退行性变椎间盘组织转化生长因子β1基因的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.24.018

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (24): 4495-4501.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.24.018

• 组织构建与生物活性因子 tissue construction and bioactive factors • 上一篇下一篇

退行性变椎间盘组织转化生长因子β1基因的表达

戴启宇，杨廷桐，于芳芳，王全志，王媛，张小双

解放军第371中心医院，河南省新乡市 453000

收稿日期:2012-10-25 修回日期:2012-11-21 出版日期:2013-06-11 发布日期:2013-06-11
通讯作者: 杨廷桐，教授，硕士研究生导师，解放军第371中心医院，河南省新乡市 453000 yangtt@xxmu.edu.cn
作者简介:戴启宇，男，1954年生，河南省信阳市人，汉族，1979年解放军第三军医大学毕业，硕士研究生导师，主任，主任技师，主要从事临床生物化学、分子生物学研究。 DQY716@sohu.com

Transforming growth factor-beta 1 expression in the degenerative intervertebral disc

Dai Qi-yu, Yang Ting-tong, Yu Fang-fang, Wang Quan-zhi, Wang Yuan, Zhang Xiao-shuang

The 371 Central Hospital of PLA, Xinxiang 453000, Henan Province, China

Received:2012-10-25 Revised:2012-11-21 Online:2013-06-11 Published:2013-06-11
Contact: Yang Ting-tong, Professor, Master’s supervisor, the 371 Central Hospital of PLA, Xinxiang 453000, Henan Province, China yangtt@xxmu.edu.cn
About author:Dai Qi-yu, Master’s supervisor, Chief technician, the 371 Central Hospital of PLA, Xinxiang 453000, Henan Province, China DQY716@sohu.com

摘要/Abstract

摘要：

背景：据报道，转化生长因子β1能促进椎间盘细胞的增殖与分化，并参与其损伤修复过程。但转化生长因子β1是否参与椎间盘退变的过程？
目的：分析在人体退行性变椎间盘组织中转化生长因子β1的表达情况，并探讨其与人体椎间盘退行性变的关系。
方法：收集正常椎间盘组织30例，退行性变人体椎间盘组织530例，采用苏木精-伊红染色、免疫印迹和RT-PCR方法进行研究，对退行性变的椎间盘组织进行病理学分型，分别检测转化生长因子β1在不同类型退变的椎间盘中表达的情况并与正常椎间盘组织进行对比分析。
结果与结论：苏木精-伊红染色病理学诊断：将退行性变的椎间盘组织根据病理学改变程度分为4型。免疫印迹法和RT-PCR法均显示：在正常和退变椎间盘组织中，转化生长因子β1均有表达，但在病变组织中随病变加重转化生长因子β1表达量随之增加，退变组织与正常组织比较差异有非常显著性意义 (P < 0.01)。说明转化生长因子β1高表达与人体椎间盘退行性变呈正相关。

关键词: 组织构建, 组织构建与生物活性因子, 椎间盘退行性变, 转化生长因子β1, 髓核细胞, 信号途径, 椎间盘组织, 椎间盘修复, 基因表达, 基因治疗, 病理形态学

Abstract:

BACKGROUND: Transforming growth factor-β1 can promote the proliferation and differentiation of intervertebral disc cells, and participate in the repair process after injury. However, whether transforming growth factor-β1 is involved in the intervertebral disc degeneration remains unclear.
OBJECTIVE: To analyze the expression of transforming growth factor-β1 in the degenerative intervertebral disc tissues, and to study the correlation between transforming growth factor-β1 and intervertebral disc degeneration.
METHODS: Normal intervertebral disc tissues collected from 30 cases and degenerative intervertebral disc tissues collected from 530 cases were researched by hematoxylin-eosin staining, western blot assay and reverse transcription-polymerase chain reaction. The degenerative intervertebral disc tissues were classified in histopathology, and transforming growth factor-β1 expression in different intervertebral disc degeneration tissues was analyzed and compared with that in normal tissues.
RESULTS AND CONCLUSION: Pathological diagnose by hematoxylin-eosin staining showed that, degenerative intervertebral disc tissues were classified into 4 pathological grades. Western blot and reverse transcription-PCR showed positive expressions of transforming growth factor-β1 in both normal and degenerative intervertebral disc tissues, however, transforming growth factor-β1 expression levels increased as degenerative changes and showed significant differences between degenerative and normal tissues(P < 0.01). Overexpression of transforming growth factor-β1 is positively correlated with intervertebral disc degeneration in human.

