神经干细胞移植治疗帕金森病的有效性与安全性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.27.014

摘要/Abstract

摘要：

背景：目前临床应用扩增的神经干细胞治疗神经系统疾病仍在探索阶段。
目的：探讨神经干细胞移植治疗帕金森病的有效性以及安全性。
方法：取12周人胚胎脑组织体外培养扩增，计数5×106-2×107制作成混悬液4-6 mL，通过腰穿、颈动脉注射途径植入30例帕金森病患者体内，1次/周，共3次。移植前后进行统一帕金森病评定量表(UPDRS)、修正Hoehn-Yahr分级量表、帕金森病Schwab & England日常活动分级量表评分。移植前后检测和评估血尿常规、肝功、肾功、不良反应。
结果与结论：12周龄胚胎培养的神经干细胞可在体外稳定扩增，并且具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力。通过随访发现神经干细胞移植能有效控制帕金森病病理进程、恢复受损脑功能，改善患者的神经功能，无明显并发症。可见应用体外长期扩增的人类神经干细胞移植治疗帕金森病是可行和有效的。

关键词: 干细胞, 干细胞移植, 神经干细胞, 帕金森病, 神经系统疾病, 细胞移植, 酪氨酸羟化酶, 巢蛋白, 日常生活活动能力, 扩增, 有效性, 安全性, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: At present, the clinical application of amplified neural stem cells in the treatment of nervous system diseases is still in exploratory stage.
OBJECTIVE: To investigate efficacy and safety of neural stem cell transplantation for the treatment of Parkinson’s disease.
METHODS: The embryonic brain tissues aged 12 weeks were obtained for proliferation in vitro, then the brain tissues (5×106-2×107) were prepared into the 4-6 mL suspension. The suspension was injected into 30 cases of Parkinson’s disease through lumbar puncture and carotid injection, once a week, continuously for 3 weeks. Unified Parkinson’s disease rating scale, Hoehn-Yahr scale and Schwab & England Activities of Daily Living Scale scoring were performed prior to and after transplantation. Blood and urine routine, liver function, renal function and adverse reactions were detected and evaluated prior to and after transplantation.
RESUTLS AND CONCLUSION: The 12-week-old embryos cultured neural stem cells could be stably amplified in vitro with the capacities of differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes. The follow-up results showed that neural stem cell transplantation could effectively control the pathological process of Parkinson’s disease, restore the damaged brain function, and improve the patient’s neurological function without significant complications. It is feasible and effective to use the in vitro long-term amplified human neural stem cell transplantation in the treatment of Parkinson’s disease.

Key words: stem cells, stem cell transplantation, neural stem cell, Parkinson’s disease, nervous system diseases, cell transplantation, tyrosine monooxygenase, nestin, activity of daily living, amplification, effectiveness, safety, stem cell photographs-containing paper

中图分类号:

R318

张晓英. 神经干细胞移植治疗帕金森病的有效性与安全性[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.27.014.

