地塞米松浓度与脐带间充质干细胞的成骨分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.23.004

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (23): 4204-4211.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.23.004

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地塞米松浓度与脐带间充质干细胞的成骨分化

洪敬欣¹，刘剑¹，李琳芳²，韩俊领^1，3

1协和干细胞基因工程有限公司，天津市 300384
2解放军第二军医大学东方肝胆外科医院病毒基因治疗实验室，上海市 200438
3中国医学科学院，北京协和医学院血液学研究所，血液病医院，天津市 300020

出版日期:2013-06-04 发布日期:2013-06-04
通讯作者: 韩俊领，副研究员，协和干细胞基因工程有限公司，天津市 300384；中国医学科学院，北京协和医学院血液学研究所，血液病医院，天津市 300020 hanjl1@126.com
作者简介:洪敬欣☆，女，1978年生，天津市人，2007年天津医科大学毕业，博士，副研究员，主要从事血液学及干细胞方面的研究。 hjx78@126.com

Osteogenic differentiation of human umbilical cord mesenchymal stem cells induced with different concentrations of dexamethasone in vitro

Hong Jing-xin ¹, Liu Jian¹, Li Lin-fang ², Han Jun-ling ^{1, 3}

1 Union Stem Cell & Gene Engineering Co., Ltd., Tianjin 300384, China
2 Laboratory of Viral and Gene Therapy, Eastern Hepatobiliary Surgery Hospital, Second Military Medical University of PLA, Shanghai 200438, China
3 Institute of Hematology, Blood Disease Hospital, Peking Union Medical College and Chinese Academy of Medical Sciences, Tianjin 300020, China

Online:2013-06-04 Published:2013-06-04
Contact: Han Jun-ling, Associate Researcher, Union Stem Cell & Gene Engineering Co., Ltd., Tianjin 300384, China; Institute of Hematology, Blood Disease Hospital, Peking Union Medical College and Chinese Academy of Medical Sciences, Tianjin 300020, China hanjl1@126.com
About author:Hong Jing-xin☆, M.D., Associate Researcher, Union Stem Cell & Gene Engineering Co., Ltd., Tianjin 300384, China hjx78@126.com

摘要/Abstract

摘要：

背景：在地塞米松、维生素C和β-甘油磷酸钠的共同作用下，人脐带间充质干细胞可以向成骨细胞分化。作为糖皮质类激素的地塞米松，其浓度对人脐带间充质干细胞体外成骨分化存在着影响。
目的：探寻人脐带间充质干细胞向成骨细胞诱导分化过程中地塞米松的优选浓度。
方法：采用植块法从正常足月新生儿脐带中分离培养间充质干细胞。取第3代细胞进行日常细胞培养和诱导分化实验。流式细胞术检测所获细胞的表面标记表达情况，成脂、成骨诱导分化鉴定人脐带间充质干细胞。倒置相差显微镜观察成骨分化过程中细胞形态的变化。以含1×10^-8 mol/L，5×10^-8 mol/L，1×10^-7 mol/L 3种浓度地塞米松的成骨诱导液对人脐带间充质干细胞进行成骨诱导。盐酸四环素荧光及Von Kossa染色法对比观察钙结节形成。反转录-聚合酶链反应法对比检测细胞骨桥蛋白基因表达。
结果与结论：植块法分离的人脐带间充质干细胞形态均一，多为梭形，平行排列生长或旋涡状生长。流式细胞术检测CD29，CD73和CD90呈阳性表达，CD31，CD34和HLA-DR呈阴性表达。成脂诱导后可观察到细胞内有脂滴形成，油红O染色呈阳性。盐酸四环素荧光结果和Von Kossa染色结果显示，所形成的钙结节大小及数量，均随着地塞米松浓度的增加而增强、增多。反转录-聚合酶链反应检测结果显示，3种浓度地塞米松组的骨桥蛋白基因均有表达，且表达强度随着地塞米松浓度的增加而增强。提示成骨诱导液中地塞米松浓度为1×10^-7 mol/L时，能更有效地诱导人脐带间充质干细胞向成骨细胞分化。