Key words: tissue construction, tissue construction and bioactive factors, intervertebral disc degeneration, transforming growth factor-beta 1, nucleus pulposus cells, signal pathway, intervertebral disc tissue, intervertebral disc repair, gene expression, gene level, gene therapy, pathomorphology

中图分类号:

R318

戴启宇，杨廷桐，于芳芳，王全志，王媛，张小双. 退行性变椎间盘组织转化生长因子β1基因的表达[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(24): 4495-4501.

Dai Qi-yu, Yang Ting-tong, Yu Fang-fang, Wang Quan-zhi, Wang Yuan, Zhang Xiao-shuang. Transforming growth factor-beta 1 expression in the degenerative intervertebral disc[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(24): 4495-4501.

图/表（结果） 4

2.1 参与者或纳入样本数量分析 共收集椎间盘突出手术切除样本573例，在制片过程中由于蜡块处理不当26例，脱片17例，计43例被删除，最后纳入椎间盘突出530例为退变组。正常组中选取51例椎体爆裂性骨折患者椎间盘组织，不符合对照组标准的部分椎间盘组织被删除，最后选出镜下为正常椎间盘组织的30例作为对照组。实验过程中无脱失，均进入结果分析。

2.2 病理诊断与形态学分型 椎间盘退变病变Ⅰ型 120例，病理形态学特征：髓核细胞轻度变性、变大，部分细胞模糊，界限不清。椎间盘退变病变Ⅱ型160例，病理形态学特征：髓核细胞大部分空泡样变性，变大，少部分细胞崩解消失，细胞数目轻度减少。椎间盘退变病变Ⅲ型130例，病理形态学特征显示，髓核细胞大部分空泡变性及崩解，细胞模糊不清，少数细胞明显萎缩，细胞数目明显减少，见图1。椎间盘退变病变Ⅳ型120例，病理形态学特征：髓核细胞数目极度减少，间质内胶原纤维重度增生。正常对照组30例，病理形态学特征正常，髓核细胞与周围组织界限清楚，未见变性，见图2。

2.3 RT-PCR检测结果 RT-PCR检测各组椎间盘髓核细胞中转化生长因子β1基因的表达，结果显示：正常对照组中有表达，但在病变各组中转化生长因子β1的表达量随病变加重而增加，与正常对照组比较，差异有非常显著性意义(P < 0.01)，见表1，图3。

免疫印迹法检测各组椎间盘髓核细胞中转化生长因子β1蛋白的表达，结果显示：在正常组椎间盘髓核细胞中转化生长因子β1蛋白有表达，在退变组椎间盘髓核细胞中转化生长因子β1蛋白的表达量随退变的严重程度而增加，与正常对照组比较有非常显著性意义(P < 0.01)。

参考文献

[1] Gembun Y,Nakayama Y,Shirai Y,et al.Surgical results of lumbar disc herniation in the elderly.J Nippon Med Sch.2001; 68(1):50-53.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11180701

[2] Boos N,Weissbach S,Rohrbach H,et al.Classification of agerelated changes in lumbar intervertebral disca 2002 volvo Award in basic science.Spone.2002;27(2):2631-2644.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12461389

[3] Antoniou J,Pike GB,Steffen T,et al.Quantitative magnetic resonance imaging in the asseaament of degene rative disc disease.Magn Reson Med.1998;40(8):900-907.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9840835

[4] Ma L,Zwahlen RA,Zheng LW,et al.Influence of nicotine on the biological activity of rabbit osteoblasts.Clin Oral Implants Res. 2011;22(3):338-342.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21561475

[5] Kim IS,Song YM,Hwang SJ.Osteogenic reaponses of human mesenchymal stromal cell to static stretch.J Dent Res.2010; 89(10):1129-1134.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20639509

[6] Bettina K,Tao Y,Elda M,et al.Interraction of TGF-B and BMP signaling pathways during chondrogenesis.Plos One.2011; 6(1):1-9.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21297990