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图/表（结果） 4

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引言

据在北京、上海、西安三地进行的流行病学研究表明在40岁以上的人口中大约每250人就有1例帕金森病患者，65岁以上的人口中，大约每100人就有1例患者。据世界帕金森病协会资料显示，全球现有超过400万帕金森病患者，中国有170万人患病，估计中国每年有近10万人成为新发的帕金森病患者。患病率进入了前所未有的“黄金期”，高达1.7%帕金森病的危害仅次于肿瘤、心脑血管疾病，被称为中老年人的“第三杀手”。
目前认为帕金森病已知的病因有以下几方面：遗传、环境毒素、人口老龄化加速、氧化应激、药物所致、脑损伤。
传统药物治疗方法只能改善症状，不能控制疾病进展、易形成耐药；手术治疗创伤大，易复发，适应证局限，存在颅内出血、面瘫、语言障碍等危险；脑深部电刺激疗法(DBS)也有局限性，有报道出现构音障碍、感觉异常，部分患者术后一段时间内症状复发，有严重心肺肾疾病、难以控制的高血压和有精神症状的患者不宜应用。
随着研究的进展，对帕金森病病因、发病机制、解剖学基础有了更深入的了解，科学家意识到从根本上解决问题需要依靠神经保护治疗和神经功能重塑策略。针对这点，国内外学者开始探讨细胞移植治疗帕金森病。Takagi等将猕猴胚胎干细胞诱导成多巴胺神经元，移植帕金森病猴子模型，改善了猴子的行为学症状。1988年，Lindvall等开展了第1例人胚胎中脑移植治疗原发性帕金森病，后来国内外学者应用神经干细胞移植对帕金森病开展了探索性的治疗研究。部分帕金森病患者神经功能有显著改善，短期内可以停用药物或减少药物治疗。干细胞治疗帕金森病的研究经历了胎脑-自体骨髓间充质干细胞-脐带源间充质干细胞-胚胎神经干细胞的发展过程。
神经干细胞移植治疗帕金森病的作用机制：向多巴胺能神经元分化、分泌多巴胺递质、改变细胞生物电变化、调节内环境、建立细胞间网络联系、减少炎症和神经元的退化、生长血管、改变帕金森病的自然进程。
神经干细胞移植治疗帕金森病的可行性^[1-5]：①帕金森病的发病机制明确。②帕金森病的发病部位局限。③成功而稳定的动物模型。④可以体外分化特异的细胞类型进行移植。⑤神经系统是免疫豁免区。⑥前期动物实验和临床试验证明有效。实验主要探讨神经干细胞移植治疗帕金森病的有效性以及安全性。

材料方法

设计：神经干细胞移植(或药物治疗)前后对照临床试验。
时间及地点：资料收集于2009年8月至2012年1月四平中心医院神经内科。
对象：
诊断标准：符合《2006年原发性PD诊断标准》。①中年、老年人中逐渐出现进行性加重的活动和动作缓慢，持久活动后动作更慢、幅度更小。②颈和(或)肢体肌张力增高。③4-6 Hz的静止性震颤或姿势不稳。
纳入标准：原发性帕金森病患者，年龄≥55岁。
排除标准：①严重心、肺、肾功能不全、血液病。②重症感染。③恶性肿瘤。④帕金森综合征。⑤患有传染性疾病或其他慢性病。⑥操作部位不允许。
入选原发性帕金森病患者30例，男14例，女16例，年龄44-83岁，平均(65.47±10.47)岁；病程8-216个月，平均(65.47±50.15)个月；体温36.0-36.8 ℃，平均(36.49± 0.21) ℃；心率60-88次/min，平均(78.47±6.60) 次/min；入院收缩压110-160 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)，平均(125.37±14.35) mm Hg，入院舒张压70-90 mm Hg，平均(79.17±6.03) mm Hg，见表1和表2。

安全性：移植前、移植后7 d，移植后1，3，6，12个月检测和评估血尿常规、肝功、肾功、心电、胸片、头部 MRI、颈部血管超声、一般不良反应、严重不良反应、致病性、致瘤性、致残性。
主要观察指标：统一帕金森病评定量表(UPDRS)评分、帕金森Hoehn-Yahr(修正)分级量表评分、帕金森病Schwab & England日常活动分级评分、血尿常规、肝功、肾功、不良反应。
统计学分析：采用SAS 9.1统计学软件进行统计学分析，配对t 检验。

