pre-cultured for 24 hours, and set the control group. The protein and mRNA expression levels of growth-associated protein 43, neuron-specific enolase, neurofilament and nestin were detected by immunocytochemistry and real-time PCR, respectively. The fluorescence intensity of intracellular free calcium ion before and after inducing was detected by laser scan confocal microscope.
RESULTS AND CONCLUSION: After induction, the expression levels of growth-associated protein 43, neuron-specific enolase, neurofilament and nestin of the mesenchymal stem cells in the monosialotetrahexosylganglioside group were higher than those in the control group (P < 0.05), demonstrating that monosialotetrahexosylganglioside could promote the differentiation of mesenchymal stem cells into neuron-like cells. The fluorescence intensity in mesenchymal stem cells was increased gradually in two groups after the medium was replaced by the induction medium, attained its peak value at 100 seconds and then decreased gradually, but the fluorescence intensity was still higher than that before the induction at 20 minutes. The fluorescence intensity of intracellular free Ca2+ was increased significantly in the monosialotetrahexosylganglioside group when compared with the control group (P < 0.05), suggesting that monosialotetrahexosylganglioside could increase the concentration of intracellular free Ca2+, and intracellular free Ca2+ may be useful in the course of induction. The changes of protein expression levels of growth-associated protein 43, neuron-specific enolase, neurofilament and nestin were not significant after induction, indicating that Woodbury classic induced programme could regulate the post-transcriptive protein level.

Key words: stem cells, bone marrow-derived stem cells, monosialotetrahexosylganglioside, bone marrow mesenchymal stem cells, neuron-like cells, induction and differentiation, immunohistochemistry, polymerase chain reaction, laser scan confocal microscope, intracellular free Ca2+, growth-associated protein 43, neuron-specific enolase, neurofilament, nestin, stem cell photographs-containing paper

中图分类号:

R394.2

潘国强，齐凤平，徐洪，王相利. 骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化前后基因及Ca2+浓度的变化[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.27.020.

Pan Guo-qiang, Qi Feng-ping, Xu Hong, Wang Xiang-li. Gene expression and calcium ion concentration variation in bone marrow mesenchymal stem cells differentiating into neuron-like cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.27.020.

图/表（结果） 6

2.1 骨髓间充质干细胞培养、诱导分化加入预诱导液24 h后骨髓间充质干细胞细胞体积缩小，变圆，少量骨髓间充质干细胞胞体已变成近似球形，具有短的突起，见图1。

在加入诱导液后约30 min后，观察到细胞回缩，向外伸出突起，部分细胞扁平的胞浆向胞核进一步收缩，细胞体逐渐变成圆形或锥形，形状似神经细胞。以后随着时间的进展，具有神经细胞形态特点的细胞数量逐渐增多，形成双极或多极细胞。到5 h后典型神经元样细胞不再增多，形态也不再发生明显改变，见图2。

2.2 免疫组化结果加入50 mmol/L的GM1培养骨髓间充质干细胞24 h及诱导5 h后，生长相关蛋白43、神经元烯醇化酶、神经丝和巢蛋白的阳性细胞率即蛋白水平比对照组明显增加，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图3，4和表1。

2.3 Real time PCR及电泳结果两组所有样本均可见S形扩增曲线，标准曲线斜率接近-2.45，相关系数绝对值为0.994。各检测基因扩增产物均可见明显单一波峰，无明显杂峰。电泳图示扩增产物为目的基因，无杂带，见图5。诱导前后检测两组基因生长相关蛋白43、神经元烯醇化酶、神经丝和巢蛋白 mRNA的表达水平比较差异均无显著性意义(P > 0.05)。

2.4 激光扫描共聚焦显微镜观察结果骨髓间充质干细胞负载荧光探针Fluo-3/AM 45 min后，固定放置在激光扫描共聚焦显微镜37 ℃载物台上，用0.01 mol PBS (pH7.4)洗3次，加入诱导液无血清培养液。从加诱导剂时开始在488 nm激光下扫描观测细胞形态和荧光强度的变化。更换诱导液后，两组细胞内荧光强度逐渐增加，到100 s达高峰值，其后逐渐减弱，但 20 min时细胞荧光强度仍高于诱导前。加入GM1组[Ca2+]i浓度较对照组[Ca2+]i浓度明显增加(P < 0.05)。见图6-8。

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引言

材料方法

设计：细胞和动物的对照观察实验。

时间及地点：于2011年6月至2012年4月培养细胞、免疫组化和激光扫描共聚焦显微镜实验在河北联合大学中心实验室完成，Realtime PCR实验在唐山市中心血站完成。

材料：

实验动物：健康成年SD大鼠，雄性，150-200 g，购于北京维通利华动物公司，动物许可证：SCXK京20090003，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。