关键词: 干细胞, 脐带脐血干细胞, 地塞米松, 优选浓度, 成骨分化, 成脂分化, 钙结节, 骨桥蛋白, 细胞培养, 细胞鉴定, 细胞形态, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Under the combination effect of dexamethasone, vitamin C and β-glycerophosphate, human umbilical cord mesenchymal stem cells can differentiate into osteoblasts. Dexamethasone is a glucocorticoid hormone, and its concentration can affect the osteogenic differentiation of human umbilical cord mesenchymal stem cells.
OBJECTIVE: To explore the optimal concentrations of dexamethasone in the osteogenic differentiation of human umbilical cord mesenchymal stem cells.
METHODS: Human umbilical cord mesenchymal stem cells were isolated from the normal full-term newborn umbilical cord by explant method. The passage 3 human umbilical cord mesenchymal stem cells were used for routine cell culture and induced differentiation experiments. The expression of surface markers of stem cells was detected with flow cytomerey, and the human umbilical cord mesenchymal stem cells were identified by osteogenic differentiation and adipogenic differentiation. The changes of cell morphology were observed under the inverted phase contrast microscope in the process of osteogenic differentiation. The induced medium for osteogenic differentiation containing 1×^10-8 mol/L, 5×10^-8 mol/L and 1×10^-7 mol/L dexamethasone was used for the osteogenic induction of umbilical cord mesenchymal stem cells. Tetracycline hydrochloride fluorescence and Von Kossa staining were applied to observe the formation of calcium nodules. Reverse transcriptase-PCR was used to detect the expression of osteopontin gene.
RESULTS AND CONCLUSION: The form of human umbilical cord mesenchymal stem cells separated by explant method was uniform, spindle and growing in parallel and vortex-like shape. The flow cytometry results showed that CD29, CD73 and CD90 were positive, and CD31, CD34 and HLA-DR were negative. Intracellular lipid droplets could be observed after adipogenic differentiation, and the formation size and quantity of calcium nodules were enhanced as the concentration of dexamethasone increased. The expression level of osteopontin gene could be seen in three concentrations group, and the expressions were enhanced with the increasing of dexamethasone concentration from reverse transcriptase-PCR results. Human umbilical cord mesenchymal stem cells can be effectively induced to differentiate into osteobalsts when the medium contains 1×10^-7 mol/L dexamethasone.
.

Key words: stem cells, umbilical cord/umbilical cord blood stem cells, dexamethasone, optimal concentration, osteogenic differentiation, adipogenic differentiation, calcium nodules, osteopontin, cell culture, cell identification, cell morphology, stem cell photographs-containing paper

中图分类号:

R394.2

洪敬欣，刘剑，李琳芳，韩俊领. 地塞米松浓度与脐带间充质干细胞的成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(23): 4204-4211.

Hong Jing-xin, Liu Jian, Li Lin-fang, Han Jun-ling. Osteogenic differentiation of human umbilical cord mesenchymal stem cells induced with different concentrations of dexamethasone in vitro[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(23): 4204-4211.

图/表（结果） 7

2.1 植块法分离人脐带间充质干细胞的形态及鉴定结果 植块法分离的人脐带间充质干细胞形态相对均一，为平行排列生长或旋涡状生长的梭形细胞；10-20 d后可见组织块周围有梭形细胞爬出，三四天后可传代，并能长期稳定培养，见图1。

2.2 人脐带间充质干细胞的鉴定结果 流式细胞术检测结果表明所分离的人脐带间充质干细胞，高表达间质细胞标记物CD29、CD73和CD90，而造血系标记物CD31、CD34和人类白细胞抗原HLA-DR均呈阴性表达，见图2。

经成脂诱导后，生长明显减慢，细胞形态逐渐发生变化，细胞逐渐由长梭形变为短梭形或椭圆形，诱导14d后，胞质中出现折光性强的脂肪小滴，之后脂滴逐渐增大、增多，诱导21d，油红O染色可见细胞胞质内有红染脂滴，大小不等，部分脂滴发生融合，见图3。

2.3 人脐带间充质干细胞成骨分化后钙结节鉴定结果 倒置相差显微镜下观察，成骨诱导后人脐带间充质干细胞的形态由梭形变为多角形或不规则形，突起增多，胞浆色深，含粗大颗粒，胞核明显，细胞生长相对减缓，形态变化不明显。随培养时间的延长，3周时细胞呈现聚集生长现象，其上逐渐出现无定形的折光物质沉集，并逐渐增大、增多，可见类似结节状的结构，4周时可见局部由棕黑色细胞外基质沉积，见图4。

结节状结构的细胞团的大小和数量随着地塞米松浓度增加而增大、增多。盐酸四环素的荧光检测可见在形成钙结节的位置有特异的红色荧光信号，Von Kossa染色可见棕黑色矿化物沉积，而且红色荧光信号和棕黑色矿化物沉淀随着地塞米松浓度的增加而增多、增大，见图5，6。

2.4 人脐带间充质干细胞成骨分化后的矿化面积百分率 成骨诱导后21 d时，矿化面积百分率随着地塞米松浓度升高而增加，至1×10^-7 mol/L组达峰值。实验组之间比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见图7。

