人胎盘间充质干细胞促进血管生成

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.23.006

摘要/Abstract

摘要：

背景：构建组织工程化骨组织的同时，促进种子细胞与材料复合物内血液供应的重建成为研究的关键。胎盘间充质干细胞可以作为骨组织工程研究的种子细胞，研究其分化为血管内皮细胞以及促进血管生成有着重要意义。
目的：观察胎盘间充质干细胞在体外分化为血管内皮细胞以及体内促血管生成作用。
方法：分离培养人胎盘间充质干细胞，鉴定其表面抗原，经血管内皮生长因子和人碱性成纤维细胞生长因子联合体外诱导胎盘来源间充质干细胞向血管内皮细胞定向分化，诱导后细胞通过内皮细胞标志物KDR、v-WF染色鉴定。8只新西兰大白兔制成桡骨中段1.5 cm长的骨缺损模型，分别植入人胎盘间充质干细胞/丝素蛋白/羟基磷灰石和丝素蛋白/羟基磷灰石进行对照。植入后4，12周分别行大体观察、组织学观察和X射线观察，比较骨缺损修复以及血管生成情况。
结果与结论：胎盘间充质干细胞的诱导分化形态明显改变，胞体逐步回缩，立体感增强，内皮细胞标志物KDR、v-WF染色结果阳性。胎盘来源间充质干细胞与丝素蛋白/羟基磷灰石材料复合培养植入后，4周时新骨已开始形成，12周时有部分新生骨组织形成板层骨，骨小梁形成，内可见新生血管形成，而对照组支架材料降解较慢，未见新生血管。说明胎盘来源间充质干细胞体外可以分化为血管内皮细胞，与丝素蛋白/羟基磷灰石材料联合移植能够促进移植物内血管生成，较好的修复骨缺损。

关键词: 干细胞, 干细胞培养与分化, 胎盘间充质干细胞, 丝素蛋白, 羟基磷灰石, 骨缺损, 血管内皮细胞, 血管生成, 支架材料, 桡骨中段, 血管再生, 组织工程, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: The blood supply in seed cells and material compounds is the important issue in the construction of tissue engineered bone tissue. Placental mesenchymal stem cells are the potential seed cells in tissue engineering research, and it is of significance to study its differentiation into vascular endothelial cells as well as promotion of angiogenesis.
OBJECTIVE: To explore the effects of placental mesenchymal stem cells differentiating into vascular endothelial cells in vitro and promoting angiogenesis in vivo.
METHODS: Human placental mesenchymal stem cells were isolated and cultured. After the cell surface antigens were identified, the placental mesenchymal stem cells were induced with vascular endothelial growth factor and human basic fibroblast growth factor to differentiate into vascular endothelial cells in vitro. Then immunofluorescence staining for endothelial-specific markers KDR and the von Will brand factor were used to characterize the cells after induction. Eight healthy adult New Zealand rabbits were prepared for 1.5-cm defect models in the middle segment of radius. Then the models were implanted with human placental mesenchymal stem cells/silk fibroin/hydroxyapatite while those implanted with silk fibroin/hydroxyapatite were taken as the controls. At weeks 4 and 12 after operation, gross observation, histological observation and X-ray examination of implanted bone were performed to evaluate bone defects healing and angiogenesis.
RESULTS AND CONCLUSION: The morphology of induced placental mesenchymal stem cells was obviously changed, showing cell body contraction and enhanced stereognosis. Immunofluorescence staining analysis showed a positivity for endothelial-specific markers KDR and the von Will brand factor. After the human placental mesenchymal stem cells were cultured with silk fibroin/hydroxyapatite compound, new bone formation was visible at 4 weeks, and lamellar bone formed, trabeculation and neovascularization were detected at 12 weeks after implantation. While scaffold materials degraded gradually and no neovascularization was observed in the control group. Experimental findings indicate that, placental mesenchymal stem cells can differentiate into vascular endothelial cells in vitro, and combined transplantation with silk fibroin/hydroxyapatite can promote angiogenesis and repair bone defects.