神经节苷脂与骨髓间充质干细胞向神经元样细胞诱导前后基因及Ca²⁺浓度变化实验的主要试剂、仪器：

实验方法：

骨髓间充质干细胞的分离和培养：无菌条件下取健康成年SD大鼠双侧股骨和胫骨，用含体积分数10%FBS的L-DMEM，反复冲洗骨髓腔，冲出骨髓后充分混匀，离心后弃上清及脂肪层，沉淀用L-DMEM培养基混匀，轻轻叠加到密度为1.073 g/mL的Percoll分离液上，离心后取乳白色单核细胞层(中间界面层)，再用L-DMEM混匀离心洗涤两次，细胞沉淀中加入 L-DMEM (含体积分数10%FBS)，计数细胞，调整浓度，按1×10⁹ L^-¹细胞浓度接种于一次性塑料培养瓶中，置于CO₂孵箱中培养， 48 h后首次换液，弃掉未贴壁细胞。以后每3 d换1次液。待培养的细胞增殖接近融合状态时，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，按1∶2比例传代培养。倒置相差显微镜观察不同时期细胞生长情况。

骨髓间充质干细胞的诱导分化：细胞传至第5代，待细胞融汇成致密单层后，去除培养液，以0.01 mol/L PBS (pH 7.4)冲洗3次，加入预诱导液(L-DMEM、 1 mmol/L β-巯基乙醇、体积分数20%FBS、50 mmol/L GM1)设为GM1组，24 h后去除预诱导液，0.01 mol/L PBS冲洗3次，加入诱导液(L-DMEM、5 mmol/L β-巯基乙醇、50 mmol/L GM1)，诱导培养5 h。并设置对照组，即预诱导液和诱导液不加入GM1，预诱导24 h及诱导培养5 h。

在倒置相差显微镜下进行观察、照相。

免疫组化技术检测：常规制备细胞爬片^[9]，取两组诱导前后细胞(诱导前后各10个样本)用40 g/L多聚甲醛固定，按SABC法检测生长相关蛋白43(Growth Associated Protein，GAP-43)、神经元烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)、神经丝(neurofilament，NF)和巢蛋白(Nestin)诱导前后的蛋白表达。光镜下观察，以细胞浆出现棕黄色颗粒为阳性，未着色为阴性。选择5-10个高倍镜视野，采用生物医学图像分析系统随机计数200个细胞。

阳性细胞率=(阳性细胞数/200)×100%

Realtime PCR技术检测：用Trizol试剂分别提取两组诱导前后(诱导前后各6个样本)细胞总RNA，应用紫外分光广度仪测定RNA纯度，检测结果A₂₆₀/A₂₈₀的比值在1.8-2.0，反转录为cDNA。PCR引物由上海生物工程技术服务有限公司设计合成。

PCR反应体系：总体积50 μL(引物终浓度 0.2 μmol/L)，包括Realtime PCR MasterMix 25 μL，引物(10 μmol/L)各1 μL，cDNA模板3 μL，去DEPC水 20 μL。PCR反应条件：50 ℃ 2 min，95 ℃10 min， 95 ℃15 s，60 ℃ 1 min，共45个循环。PCR产物于2%琼脂糖凝胶电泳, 凝胶成像系统扫描照相并观测条带大小及质量。以标本扩增的CT值和标准曲线得出各组所检目的基因mRNA的相对拷贝数，将各检测基因与内参基因GAPDH相对拷贝数的比值做统计学处理。

神经节苷脂与骨髓间充质干细胞向神经元样细胞诱导前后各检测基因引物序列：

Gene	Gene ID	Primers	Lengths
GAPDH	NM_017008	Sense: 5’-TGC TGA GTA TGT CGT GGA G-3’	288 bp
		Anti-sense:5’-GTC TTC TGA GTG GCA GTG AT-3′
GAP-43	BC127502	Sense: 5′-AGATGGCTCTGCTACTACCG-3′	234 bp
		Anti-sense: 5’-ACA TCG GCT TGT TTA GGC-3’
Nestin	NM_012987	Sense: 5’-GGA GCC ATT GTG GTC TAC TGA-3′	290 bp
		Anti-sense: 5’-TCC CAC CGC TGT TGA TTT-3’
NF-M	NM_017029	Sense: 5’-ATC CAG GCG TCG CAC ATC-3’	151 bp
		Anti-sense 5’-GCT TGG CGT AGC GGC ATT-3’
NSE	AF019973	Sense: 5’-GGG ACA AAC AGC GTT ACT T-3’	249 bp
		Anti-sense: 5’-CAA TGT GGC GAT AGA GGG-3’