[7] Wang Y, Yu SY, Gao XJ, et al. Dongwuxue Zazhi. 2010;45(3): 127-132.王悦,俞诗源,高先军,等.Bax,TGF-B1和Ghrelin在饥饿后长耳鸪胃及小肠中的免疫组织化学[J].动物学杂志,2010,45(3): 127-132.http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTotal-GWSX200102002.htm

[8] Hu YG. Beijing: The Publishing House of People′s Health. 2004: 411.胡有谷.腰椎间盘突出症[M].第三版,北京:人民卫生出版社,2004: 411.

[9] Nomura T,Mochida J,Okuma M,et al.Nuclus pulposus allograft vetards intervertebral disc degeneration.Spine. 2001;38(1): 94-101.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11501830

[10] Yang H,wu J,Liu J et al.transplanted mesenchymal stem cells with pure fibrinous gelatin-transforming growth factor-betal decrease rabbit intervertebral disc degeneration.Spine J.2010; 10(9):802-810.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20655810

[11] Delamarter R, Zigler JE, Balderston RA, et al. Prospective, random- ized, multicenter Food and Drug Administration investigational device exemption study of the ProDisc-L total disc replacement compared with circumferential arthrodesis for the treatment of two-level lumbar degenerative disc disease: results at twenty-four months. J Bone Joint Surg (Am).2011;93(8):705-715.http://www.doc88.com/p-8095953936365.html

[12] Gao CH, Lv M, Yang C, et al. Jizhu Waike Zazhi. 2012;10(6): 371-373.高春华,吕明,杨诚,等. 椎间盘内注射转化生长因子-β1诱导椎间盘退变[J]. 脊柱外科杂志,2012,10(6):371-373.http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTotal-JZWK201206017.htm

[13] Li GF, Zhang SK, Fu CF, et al. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2009;13(2):359-362.李高峰,张绍昆,付长峰,等. 细胞因子及基因治疗椎间盘退行性变的研究动态[J]. 中国组织工程研究与临床康复,2009,13(2): 359-362.http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTotal-XDKF200902046.htm

[14] Yan JW, Li AG, CHen HH, et al. ZHonguo Jiaoxing Waike Zazhi. 2012;20(24):2268-2271.闫军伟,李爱国,陈鸿辉,等. 炎性细胞因子在椎间盘退变中的研究进展[J]. 中国矫形外科杂志,2012,20(24):2268-2271.http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTotal-ZJXS201224025.htm

[15] Bobick BE,Kulyk WM. Regulation of cartilage formation and maturation by mitogen-activated protein kinase signaling.Birth Defects Res C Embryo Today.2008;84(2):131-154.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18546337

[16] Guo Q, Jiang XF, Chen Y, et al. Zhongguo Zuzhi Huaxue ji Xibao Huaxue Zazhi. 2012;21(1): 69-73.郭琼,姜孝芳,陈艳,等.TGF-B1及其受体在大鼠整胚及软骨雏形发育过程中的表达[J].中国组织化学及细胞化学杂志,2012, 21(1): 69-73.http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTotal-GGZZ201201015.htm

[17] Mon SH,Nishida K,Gilbertson LG,et al.Biologicresponse of human intervertebral disc cells to gene therapy cocktail. Spine.2008;33(17):1850-1855.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18622355

[18] Hu BS, Xu XJ, Guo YL, et al. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2013;17(4):571-575.胡宝山,许喜筠,郭元利, 等. 各种腰椎间盘细胞可否自分泌产生白细胞介素1β[J]. 中国组织工程研究,2013,17(4):571-575.http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTotal-XDKF201304007.htm

[19] Cheng SQ, Chen GB, Liu YH, et al. Hebei Yixue. 2013;19(2): 270-272.成善泉,陈国邦,刘亿华,等. 椎间盘退变的形态学分型中转化生长因子-β1表达的临床意义[J]. 河北医学,2013,19(2):270-272.http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTotal-HCYX201302047.htm

[20] SinghKM,MasodaKM.ThonarE.et al.Agerelated charges in the wxtracellularmatrix ofnucleus pulposus and annulus fibrosus of human intervertebral disc.Spino.2009;34(1):10-16.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12193991