Key words: stem cells, stem cell culture and differentiation, placental mesenchymal stem cells, silk fibroin, hydroxyapatite, bone defects, vascular endothelial cells, angiogenesis, scaffold, middle radius, vasc ular regeneration, tissue engineering, stem cell photographs-containing paper

中图分类号:

R394.2

赵基栋，苗宗宁，钱寒光，彭玮，司志平. 人胎盘间充质干细胞促进血管生成[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(23): 4216-4233.

Zhao Ji-dong, Miao Zong-ning, Qian Han-guang, Peng Wei, Si Zhi-ping. Human placental mesenchymal stem cells promote angiogenesis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(23): 4216-4233.

图/表（结果） 3

2.1 胎盘来源间充质干细胞体外培养 原代分离的细胞经过4 h左右体外培养后，有少量细胞贴壁。约7 d后细胞生长速度加快，呈克隆样生长，细胞呈不规则鳞片状，胞体大且细胞核居中，见图1。传代培养的细胞不再以集落方式生长，而是呈现比较均一的梭形，见图2。

2.2 胎盘来源间充质干细胞向内皮细胞诱导及免疫荧光染色结果 诱导培养的细胞形态逐渐变化，呈短梭形或扁圆形。免疫荧光染色结果显示，内皮细胞标志物KDR以及v-WF染色结果不同程度阳性，见图3，4。

2.3 胎盘来源间充质干细胞联合丝素蛋白/羟基磷灰石材料修复兔桡骨缺损结果
实验动物大体形态观察：所有实验兔子全部进入结果分析。造模后3 d内，有轻微跛行，活动明显减少，但情况逐渐好转，10 d左右饮食和精神正常化，伤口一期愈合，无感染、渗液。
组织学检测：实验组造模后4周时支架内可见部分松散骨基质形成，骨细胞包埋其中，支架吸收降解不明显；12周时可见骨小梁排列规则，骨细胞深埋于骨基质中，大量血管结构出现，骨结构成熟，板层状皮质骨形成，支架组织更为松散，部分降解吸收，见图5。对照组造模后4周时支架内可见大量纤维性软组织充填其中，未见软骨基质及类骨质，支架无明显降解改变；12周时支架组织孔隙内可见少量散在软骨基质，无骨结构形成，支架本身可见部分降解吸收现象，见图6。
2.4 不良反应 实验组造模后2周时支架材料孔隙内有少量纤维结缔组织、血管和炎性细胞聚集，材料与骨端未有连接，4周时支架材料部分吸收。对照组造模后2周，可见少量纤维组织长入支架空隙内，未发现明显炎症细胞浸润；4周时支架材料少量吸收，所有实验动物未见明显炎症反应，材料与组织相容性良好。

参考文献

[1]Rose FR,Oreffo RO. Bone tissue engineering: hope vs hype. Biochem Biophys Res Commun. 2002;292(1):1-7.

[2]Bhumiratana S, Vunjak-Novakovic G. Concise review: personalized human bone grafts for reconstructing head and face. Stem Cells Transl Med. 2012;1(1):64-69.

[3]Ogawa M, Tohma Y, Ohgushi H, et al. Early Fixation of Cobalt-Chromium Based Alloy Surgical Implants to Bone Using a Tissue-engineering Approach. Int J Mol Sci. 2012; 13(5):5528-5541.

[4]Panseri S, Cunha C, D'Alessandro T et al. Magnetic hydroxyapatite bone substitutes to enhance tissue regeneration: evaluation in vitro using osteoblast-like cells and in vivo in a bone defect. PLoS One. 2012;7(6):e38710.

[5]Marolt D, Campos IM, Bhumiratana S et al. Engineering bone tissue from human embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2012; 109(22):8705-8709.

[6]Zhou J, Lin H, Fang T, et al. The repair of large segmental bone defects in the rabbit with vascularized tissue engineered bone. Biomaterials. 2010;31(6):1171-1179.

[7]Laschke MW, Strohe A, Menger MD, et al. In vitro and in vivo evaluation of a novel nanosize hydroxyapatite particles/poly (ester-urethane) composite scaffold for bone tissue engineering. Acta Biomater. 2010;6(6):2020-2027.