方法：
技术路线图：纳入标准评估术前检查标准量表神经干细胞移植安全性、有效性评价。
评估：根据患者的年龄、病程、服药史、病情轻重、有无其他器官疾病、操作部位是否允许等情况对患者进行评估。
术前检查：包括血尿常规、血生化、心电、头部MRI、血凝、胸片。
神经干细胞制备：取12周坠胎脑组织，剪碎后用缓冲液洗涤2遍，加入神经干细胞培养基，种到培养皿中，于CO2培养箱中培养，定期加液换液，半月左右细胞生长较满，分到培养瓶中培养，生长较多时用胰酶消化传代，细胞扩增后，取第2-5代细胞，细胞细菌学检查无细菌生长，神经干细胞采取流式细胞仪鉴定LA-DR阴性。
神经干细胞移植数量、时间、途径：①移植的细胞数量：计数5×106-2×107制作成混悬液4-6 mL。②移植时间： 1次/周，共3次，③移植途径：腰穿、颈动脉注射、介入。
神经功能维护：维生素C静脉滴注3 d；神经生长因子1支，1次/d，肌注10 d。
功能评估：
有效性：统一帕金森病评定量表(UPDRS) Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ部分：震颤、强直、步态、语言、表情、抑郁。修正Hoehn-Yahr分级量表以及帕金森病Schwab & England日常活动分级量表评分。
统一帕金森病评定量表(UPDRS) Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ部分：
Ⅰ. 精神、行为和情绪：第3条抑郁的评分标准：0分=无；1分=悲观和内疚时间比正常多，持续时间不超过1周；2分=持续抑郁(1周或以上)；3分=持续抑郁伴自主神经症状(失眠、食欲减退、体质量下降、兴趣降低)；4分=持续抑郁伴自主神经症状和自杀念头或意愿。
Ⅱ. 日常生活活动(确定“开或关”)：①第5条言语(接受)的评分标准：0分=正常；1分=轻微受影响，无听懂困难；2分=中度受影响，有时要求重复才听懂；3分=严重受影响，经常要求重复才听懂；4分=经常不能理解。②第16条震颤的评分标准：0分=无；1分=轻微，不常有；2分=中度，感觉烦恼；3分=严重，许多活动受影响；4分=明显，大多数活动受影响。
Ⅲ. 运动检查：①第18条言语(表达) 的评分标准：0分=正常；1分=表达、理解和(或)音量轻度下降；2分=单音调，含糊但可听懂，中度受损；3分=明显损害，难以听懂；4分=无法听懂。②第20条静止性震颤(面部、嘴唇、下颌、右上肢、左上肢、右下肢及左下肢分别评定)的评分标准：0分=无；1分=轻度，有时出现；2分=幅度小而持续，或中等幅度间断出现；3分=幅度中等，多数时间出现；4分=幅度大，多数时间出现。③第21条手部动作性或姿势性震颤(右上肢、左上肢分别评定)的评分标准：0分=无；1分=轻度，活动时出现；2分=幅度中等，活动时出现；3分=幅度中等，持物或活动时出现；4分=幅度大，影响进食。④第22条强直(患者取坐位，放松，以大关节的被动活动来判断，可以忽略“齿轮样感觉”；颈、右上肢、左上肢、右下肢及左下肢分别评定)的评分标准：0分=无；1分=轻度，或仅在镜像运动及加强试验时可查出；2分=轻到中度；3分=明显，但活动范围不受限；4分=严重，活动范围受限。⑤第28条姿势的评分标准：0分=正常直立；1分=不很直，轻度前倾，可能是正常老年人的姿势；2分=中度前倾，肯定是不正常，可能有轻度的向一侧倾斜；3分=严重前倾伴脊柱后突，可能有中度的向一侧倾斜；4分=显著屈曲，姿势极度异常。⑥第29条步态的评分标准：0分=正常；1分=行走缓慢，可有曳步，步距小，但无慌张步态或前冲步态；2分=行走困难，但还不需要帮助，可有某种程度的慌张步态、小步或前冲；3分=严重异常步态，行走需帮助；4分=即使给予帮助也不能行走。⑦第30条姿势的稳定性(突然向后拉双肩时所引起姿势反应，患者应睁眼直立，双脚略分开并做好准备)的评分标准：0分=正常；1分=后倾，无需帮助可自行恢复；2分=无姿势反应，如果不扶可能摔倒；3分=非常不稳，有自发的失去平衡现象；4分=不借助外界帮助不能站立。⑧第31条躯体少动(梳头缓慢，手臂摆动减少，幅度减小，整体活动减少)的评分标准：0分=无；1分=略慢，似乎是故意的，在某些人可能是正常的，幅度可能减小；2分=运动呈轻度缓慢和减少，肯定不正常，或幅度减小；3 分=中度缓慢，运动缺乏或幅度小；4分=明显缓慢，运动缺乏或幅度小。
帕金森Hoehn-Yahr(修正)分级量表：1级：单侧肢体疾病；1.5级：单侧肢体合并躯干(轴)症状；2级：双侧肢体或中线躯干受影响，但没有平衡功能障碍；2.5级：轻度双侧肢体症状，能从后拉测试中恢复；3级：轻至中度双侧症状，不能从后拉测试中恢复，姿势不稳，转弯变慢，许多功能受到限制，但能自理；4级：重度病残，不需要帮助仍能站立和行走；5级：坐轮椅或卧床，完全依赖别人帮助。
帕金森病Schwab & England日常活动分级评分标准：