[21] Yang Y,He XF,Li YH,et al.Association of transforming growth facto-B1 with pathological grading of intervertebral disc degeneration.Article in Chinese.2012;32(6):897-900.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22699080

[22] Karamboulas K,Dranse HJ,Underhill TM.Regulation of BMP dependent chondrogenesis in early limb mesenchyme by TGF beta signals.Cell Sci.2010;123(12):2068-2076.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20501701

[23] Baldridqe D,Shchelochkov O,Kelley B,et al.Signaling pathways in human skeletal dysplasias.Annu Res Genomics Hum Genet.2010;2991(1):189-217.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20690819

[24] Song QX, Wu Y, Chen YZ.Zhongguo Yaoli Tongbao.2011; 27(3):378-382.宋清晓,吴勇,陈元仲.CD44抗体H144a对急性髓系白血病学报株HL-60细胞体外增值分化作用的研究[J].中国药理通报,2011, 27(3):378-382.http://www.doc88.com/p-605272455634.html

[25] Heldin CH,Landstrom M,Moustakas A.Mechanism of TGF-beta signaling t growth arrest apoptosis and epithelial-mesenchymal transtion.Curr Opin Cell Biol.2009; 21(2):166-176.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19237272

[26] Li J, Yang SH, Zhao ZW.Zhongguo Linchuang Kangfu.2003; 7(14):2079-2080.李进,杨述华,沼增务.细胞因子与椎间盘退行性变的关系[J].中国临床康复,2003,7(14):2079-2080.http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTotal-XDKF200314048.htm

[27] Cui D,Zhang S,Ma J,et al.Short in terfering RNA targetting NF-kappa B induces apoptosis of hepatic stellate cells and attenuates extracellular matrix produetion.Dig Liver Dis. 2010;42(11):813-817.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20409762

[28] Sing KM,Masuda KM,Thonar E,et al.Age-related changes in the extracellular matrix of nucleus pulposus and anulus fibrosus of human intervertebral disc.J Spine 2009;1(34): 10-16.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19127156

[29] Xu JW,Zhong YM,Ji J,et al.Associations of transforming growth factor beta 1-509c/T site gene polymorphism with blood stasis syndrome of lumbar intervertebral dise protrusion and intervertebral dusc degeneration.J Clin Rehabil Tissue Eng Res.2010;24(21):4524-4527.http://d.wanfangdata.com.cn/Periodical_xdkf201024040.aspx

[30] Lin W, Wang WM, Zhuang YF, et al. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2009;13(37): 7309-7313.林旺,王万明,庄颜峰,等.胰岛素样生长因子1,血血小板源性生长因子,转化生长因子β1对人退变纤维环细胞生物活性的影响[J].中国组织工程研究与临床康复,2009,13(37):7309-7313.http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTotal-XDKF200937032.htm

[31] Xu JW,Zhong YM,Ji J,et al.Associations of transforming growth factor bata1-509C/T site gene polymorphism with blood stasis syndrome of lumbar intervertebral disc protrusion and intervertebral disc degeneration. J Clin Rehabil Tissue Eng Res.2010;24(12):4524-4527.http://d.wanfangdata.com.cn/Periodical_xdkf201024040.aspx

[32] Abbott RD,Purmessur D,Monsey RD,et al.Regenerative potential of TGF-B+Dex and notochordal cell conditioned media on degenerated human intervertebral disc cell.Jorthop Res.2012;30(3):482-488.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21866573

[33] Hegewald AA,Endres M,Abbushi A,et al.Adequacy of herniated disc tissue as cell source for nucleus pulposu reqeneration. J Neurosurg Spine.2011;14(2):273-280.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21214312

[34] Liu Y,Li JM,Hu YG.Transplantation of gene modified nucleus pulposus cells reverses rabbit intervertebral disc degeneration.Chin Med J (ENG1).2011;124(16):2431-2437http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21933582

[35] He B, Yang J, Peng FL, et al.Xibao yu Fenzi Mianyixue Zazhi, 2012; 28(2):197-199.何斌,杨坚,彭方亮,等.退变髓核细胞与正常髓核细胞体外培养的生物学特性比较[J].细胞与分子免疫学杂志,2012,28(2): 197-199.http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-XBFM201202028.htm