[8]Semenov OV, Koestenbauer S, Riegel M, et al. Multipotent mesenchymal stem cells from human placenta: critical parameters for isolation and maintenance of stemness after isolation. Am J Obstet Gynecol. 2010;202(2):193.

[9]Parolini O, Alviano F, Bagnara GP, et al. Isolation and characterization of cells from human term placenta: outcome of the first international workshop on placenta derived stem cells. Stem Cells. 2008;26(1):300-311.

[10]Vellasamy S, Sandrasaigaran P, Vidyadaran S, et al. Isolation and characterisation of mesenchymal stem cells derived from human placenta tissue. World J Stem Cells. 2012;4(6):53-61.

[11]Zheng L, Zhang D, Chen X, et al. Antitumor activities of human placenta-derived mesenchymal stem cells expressing endostatin on ovarian cancer. PLoS One. 2012;7(7):e39119.

[12]Li X, Ling W, Pennisi A et al. Human placenta-derived adherent cells prevent bone loss, stimulate bone formation, and suppress growth of multiple myeloma in bone. Stem Cells. 2011;29(2):263-273.

[13]Pasquinelli G, Tazzari P, Ricci F, et al. Ultrastructural characteristics of human mesenchymal stromal (stem) cells derived from bone marrow and term placenta. Ultrastruct Pathol. 2007 ;31(1):23-31.

[14]Miao Z, Jin J, Chen L, et al. Isolation of mesenchymal stem cells from human placenta: comparison with human bone marrow mesenchymal stem cells. Cell Biol Int. 2006;30(9): 681-687.

[15]Qian HG, Miao ZN, Zhao JD, et al. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2010;14(51):9507-9511. 钱寒光,苗宗宁,赵基栋,等.丝素蛋白/羟基磷灰石材料复合人胎盘间充质干细胞修复桡骨节段性骨缺损[J].中国组织工程研究与临床康复,2010,14(51):9507-9511.

[16]Zhang ZY, Teoh SH, Chong MS, et al. Superior osteogenic capacity for bone tissue engineering of fetal compared with perinatal and adult mesenchymal stem cells. Stem Cells. 2009;27(1):126-137.

[17]Porter JR, Ruckh TT, Popat KC. Bone tissue engineering: a review in bone biomimetics and drug delivery strategies. Biotechnol Prog. 2009;25(6):1539-1560.

[18]Zhong W, Sumita Y, Ohba S, et al. In vivo comparison of the bone regeneration capability of human bone marrow concentrates vs. platelet-rich plasma. PLoS One. 2012; 7(7):e40833.

[19]Mandal BB, Grinberg A, Gil ES, et al. High-strength silk protein scaffolds for bone repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 2012;109(20):7699-7704.

[20]Holzwarth JM, Ma PX. Biomimetic nanofibrous scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials. 2011 Dec;32(36): 9622-9629.

[21]Lv J, Wang PJ. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2011;15(21):3929-3933. 吕军,王培吉. 血管内皮生长因子复合人工骨材料修复骨缺损[J]. 中国组织工程研究与临床康复,2011,15(21):3929-3933.

[22]Yang XM, Zhang L, Meng XY, et al. Zhongguo Xiufu Chongjian Waike Zazhi. 2011;25(6):729-735.杨新明,张磊,孟宪勇,等. 比较带蒂筋膜瓣包裹接种自体红骨髓的组织工程骨修复骨缺损时促血管化成骨与膜诱导成骨作用[J]. 中国修复重建外科杂志,2011,25(6): 729-735.

[23]Duan CG. Disi Junyi Daxue. 2009.段春光.双基因修饰促进组织工程化人工骨血管化的研究[D]. 第四军医大学,2009.

[24]Ru J, Li Q. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2013;17(2): 353-357.茹嘉,李强.最新进展的转基因技术在骨与软骨缺损修复中的应用[J].中国组织工程研究,2013,17(2):353-357.