讨论

帕金森病是中老年常见的中枢神经系统变性疾病，主要表现为肌强直、运动迟缓、静止性震颤及姿势步态异常等。病理上表现为黑质致密部的多巴胺能神经元变性、缺失和路易小体形成，其确切的病因和发病机制至今仍未阐明。目前仍以药物治疗、外科手术治疗、细胞移植治疗与基因治疗等为主。药物治疗早期可在一定程度上改善患者的震颤、强直等症状，但无法阻止本病的发展，并可引起如运动障碍等严重并发症，而外科手术疗法由于手术创伤性大，适用对象受限等也并非一种理想的治疗策略。

神经干细胞是一种具有多分化潜能的细胞，能自我更新、并通过不对称分裂产生和分化神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞^[6-9]。神经干细胞治疗帕金森病的潜在优势^[10-26]：就帕金森病本身而言主要是由于中脑多巴胺能神经元选择性的发生变性、坏死，其发病部位局限而明确，并且有成功而稳定的动物模型。就免疫排斥方面，由于血脑屏障的存在，使得淋巴细胞难以进入脑内，可避免异基因甚至异种神经干细胞移植导致的免疫排斥反应。神经干细胞可来源于患者本人，通过体外培养获得足够的神经干细胞，再移植到病变的脑组织，可免受排异反应的危险。另外，可以根据移植部位及细胞类型，在体外进行分化，得到与接受部位的细胞类型及功能相似的细胞群后再进行移植，没有异体免疫排斥反应，从而提高了移植细胞的存活率。

针对帕金森病进行细胞移植治疗的研究进程中，除寻求合适的细胞系外，如何将各种有分化潜能的细胞诱导为含量丰富、有功能的多巴胺能神经元尤为关键。沈岳飞等^[27]研究表明从新生鼠脑组织分离出的神经干细胞在体外具有自我更新、多向分化潜能及表达巢蛋白的能力。50-200 μmol/L抗坏血酸均能促进神经干细胞向多巴胺能神经元分化，抗坏血酸浓度从100 μmol/L增加至200 μmol/L时酪氨酸羟化酶阳性细胞率无明显变化。丁继固等^[28]在有血清条件下体外培养鼠胚中脑神经干细胞，予以胶质源性神经营养因子作诱导分化，结果表明胶质源性神经营养因子可促进中脑神经干细胞分化成多巴胺能神经元。另研究表明白细胞介素1β可明显促进中脑神经干细胞分化为数量足够、形态及功能成熟的多巴胺能神经元^[29]。黄娟等^[30]研究显示胶质源性神经营养因子较白细胞介素1β更能促进诱导的多巴胺能神经元的表型成熟。实验成功地从人胎脑中分离和培养了神经干细胞，其表达神经前体细胞标志物Nestin，免疫荧光检测可见酪氨酸羟化酶阳性细胞。