[36] Serigan K,Sakai D,Hiyama A,et al.Effector cell number on mesenchymal stem cell transplantatin in a canine disc degenration mode.Orthop Res.2010;28(10):1267-1275.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20839317

[37] Gerald W.Apoptotic and non-apoptotic programmed cardiomyocyte death in ventricular remodelling.Cardiovasc Res.2009;81(3):465-473.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18779231

[38] Feng G,Zhao X,Liu H,et al.Transplantation of masenchymal stem cells and nucleus pulposus cells in a degenerative disc model in rabbits:a comparison of cell types as potential candidates for disc regeneration.J Neurosurg Spine. 2011; 14(3):322-329.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21250814

[39] Gerald W. Apoptotic and non-apoptotic programmed cardiomyocyte death in ventricular remodelling.Cardiovasc Res.2009;81(3):465-473.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18779231

[40] Shi YY, Dong X, Shi YH, et al. Zhongguo Bingli Shengli Zazhi. 2009;25(4):802-805.石永英,董颀,石永华,等.TGF-β1对体外培养的大鼠心肌细胞肥大和凋亡的影响[J].中国病理生理杂志,2009,25(4):802-805.http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTotal-ZBLS200904047.htm

[41] Dobaczewski M,Chen W,Frangogiannis NG. Transforming growth factor (TGF)-B signaling in cardiac remodeling.J Mol Cell Cardiol.2011;51(4):600-606.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22505689

引言

材料方法

设计：对比观察。

时间及地点：于2009年1月至2011年12月在解放军第371中心医院骨科中心完成。

对象：纳入送检的腰椎间盘突出症手术切除样本530例设为退变组，男340例，女190例，年龄35-78岁，平均53.5岁；另外，取椎体爆裂性骨折患者椎间盘组织30例作为正常对照组，男20例，女10例，年龄19-41岁，平均30岁。

腰椎间盘突出症诊断标准^[8]：①有腰部外伤、慢性劳损或受寒湿史。大部分患者在发病前有慢性腰痛史。②常发生于青壮年。③腰痛向臀部及下肢放射，腹压增加(如咳嗽、喷嚏)时疼痛加重。④脊柱侧弯，腰生理弧度消失，病变部位椎旁有压痛，并向下肢放射，腰活动受限。⑤下肢受累神经支配区有感觉过敏或迟钝，病程长者可出现肌肉萎缩直腿抬高或加强试验阳性，膝、跟腱反射减弱或消失，拇趾背伸力减弱。⑥X射线摄片检查：脊柱侧弯，腰生理前凸消失，相邻边缘有骨赘增生。CT、MRI检查可显示椎间盘突出的部位及程度。

纳入标准：对照组：取椎体爆裂性骨折患者椎间盘组织30例，镜下证实为正常的椎间盘组织，作为正常对照。退变组：①临床诊断为腰椎间盘突出症。②术后病理学证实为退行性变的腰椎间盘组织。③术前患者均未行放、化疗及免疫治疗，所有手术均采用腰椎后路标准术式获取的椎间盘组织。

排除标准：①椎体爆裂性骨折患者椎间盘组织在显微镜下有挤压、变性、破坏及结构不清的。②与年龄有关的退变椎间盘组织。③病理性的椎间盘组织。④不符合椎间盘突出症诊断标准的等。

材料：转化生长因子β1试剂盒(invitrcgen公司，美国)，RT-PCR引物由上海生物工程技术有限公司合成：

转化生长因子β1(282 bp)：

上游引物：5’-CAT CTA CAA CAG CAC CAG GT-3’。下游引物：5’-GAA ACA TCA AAA TCG GAC AG-3’。

β-actin(168 bp)：

上游引物：5’-GTT GGG CTA ATC CAT-3’。下游引物：5’-CAA TGC TAA TGG AAT-3’。

方法：

苏木精-伊红染色：病理取材，进入自动脱水机中脱水，石蜡包埋，采用莱卡2245型半自动切片机进行石蜡切片，片厚4 μm，用于苏木精-伊红染色：切片在二甲苯中脱蜡，梯度乙醇入水，苏木精染3 min，分化，伊红染3 min，梯度乙醇脱水，树胶封固，在OlympusBX61型显微镜下由两位专家进行病理学诊断，根据病理学改变程度将退变椎间盘组织分为Ⅳ型。