[25]Li DS, Cai B, Liu JG, et al. Zhonghua Guanjie Waike Zazhi (dianziban).2012;6(4):574-580.李冬松,蔡波,刘建国,等. 血管内皮生长因子对脂肪干细胞成骨分化基因转录水平的调节[J]. 中华关节外科杂志(电子版), 2012,6(4):574-580.

[26]Ferrari G,Cook BD,Terushkin V,et al.Transforming growth factor-beta 1 (TGF-beta1) induces angiogenesis through vascular endothelial growth factor (VEGF)-mediated apoptosis.J Cell Physiol,2009,219(2):449-458.

[27]Sun YB, Sun HM, Li JJ, et al. Shengwu Yixue Gongcheng yu Linchuang. 2009;13(1):76-80.孙仰白,孙洪邈,李建军,等. 流体切应力促进组织工程骨成骨和血管化的研究进展[J].生物医学工程与临床,2009,13(1):76-80.

[28]Polykandriotis E, Horch RE, Arkudas A, et al.Intrinsic versus extrinsic vascularization in tissue engineering. Advances in experimental medicine and biology.2006;585:311-326.

[29]Chamberlain G, Fox J, Ashton B, et al. Concise review: Mesenchymal stem cells: Their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing. Stem Cells. 2007;25:2739-2749.

[30]Aghajanova L, Horcajadas JA, Esteban FJ, et al. The bone marrow-derived human mesenchymal stem cell: potential progenitor of the endometrial stromal fibroblast. Biol Reprod. 2010;82(6):1076-1087.

[31]Peichev M, Naiyer AJ, Pereira D, et al. Expression of VEGFR-2 and AC133 by circulating human CD34(+) cells identifies a population of functional endothelial precursors. Blood. 2000 ;95(3):952-958.

[32]Hristov M, Erl W, Weber PC. Endothelial progenitor cells: Mobilization, differentiation, and homing. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2003;23(7):1185-1189.

[33]Gehling UM, Ergün S, Schumacher U, et al. In vitro differentiation of endothelial cells from AC133-positive progenitor cells. Blood. 2000;95(10):3106-3112.

[34]Kim CH, Lee JH, Won JH, et al. Mesenchymal Stem Cells Improve Wound Healing In Vivo via Early Activation of Matrix Metalloproteinase-9 and Vascular Endothelial Growth Factor. J Korean Med Sci. 2011;26(6):726-733.

[35]Pilz GA, Ulrich C, Ruh M, et al. Human term placenta-derived mesenchymal stromal cells are less prone to osteogenic differentiation than bone marrow-derived mesenchymal stromal cells. Stem Cells Dev. 2011 ;20(4):635-646.

[36]Shafiee A, Seyedjafari E, Soleimani M, et al. A comparison between osteogenic differentiation of human unrestricted somatic stem cells and mesenchymal stem cells from bone marrow and adipose tissue. Biotechnol Lett. 2011;33(6): 1257-1264.

[37]Kasper G, Mao L, Geissler S, et al. Insights into mesenchymal stem cell aging: involvement of antioxidant defense and actin cytoskeleton. Stem Cells. 2009;27(6):1288-1297.

[38]XU HZ, Su JS. ZHonghua Linchuang Yishi Zazhi(Dianziban). 2010;4(4):76-78.徐红珍,苏俭生. 组织工程骨的血管化研究进展[J].中华临床医师杂志(电子版), 2010,4(4):76-78.

[39]Gao H, Wang MY. Gannan Yixueyuan Xuebao. 2011;123(4): 171-172.高辉,王茂源. 血管内皮生长因子在骨缺损修复中的研究进展[J]. 赣南医学院学报,2011,123(4):171-172.

[40]Ma XF, Zhu XQ, He YL, et al. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu.2010;14(12):2097-2100.马雪峰,朱肖奇,贺用礼,等. 生物衍生骨体外复合构建组织工程化骨修复兔桡骨-骨膜缺损：血管化进程及其生物力学性能[J]. 中国组织工程研究与临床康复,2010,14(12):2097-2100.