有研究用鼠来源的神经干细胞移植治疗大鼠帕金森病模型，实验证明单纯的纹状体神经干细胞移植可以产生具有典型的形态特征、电生理活性，产生神经递质乃至与宿主神经整合形成功能性突触联系的神经元^[31-33]。郑敏等^[34]体外培养的神经干细胞表达Nestin，具有自我更新和多向分化能力；DAPI标记的神经干细胞植入帕金森病模型大鼠纹状体后大鼠诱导旋转行为显著改善(P < 0.05)；神经干细胞在脑内迁移，并在纹状体内形成少量酪胺酸羟化酶阳性细胞、纤维；植入后纹状体内多巴胺及其代谢产物含量上升，2个月时分别增加3.6倍和2.8倍，4个月时增加3.4倍和2.4倍(P < 0.01)。可见神经干细胞在体外大量扩增后植入帕金森病脑内能长期存活并分化、分泌神经递质，从而部分改善帕金森病症状。梅斌等^[35]建立帕金森病模型大鼠以及体外培养神经干细胞，然后将神经干细胞悬液立体定向移植到帕金森病模型鼠黑质纹状体区，结果显示神经干细胞移植后帕金森病模型鼠旋转行为比对照组明显减少，说明神经干细胞移植能减轻6-羟基多巴胺对黑质纹状体多巴胺能神经元的损伤。郭安臣等^[36]采用自发运动、Morris水迷宫和转杆实验对小鼠的行为进行评价，结果显示经单侧和双侧纹状体神经干细胞移植后2周、4周和8周，帕金森病模型小鼠的自发运动次数明显增加，水迷宫寻台时间显著缩短，转杆时间延长。蒋明等^[37]采用6-羟基多巴胺定点注射毁损黑质纹状体的方法构建帕金森大鼠模型，向造模成功的大鼠纹状体内移植1×10⁶(共计 20 μL)的第3代胚鼠神经干细胞，结果显示帕金森大鼠的旋转行为明显改善。干细胞移植后3周，免疫组化检测发现移植干细胞的帕金森大鼠脑黑质部位酪氨酸羟化酶阳性细胞数增多，纹状体内可见酪氨酸羟化酶阳性细胞；荧光显微镜下观察发现Hoechst 33324d标记神经干细胞在移植针道附近最为密集，并向远隔部位迁徙。干细胞移植后8周，高效液相色谱检测显示移植干细胞的帕金森大鼠纹状体内多巴胺含量明显增高，说明神经干细胞脑内移植能够减轻6-羟基多巴胺引起的大鼠中脑黑质多巴胺能神经元的损伤，改善大鼠的旋转行为。

国内有学者通过脑内移植超顺磁性氧化铁标记神经后通过核磁共振观察其分布和存活情况，对神经干细胞移植治疗帕金森病的疗效观察较为有利^[38]。邓兴力等^[39]将超顺磁氧化铁、增强型绿色荧光蛋白双标中脑神经干细胞移植到帕金森病大鼠纹状体区，其能显著改善阿朴吗啡诱导帕金森病大鼠的异常旋转行为(P < 0.01)。磁共振成像动态观察移植细胞停留于移植原位，仅少数细胞向周围脑组织迁移。移植8周后，免疫荧光组织化学研究显示大多数中脑神经干细胞保持其未分化状态或分化为神经胶质细胞，仅少数细胞分化为多巴胺神经元。

目前对于体外诱导分化的多巴胺能神经元的生物学功能、体内存活状况，以及与胚胎中脑多巴胺能神经元移植治疗帕金森病大鼠的疗效比较方面尚缺乏深入的研究。研究显示神经干细胞诱导分化的多巴胺能神经元与胚胎中脑多巴胺能神经元移植治疗帕金森病大鼠具有相同的疗效^[40-41]。