分级标准：根据参考文献[9]并加以改良，将退变椎间盘组织分为IV型，分型标准见结果病理诊断与形态学分型。

RT-PCR检测：取正常组及退变组椎间盘组织，采用Trizol法提取总RNA，应用MBI Fementas公司反转录试剂盒，按说明书进行mRNA反转录，取2 µL cDNA模版加入20 pmol引物配制成25 µL反应体系，在TaqDNA聚合酶催化下，进行转化生长因子β1基因聚合酶反应，反转录条件42 ℃ 30 min，99 ℃ 5 min，58 ℃ 5 min。PCR体系总体积为20 µL，反应条件为94 ℃，预变性5 min 94 ℃变性30 s，50 ℃退火30 min，72 ℃延伸1 min。 30个循环。72 ℃延伸7 min。提取5 µL PCR产物，经2%琼脂糖凝胶电泳40 min，溴化乙锭染色，用lmage Master VDS图像分析软件处理系统进行扫描，以转化生长因子β1/β-actin cDNA光密度值做为转化生长因子β1 mRNA的相对表达水平。

Western blot分析：取正常组及退变组适量椎间盘组织，提取总蛋白，用Bradford法测定蛋白含量。取50 μg总蛋白变性5 min后进行SDS-PAGE电泳，分离后的蛋白10 V恒压35 min转移至硝酸纤维素膜(NC膜)。5%脱脂奶粉室温封闭2 h，用含0.05%Tween-20的Tris缓冲液(TBST)洗涤NC膜3次，加入1∶150稀释的转化生长因子β1特异抗体，4 ℃过夜，TBST洗膜后加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(1∶1 000稀释)，室温2 h，洗膜后加入化学发光(electrochem-iluminescence, ECL)试剂显色曝光。以β-actin作为上样量的内参照，用相对吸光度值(目的基因条带吸光度值/β-actin条带吸光度值)表示转化生长因子β1蛋白的相对表达强度。转化生长因子β1在相对分子质量23 000处出现特异性条带，β-actin在42 000处显影，这与实验预先的设计相一致。

统计学分析：应用SPSS 13.0统计软件进行数据处理，各组数据均采用x(_)±s表示，采用卡方检验；标准均数间比较，采用独立样本t 检验及spearman相关分析法进行统计分析，以P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

椎间盘退变是椎间盘突出的发病学基础，髓核中的基因改变是椎间盘退变形成的关键。人体椎间盘退行性变的发病率随年龄增长而增高^[10]。临床上椎间盘的突出常引起颈肩腰腿疼痛为主要表现的临床症候群，目前临床上的各种治疗方法只能改善临床症状，难以从根本上减缓和终止椎间盘退变的进程。另外，临床上对椎间盘退变的诊断往往通过影像学来判断其退变的程度，这为临床对该病的诊疗起到积极作用，但影像学的分类有时与病理形态学变化不尽相同，因此，病理形态学的改变更能直接客观的反映出椎间盘退行性变的实际情况，通过病理形态学变化进行分型研究其退变的基因改变，为临床防治椎间盘退变和可能的基因治疗奠定理论基础^[11]。

近年来研究显示，退行性变的椎间盘组织中有多种细胞因子，如白细胞介素1，6，8，肿瘤坏死因子、转化生长因子β以及成纤维细胞生长因子等，这些细胞因子在椎间盘退行性变的病理过程中可能发挥着重要的调控作用^[12]。李高峰等^[13]认为椎间盘退行性变主要是由于各种原因导致的细胞因子减少、致炎因子增多并降解细胞外基质，细胞赖以生存的环境被破坏，从而导致椎间盘退行性变。椎间盘为一免疫豁免部位，为椎间盘的细胞因子及其基因治疗提供了有利条件。多种细胞因子及其转导入椎间盘的基因可以不同程度的促进细胞外基质合成，从而延缓或逆转椎间盘退行性变。闫军伟等^[14]总结了炎性细胞因子在椎间盘退变中的作用，退变的椎间盘组织能产生炎症递质，提示了椎间盘的退变与其局部的炎症反应及炎性细胞因子有关。在椎间盘退变中，炎性细胞因子的存在是疾病的原因还是结果，目前还不清楚。最有可能的解释是炎性细胞因子可能是通过自分泌或旁分泌的方式作用于椎间盘细胞，通过改变其生物学行为和(或)产生病理效应，从而参与椎间盘的退变，而退变的椎间盘细胞生物学行为改变后，可产生各种炎性细胞因子诱导并引起椎间盘突出。