激光扫描共聚焦显微镜技术检测细胞内Ca²⁺浓度：细胞传至第4代，细胞消化后传至共聚焦专用培养皿中(诱导前后各6个样本)，待细胞融汇成致密单层后，去除培养液，同步化24 h，吸去培养液，用含有1 mmol/L的β-巯基乙醇，体积分数20%胎牛血清的L-DMEM、50 mmol/L的GM1进行预诱导，37 ℃培养箱中培养 24 h，24 h后去除预诱导液，0.01 mol/LPBS (pH7.4)冲洗3次，加入含有10 µmol/L Fluo-3/AM的L-DMEM培养液负载45 min，每隔10 min轻轻吹打，避光，45 min后，0.01 mol/L PBS(pH7.4)冲洗3次，加入诱导液(L-DMEM、5 mmol/L β-巯基乙醇、50 mmol/L GM1)进行诱导培养，设置对照组，即预诱导液和诱导液不加入GM1，预诱导24 h及诱导培养5 h。并在激光扫描共聚焦显微镜下进行观测细胞形态和荧光强度的变化。利用分析软件对数据化图像进行分析，以参数平均灰度代表细胞内Ca²⁺浓度变化。

主要观察指标：①骨髓间充质干细胞的诱导分化观察。②诱导分化前后神经细胞的鉴定。③诱导前后细胞内游离钙离子浓度的检测。④诱导前后相关因子mRNA的检测。

统计学分析：用Excel建库，实验数据以x(_)±s表示，由第一作者用SPSS11.5采用t检验进行统计分析，以P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

骨髓间充质干细胞有自我更新和增殖的能力，具有多向和横向分化的能力，骨髓间充质干细胞取材方便，易于培养，遗传背景稳定，自体移植无明显免疫排斥反应，不涉及伦理道德等问题，因而被认为是组织工程理想的种子细胞^[10]。在体外应用β-巯基乙醇、二甲基亚砜及其他中药(如丹参酮、三七总皂甙)等作为诱导剂，能成功地诱导成年大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞，这为临床神经系统疾病的细胞治疗开启了一片光明^[11-12]。

神经节苷脂是一类含有唾液酸的糖脂，GM1是神经元包膜中含量最丰富的神经节苷脂，只存在于神经系统中。GM1在神经细胞的生长发育、分化、再生和细胞内外信息传递等多种生理过程中发挥重要作用^[13]。外源性GM1可以通过调控电压依赖性钙通道调节内流，增加细胞内Ca²⁺浓度，促进突触的发生，促进神经递质、神经营养因子的释放。GM1能促进由于各种原因引起的中枢神经系统损伤的功能恢复^[14-17]。

Ca²⁺作为细胞内第二信使发挥作用，几乎调控机体所有的生理活动，其绝对浓度并不是很重要，但是其浓度的变化越来越受到重视。Fluo-3可以与游离钙结合，其产生的荧光强度与细胞内游离钙离子的浓度成正比，荧光强度的变化可指示游离钙离子的相应变化。Fluo-3可用488 nm氩激光激发，适用于激光扫描共聚焦显微镜检测^[18-19]。已有一些文献报道了，GM1和神经生长因子能够通过调控Ga²⁺浓度从而发挥神经保护作用^[20-21]。

在这次试验中，骨髓间充质干细胞在加入神经节苷脂组诱导分化为神经元样细胞后，生长相关蛋白43、神经元烯醇化酶、神经丝和巢蛋白的阳性细胞率即蛋白水平较对照组明显增加，提示神经节苷脂对骨髓间充质干细胞的诱导分化有促进作用。两组骨髓间充质干细胞诱导分化为神经元样细胞过程中，细胞内荧光强度逐渐增加，到100 s达高峰值，其后逐渐减弱，但20 min时细胞荧光强度仍高于诱导前, 此时可见骨髓间充质干细胞开始向神经元样细胞分化，但是加入神经节苷脂组于100 s时[Ca²⁺]i浓度较对照组明显增高。Ca²⁺作为细胞内重要第二信使，在骨髓间充质干细胞诱导分化为神经元样细胞过程中可能有促进作用。

骨髓间充质干细胞按照Woodbury方案进行诱导分化成神经元样细胞是否可能导致细胞内一系列反应，启动骨髓间充质干细胞的神经元发育和分化基因表达，以及骨髓间充质干细胞的细胞骨架(微丝、微管和中间丝)重排, 导致细胞伸出细长突起, 部分相邻的细胞突起连接成网状, 表达神经元特异标志物如生长相关蛋白43、神经元烯醇化酶、神经丝、巢蛋白等, 从而骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞呢？但在本次试验中，通过免疫组化证实于诱导后生长相关蛋白43、神经元烯醇化酶、神经丝、巢蛋白蛋白水平明显增加，但诱导后通过Realtime-PCR检测基因生长相关蛋白43、神经元烯醇化酶、神经丝、巢蛋白 mRNA的表达水平无显著增加(P > 0.05)，提示Woodbury经典诱导方案可能为转录后水平即蛋白水平的调控，但具体机制有待进一步研究。