神经干细胞可以作为外源性基因载体，提供所携带的靶基因的表达产物，对帕金森病进行基因治疗，移植后的神经干细胞可直接整合到神经通路，使治疗基因的表达受到微环境的调控，促进分化的神经细胞逐渐代替变性坏死的细胞。而且治疗的基因或分化的细胞不仅分布于神经干细胞周围，还可向远处迁徙，最终遍布于整个神经系统。韩志桐等^[42]建立帕金森病模型大鼠及体外培养神经干细胞，然后将绿色荧光蛋白转基因小鼠神经干细胞定向植入帕金森病大鼠毁损侧纹状体内，可见帕金森病大鼠的旋转行为明显改善。移植后2-4周时免疫组织化学染色方法检测到成片或散在的酪氨酸羟化酶免疫阳性细胞，说明绿色荧光蛋白转基因小鼠神经干细胞移植至帕金森病大鼠纹状体后，可分化为多巴胺能神经元并能改善旋转症状。张耀芬等^[43]证实酪氨酸羟化酶基因修饰的永生化神经干细胞细胞株可以在帕金森病大鼠纹状体内长时间安全存活并稳定表达酪氨酸羟化酶，显著增加内源性多巴胺及其代谢产物水平，有效改善模型大鼠帕金森病症状。周政等^[44]构建pN2ATH反转录病毒载体质粒，用PA317细胞包装，G418筛选阳性克隆，病毒上清感染神经干细胞，将神经干细胞和表达酪氨酸羟化酶的神经干细胞植入帕金森病大鼠纹状体内，移植2个月内，纹状体多巴胺和代谢产物含量增高，好于单纯神经干细胞移植组，为其脑内移植治疗帕金森病提供了理论基础。徐胜利等^[45]研究表明人胶质细胞源性神经营养因子基因修饰神经干细胞移植能有效改善损伤黑质-纹状体的多巴胺系统功能，胶质细胞源性神经营养因子基因治疗具有潜在的临床应用价值。刘卫国等^[46]用带有neurturin(NTN)基因的神经干细胞移植治疗帕金森病，显示出一定的治疗效果，然而，这种治疗作用主要和神经干细胞分泌的多种神经营养因子和移植后的细胞分化有关，neurturin(NTN)蛋白可以增强这种作用。田美玲等^[47]应用脑立体定位技术构建单侧帕金森病大鼠模型，然后将转染核受体相关因子1(Nurr1)基因的神经干细胞移植至帕金森病大鼠纹状体，结果可见重组质粒转染后Nurr1基因能在神经干细胞中过表达，移植后帕金森病大鼠的旋转圈数从第6周开始下降，移植区DIL/TH双标神经元每视野达(9.28±1.09)个，说明Nurr1基因过表达能诱导神经干细胞在帕金森病大鼠纹状体内分化为TH阳性的多巴胺能神经元，并在一定程度上改善大鼠的行为功能。

有关人神经干细胞的分离及体外扩增尚无成熟经验，本研究从人类胎脑神经干细胞体外扩增和分化入手，胚胎12周龄培养的神经干细胞可在体外稳定扩增，并且具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力，有希望成为神经细胞移植的理想供体来源。

目前临床应用扩增的神经干细胞治疗神经系统疾病仍在探索阶段。田增民等^[48]将5-11周人胚胎的前脑细胞在体外稳定扩增，并向多巴胺神经元转化，通过立体定向手术将其植入帕金森病患者的纹状体，结果显示人胚胎前脑细胞可在体外扩增并维持不分化状态1年以上，扩增的细胞可达原始细胞数量的1×10⁷倍，并可向多巴胺能神经元转化；帕金森病患者临床移植手术后随访8-30个月(平均24个月)，有效率为92%，未见明显的免疫排斥反应，说明应用体外长期扩增的人类神经干细胞移植治疗帕金森病是可行和有效的。陈涛等^[49]借助立体定向技术将原代培养的神经干细胞(1×10⁷/0.25 mL)缓慢注入临床确诊的12例帕金森病患者的尾状核头，移植前给予轻度热凝毁损。结果帕金森病患者移植后3个月临床症状的改善率为75%，移植后6个月改善率为83.3%。所有患者随访12-24个月，平均18个月，改善率达75%，说明应用体外扩增的神经干细胞可以安全、有效地治疗帕金森病，但远期疗效需进一步观察。作者报道的30例帕金森病患者移植治疗无明显并发症，表明该疗法安全有效，通过随访发现神经干细胞移植能有效控制帕金森病病理进程、恢复受损脑功能，改善患者的神经功能。作者将进一步进行大样本多中心随机对照试验进一步验证疗效及相关影响因素，长期随访进一步评估神经干细胞移植治疗帕金森病的有效性和安全性，制定综合方案、探索移植最佳细胞数量、移植次数、疗程等，进一步进行高效诱导分化，开展多巴胺能神经元临床应用研究。