转化生长因子β1与软骨细胞的发育成熟密切相关，同时能够维持软骨细胞处于未分化状态^[15-16]，因此转化生长因子β1在组织细胞的损伤修复过程中显示出积极地作用^[17]。但在椎间盘退变的过程中它到底起什么样的作用，与其退变的关系如何，尚未见明确报道。胡宝山等^[18]检测各种腰椎间盘细胞能否自分泌产生白细胞介素1β，分离培养兔腰椎间盘的各种细胞，对培养的细胞进行鉴定，用Fn120的纤维粘连蛋白碎片进行细胞诱导，同时以PBS作为对照。成善泉等^[19]观察了腰椎间盘退变的形态学分型中转化生长因子β1表达特点，实验结果显示研究组病变组织转化生长因子β1表达为(+)的比例明显高于对照组，说明研究组患者椎间盘细胞组织中转化生长因子β1表达较高，差异有显著性意义(P < 0.05)。实验认为可以将转化生长因子β1的表达情况作为一种临床检测与诊断椎间盘退化的生物学指标，并配合MRI的临床诊断，从而提高检出率和诊断准确性。

实验结果表明经Fn120的纤维粘连蛋白碎片诱导的实验组椎间盘软骨细胞、纤维环细胞均能产生白细胞介素1β，说明明椎间盘软骨终板细胞、纤维环细胞均能自分泌产生白细胞介素1β。实验在病理形态学分型的基础上，采用苏木精-伊红染色诊断、免疫印迹、RT-PCR等检测技术，研究各型病变组织中转化生长因子β1蛋白和基因的表达情况。研究发现：免疫印迹和RT-PCR技术检测的结果基本一致，正常椎间盘组织中有少量的转化生长因子β1表达，当椎间盘发生退变时转化生长因子β1表达量逐渐增加，这种变化属于反应性的增加，在退变早期对于椎间盘修复起到一定的积极作用，但随着椎间盘退变程度的加重，髓核细胞的坏死、消亡增多时，转化生长因子β1则可能起到加速椎间盘退变的作用，这与Singh等^[20-21]的研究结果基本一致。转化生长因子β1的这种促进与抑制的双重作用，何时何种作用占优势取决于细胞类型，转化生长因子β1信号通路部件浓度以及与转化生长因子β1信号途径相互作用的其他信号途径，起源不同的组织结构中，转化生长因子β1和它的受体执行着不同的生物学功能，一方面依赖分泌水平高低，另一方面受体的分布表达对其功能发挥也起着重要作用^[22-23]。宋清晓等^[24]的研究也发现抑制转化生长因子β1则细胞凋亡的数目明显减少。转化生长因子β1 不仅可以抑制上皮细胞的生长，而且可诱导细胞的凋亡^[25-26]。由此可见，转化生长因子β1具有双重的效应^[27]，在椎间盘退变早期可促进细胞外基质合成，对椎间盘起到修复和保护作用。而在退变的中晚期，随着病变的加重转化生长因子β1含量增加，可诱导髓核细胞的凋亡，并且转化生长因子β1基因位点的多态性的堆积增加了椎间盘退变的风险性，加速了椎间盘退行性变的进程^[28-29]。推测：转化生长因子β1在蛋白与基因水平上对椎间盘的退行性变进行调控，与椎间盘的退行性变有一定的内在联系。林旺等^[30]研究也支持这种观点。