[41]Liu W, Aihemaitijiang•Yusufu，Chen YF. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2010;14(7): 146-1151.刘伟,艾合买提江•玉素甫,陈永峰.筋膜包裹的骨髓间充质干细胞/聚己内酯复合体血管化组织工程骨修复比格犬骨缺损[J]. 中国组织工程研究与临床康复,2010,14(7):1146-1151.

引言

材料方法

设计：动物实验观察。
时间及地点：于2011年2月至2012年6月在无锡第三人民医院研究所完成。
材料：
胎盘组织：取健康产妇剖腹产后的胎盘组织，来源于无锡第三人民医院妇产科，将胎盘组织用于实验患者同意并签署知情同意书。
实验动物：健康成年新西兰大白兔8只，雌雄不限，体质量2.0-3.0 kg，由江苏省血吸虫病防治研究所提供，合格证号：SCXK2002-0006。实验过程中对动物的处置符合医学伦理学标准。
支架材料：丝素蛋白/羟基磷灰石复合材料(SF/HA材料)由苏州大学纺织工程学院提供。
人胎盘间充质干细胞促进血管生成实验的主要试剂：
Main experimental reagents and instruments:

实验方法：
胎盘来源间充质干细胞的分离培养：参照文献[13] ，经患者同意并签署知情同意书后获取健康产妇剖腹产后的胎盘组织，所有操作均在无菌条件下进行。将胎盘中部内层组织剪成1 cm³左右的小块，4 ℃的PBS冲洗3遍，用浓度为0.25%的胰蛋白酶37 ℃消化15 min，200目滤网过滤并收集细胞，600×g离心5 min，离心半径 12 cm，去上清。应用红细胞裂解液在4 ℃条件下水浴5 min以去除红细胞，4 ℃ PBS洗1遍。加基础培养基DMEM+1%Penicillin-Streptomycin+5 ng/L人碱性成纤维细胞生长因子+体积分数10%FBS，接种于25 cm²的培养瓶，细胞接种浓度为1×10⁶ L^-1，37 ℃、体积分数5% CO ₂、饱和湿度静置培养。细胞密度达到70%融合后用0.25%的胰蛋白酶消化，1∶2的比例传代培养。胎盘来源间充质干细胞鉴定参考作者实验室前期文章^[14] 。
胎盘来源间充质干细胞诱导分化实验：取传代培养细胞，用基础培养基DMEM+5 ng/L人碱性成纤维细胞生长因子+体积分数10%FBS +1% Penicillin-Streptomycin调整浓度为1×10⁴L^-1接种于6孔培养板，细胞密度达到60%融合时去除培养基，PBS洗2次，加入条件培养基DMEM+1%Penicillin-Streptomycin+50 μg/L血管内皮生长因子+体积分数2%FBS诱导，37 ℃、体积分数5% CO₂、饱和湿度条件下静置培养。每2 d更换培养基1次，诱导7 d后细胞应用KDR、v-WF免疫荧光染色鉴定。
免疫荧光染色：胎盘来源间充质干细胞经条件培养基诱导7 d后，去除培养基，用PBS洗3次，40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS洗涤3次，0.3% TritonX-100处理20 min，PBS漂洗3次，体积分数10%羊血清室温封闭20 min，吸出血清，分别加入1∶200的兔抗人KDR单克隆抗体和1∶500的兔抗人v-WF单克隆抗体，37 ℃水浴箱孵育2 h，然后用PBS洗3次，加入1∶500的羊抗兔荧光抗体，37 ℃水浴箱避光孵育30 min，荧光显微镜下观察、摄片。
胎盘来源间充质干细胞与丝素蛋白/羟基磷灰石材料复合培养：收集培养第3代胎盘来源间充质干细胞，用基础培养基DMEM +1%Penicillin-Streptomycin+5 ng/L人碱性成纤维细胞生长因子+体积分数10%FBS调整细胞浓度为5×10¹⁰ L^-1，先加100 μL基础培养基于24孔板的孔底，放入规格8 mm×8 mm×1 mm的丝素蛋白/羟基磷灰石复合材料，向材料表面加100 μL细胞悬液，37 ℃、体积分数5%CO₂、饱和湿度静置培养2 h，取出材料后翻转，向另一面加100 μL细胞悬液，静置培养2 h，加入基础培养基没过材料，37 ℃、体积分数5%CO₂、饱和湿度静置培养，每天更换培养基。
实验动物分组：具体步骤参考实验室前期发表文献[15] ，将8只大白兔随机摸球法均分为实验组：植入胎盘来源间充质干细胞/丝素蛋白/羟基磷灰石材料复合物；对照组植入单纯丝素蛋白/羟基磷灰石复合材料。
动物模型的制备：所有实验兔称质量，注射30 mg/kg戊巴比妥钠，麻醉后仰卧固定四肢，手术侧前肢常规剃毛、消毒，桡骨前外侧作弧形切口，分离桡骨中段，连同骨膜锯断15 mm，实验组植入胎盘来源间充质干细胞/素蛋白/羟基磷灰石材料复合物，对照组植入单纯丝素蛋白/羟基磷灰石材料。肌肉以及皮肤缝合后不给予外固定，不限制活动，标准饲料单笼饲养。连续3 d肌肉注射40×10⁴ U青霉素，于造模后第4周和第12周每组各处死2只动物观察分析。
主要观察指标：
大体观察：每天观察实验兔造模后的饮食、活动情况，造模后第4，12周每组各处死2只动物，取移植材料，观察植入物的周围组织反应、骨痂形成及骨缺损修复情况。
组织学检测：取上面获得的移植材料，进行苏木精-伊红染色：首先用体积分数10%中性甲醛溶液固定24 h，5%硝酸常规脱钙，乙醇逐级脱水，二甲苯透明，浸蜡包埋、切片后苏木精-伊红染色。
统计学分析：由第一和第五作者采用SPSS 10.0统计学软件进行统计学分析，组间两两比较行t 检验，统计学软件来源于苏州大学。