实验从蛋白和基因水平对退行性变椎间盘各型组织细胞中的转化生长因子β1进行分析，更直接、更客观的反映了转化生长因子β1的表达与椎间盘退行性变的关系。发现退行性变椎间盘组织中转化生长因子β1的表达水平随病理形态学分型程度增大而表达量逐渐增高，认为转化生长因子β1含量的增加可能是引起椎间盘退变的重要原因之一^[31]。实验结果也为临床防治椎间盘退变开阔了新的思路：临床上可通过介入基因治疗^[32-35]，进而调控转化生长因子β1含量，提升髓核细胞的代谢功能，达到延缓椎间盘退行性变的目的^[36-38]。

有研究显示：转化生长因子β1可以导致心肌细胞的凋亡^[39-41]，实验也发现转化生长因子β1的表达与椎间盘退行性变程度呈正相关。推测转化生长因子β1增高引起的椎间盘退行性变的机制是否与其导致心肌细胞凋亡的机制一致? 转化生长因子β1在人体椎间盘退变中的高表达是否就是导致椎间盘退变的真正原因？以及转化生长因子β1所介导的相关信号传导途径在椎间盘退变发生发展中的分子机制？这将在以后的研究中进行重点研究。

退行性变椎间盘组织转化生长因子β1基因的表达

Transforming growth factor-beta 1 expression in the degenerative intervertebral disc

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 4

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	刘志超, 张帆, 孙旗, 康晓乐, 袁巧妹, 柳根哲, 陈江. 不同静水压下人椎间盘髓核细胞的形态和活性[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1172-1176.
[2]	付远飞, 何升华, 赖居易, 孙志涛, 冯华龙, 蓝志明. 地龙提取物抑制核因子κB信号通路延缓椎间盘髓核细胞的退变[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(2): 264-268.
[3]	马笃军, 彭力平, 陈锋, 蒋顺琬, 姜劲挺, 高坤, 林展鹏. 基因编辑技术在骨关节炎基因治疗中的作用与意义[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(2): 298-303.
[4]	张凯, 张晓勃, 施锦涛, 王克平, 周海宇. 间充质干细胞治疗椎间盘退行性疾病：基于Web of Science数据库的文献计量及可视化分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(19): 3031-3038.
[5]	黎少, 梁永康, 高毅, 彭青. 三维胶原HepaRG微球的建立及其体外功能特征[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(16): 2541-2547.
[6]	何升华, 付远飞, 蓝志明, 孙志涛, 赖居易, 冯华龙, 郭子宾, 李盖. 腰突颗粒通过调控miR-221表达干预髓核细胞的增殖与凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(14): 2177-2182.
[7]	刘志刚, 郭庆功, 陈景涛. 刺山柑总生物碱干预椎间盘退变模型大鼠髓核细胞的增殖与凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(11): 1699-1704.
[8]	许国峰, 李学斌, 唐一钒, 赵寅, 周盛源, 陈雄生, 贾连顺. 人黄韧带细胞骨化发生过程中的自噬[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1174-1181.
[9]	陈江, 肖辉灯, 孙旗, 张帆, 祝永刚, 刘志超, 郭菲宇, 柳根哲. 人椎间盘髓核细胞增殖活性与益肾活血通络方的干预调控[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1200-1206.
[10]	周玉, 龙小安, 李宁, 王纯. 有限元法分析髌腱炎状态时的生物力学变化[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1280-1286.
[11]	周航宇, 曾富海, 夏德林. 硅酸盐基-Cu/Mg生物活性陶瓷促进成骨细胞的成骨性能[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(28): 4511-4517.
[12]	胡中岭, 李彬彬, 崔逸爽, 王茜, 张辉, 李琪佳, 王志强. 基因治疗骨关节炎的概念、机制及问题[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(27): 4356-4363.
[13]	尹逊路, 朱立国, 冯敏山, 于杰, 展嘉文, 梁龙, 韩涛. 持续负载压力对髓核细胞凋亡及Wnt/β-catenin信号通路的影响 [J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(26): 4125-4128.
[14]	周文明, 林一峰, 张震, 迟利业. 补肾壮督方含药血清对髓核细胞线粒体凋亡通路的影响[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(23): 3643-3648.
[15]	谢明忠, 李森, 朱凯, 姜铧财, 戚力升. 衰老髓核细胞中环状RNA浆细胞瘤转化迁移基因1的表达及调控机制[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(17): 2718-2723.