讨论

骨缺损修复是骨科临床工作的一个重点和难点。组织工程技术以其体外构建、体内重组的技术手段可为解决这一难题提供新的思路和途径^[16-20] 。目前临床上用于骨缺损修复材料有自体骨、同种异体骨和各种人工合成材料等^[21-22] 。不论是自体骨移植还是同种异体骨移植都有一定数量和形状的限制，且存在排异反应和潜在的疾病等特点。而有效的血管生成是各种人工合成材料移植的关键。
骨组织工程研究目前其面临种子细胞来源及如何为组织工程骨提供血供两大难题，尤其是组织工程骨血管化问题在国内外的研究尚处于起步阶段。骨移植后的3个基本过程是移植物血管化、骨再生和骨断端间融合，体外构建的细胞-支架复合物植入体内后，周边的细胞可依靠渗透作用从植入组织获得营养和氧气，但距支架边缘200 µm以上的细胞却存在营养供应不足，必须得到血运系统重建才能成活。另外，血液中的生长因子或促生长物质可刺激干细胞成熟分化，促进组织形成^[21]。在骨愈合过程中，矿物质的沉积依靠充足的血运。所以组织工程骨修复骨缺损的研究基础是血管化，贯穿了整个移植修复过程。段春光^[23]使用重组腺病毒将血管内皮生长因子和血管生成素这两个具有高效促血管形成能力的细胞因子的基因转导入骨髓基质干细胞，基因转染后的骨髓基质干细胞作为种子细胞与Ⅰ型胶原改性的聚乳酸-羟基乙酸/磷酸三钙材料复合，构建新型的双基因修饰的组织工程化人工骨，以期在采用组织工程化人工骨治疗大段骨缺损时能促进人工骨的血管化，进而有效修复骨缺损。实验成功的构建出新型双基因修饰人工骨,并经实验初步证实该新型人工骨具有良好的促进新生血管形成的能力，进而能够促进新生骨组织的形成。茹嘉等^[24]总结5年来转基因技术在骨与软骨缺损修复中的最新研究进展，认为基因治疗为骨和软骨再生带来了一种新的治疗理念，其可以把具有特异性的目的基因精确转移入靶细胞内，并特异性的表达。目前应用于骨与软骨缺损的基因主要包括骨形态发生蛋白、转化生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子、血管内皮细胞生长因子、bcl-xl基因等。李冬松等^[25]研究了内源性血管内皮生长因子体外诱导脂肪干细胞分化成骨的转录活化机制，通过Cbfa1和Osterix在脂肪干细胞成骨分化的不同时间的表达差异，认为在脂肪干细胞诱导成骨分化过程中，Cbfa1启动和激活Osterix转录，仍是主要的信号传导途径。脂肪干细胞具有一定的诱导成骨分化能力，但其作用主要是非依赖性Cbfal通路调控的Osterix表达。
组织工程骨的血管化是指血管长入并分布于人工材料内的过程，它是维持人工骨活力，加速骨愈合的关键。目前促进组织工程骨血管化的主要方法有^[26-27] ：①血管束移植。②应用生长因子。③血管内皮细胞联合成骨细胞与支架材料复合。第1种方法能够得到血管化的组织工程骨，但必须将组织工程骨异位植入，待血管束长人后再断蒂用于移植，不但有异位创伤的问题而且等待的时间也较长。第2种方法直接应用促血管生长因子在体内迅速降解为无活性的片段，并且其在体内的半衰期较短，会很快流失在周围组织中，达不到理想的效应浓度；第3种方法需要大量培养、扩增血管内皮细胞，周期长，而且需要从自体切取血管用于血管内皮细胞的分离、培养。如果能找到新的内皮细胞来源问题，这不失为一种好方法。
间充质干细胞促进血管生成主要有两方面作用：①可以分化为血管内皮细胞，参加缺血组织的血管形成，能为缺血组织新生血管提供内皮细胞，还可通过旁分泌作用刺激周围成熟内皮细胞增殖和迁移。②产生多种细胞因子和生长因子，如血管内皮生长因子、人碱性成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子、白细胞介素1以及白细胞介素8等，诱导血管发生^[28-29] 。课题组前期研究结果表明胎盘来源间充质干细胞具有与骨髓间充质干细胞相似的细胞生物学特性^[7] ，胎盘组织作为临床工作的废弃物，来源广泛，重要的是对胎盘来源间充质干细胞的研究避免了伦理问题。实验过程中，诱导后的胎盘来源间充质干细胞免疫荧光染色可见vWF、KDR阳性表达，说明其具有分化为内皮细胞的能力。KDR是内皮细胞生长的早期表面受体，主要出现在内皮细胞诱导转化的早期^[30-31] 。Ⅷ因子相关抗原是内皮细胞特异性标志，可以通过vWF的测定对内皮细胞进行鉴定[32-33]。
尽管研究表明骨髓来源的间充质干细胞在成骨性能方面优于其他组织来源的间充质干细胞^[34-36] ，但骨髓间充质干细胞的数量、抗氧化能力以及分化能力随着年龄增长而减少和减弱^[37] ，胎盘来源间充质干细胞则没有这些弱点，可以在体外大规模扩增，作为组织工程研究的种子细胞具有优势。实验中通过大体观察及组织学切片苏木精-伊红染色可以看出单纯的丝素蛋白/羟基磷灰石材料组虽能表现出一定的成骨行为，这可能是由于丝素蛋白/羟基磷灰石材料具有一定的骨诱导性，可以在一定程度上完成一个爬行替代过程。而丝素蛋白/羟基磷灰石材料复合胎盘来源间充质干细胞组则表现出完全不同的成骨能力，4周时新骨已开始形成，12周时有部分新生骨组织形成板层骨，骨小梁形成，内可见大量成骨细胞以及新生血管，已可大致修复骨缺损，这在一定意义上类似于活的骨移植。胎盘来源间充质干细胞促进组织工程骨内血管再生，加快组织工程骨的血管化过程可以提高成骨速度和成骨质量^[38-41] 。
实验表明丝素蛋白/羟基磷灰石材料与胎盘来源间充质干细胞联合移植能够修复兔桡骨缺损，胎盘来源间充质干细胞异种移植后仍具有成骨潜能和血管生成能力。随着材料学研究、分子技术、细胞技术等的发展，材料及细胞共培养的方法必将在血管化的研究方面取得突破性的进展。