2.5 地塞米松对人脐带间充质干细胞成骨分化后骨桥蛋白基因表达的影响 人脐带间充质干细胞经含有 1×10^-8 mol/L、5×10^-8 mol/L、1×10^-7 mol/L地塞米松的成骨诱导液作用21 d后，骨桥蛋白 mRNA均有表达，其表达强度随着地塞米松浓度的增加而增强，对照组则无相应的特异扩增条带出现，见图8。

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引言

材料方法

设计：体外细胞学水平，对比观察实验。
时间及地点：于2011年4月至2012年4月在协和干细胞基因工程有限公司和上海东方肝胆外科医院研究所病毒基因治疗实验室完成。
材料：人脐带间充质干细胞由协和干细胞基因工程有限公司提供。
地塞米松体外诱导人脐带间充质干细胞的成骨分化实验的主要试剂及仪器：
Main reagents and instruments:

实验方法：
人脐带间充质干细胞的分离培养^[8-10]：经解放军第二军医大学第一附属医院(上海市长海医院)伦理委员会的批准和产妇的知情同意，采集足月剖宫产健康胎儿脐带^[11] 。脐带采集之前产妇需做艾滋病病毒抗体、乙型肝炎病毒抗体、丙型肝炎病毒抗体、梅毒螺旋体抗体、谷丙转氨酶、支原体等检测，全部合格以确保安全性后方可采集。脐带自手术台取下后，浸入含抗生素的生理盐水中，4 ℃保存。在超净台内取出脐带，用杜氏磷酸盐缓冲液冲洗净表面残余血液，将脐带剪成1 mm³大小的组织块后放入T 25 cm²的培养瓶中。待10-20 d即可从组织块的周围爬出梭形的成纤维样细胞。去除组织块，待细胞达70%-80%融合时进行传代，置相差显微镜下观察细胞形态及生长情况。
人脐带间充质干细胞的鉴定：
流式细胞术检测^[12]：将第3代人脐带间充质干细胞接种于培养瓶中，待细胞达到80%-90%融合时使用0.25%胰酶消化，将细胞悬液转入15 mL离心管中并以 1 000 r/min离心3 min。离心之后，弃掉上清，磷酸盐缓冲液洗涤2次，分成每管1×10⁶细胞，第1管为空白对照，用于调节流式细胞仪的电压，第2管加入同型对照抗体(PE-MOUSE IgG1/FITC-MOUSE IgG1/APC-Mouse IgG1 κ)10 μL，其余管中加入相应流式抗体10 μL，混匀，4 ℃避光孵育30 min，磷酸盐缓冲液洗涤1次，离心后弃上清，加入500 μL磷酸盐缓冲液重悬，混匀，即可上机(流式细胞仪FACSAria，BD公司)检测。
人脐带间充质干细胞体外成脂诱导分化：参照文献[13]方法，配置含0.5 mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、1 μmol/L地塞米松、10 μmol/L胰岛素、200 μmol/L吲哚美辛、体积分数10%FBS的DMEM/F12成脂诱导液。取第3-5代细胞以1×10⁸ L^-1浓度接种于预置盖玻片的6孔板，每孔加入1 mL DMEM/F12培养液，37 ℃、体积分数5%CO₂及饱和湿度培养箱培养至细胞达60%-70%融合，加入成脂诱导液，37 ℃、体积分数5%CO^₂及饱和湿度培养箱培养，每日倒置相差显微镜下观察细胞内脂滴形成情况，21 d后行油红O染色。
人脐带间充质干细胞体外成骨诱导分化：取第3-5代人脐带间充质干细胞进行成骨诱导分化，用DMEM/F12完全培养液以1×10⁸ L^-1细胞浓度将上述细胞接种于6孔板中。实验分为4组，对照组和3个实验组(依次对应地塞米松浓度为1×10^-8 mol/L、5×10^-8 mol/L、1×10^-7 mol/L)，每个实验组设3个平行孔，以消除实验误差。对照组加入DMEM/F12完全培养液，3个实验组依次加入含1×10^-8 mol/L、5×10^-8 mol/L、1×10^-7 mol/L地塞米松成骨诱导液(不同浓度的地塞米松+10 mmol/L β-磷酸甘油钠+50 μmol/L维生素C)，37 ℃、体积分数5%CO₂及饱和湿度培养箱培养，每3 d使用对应的培养液进行换液。诱导21 d，磷酸盐缓冲液洗涤细胞1次，体积分数70%乙醇固定10 min，行四环素荧光检测及Von Kossa染色，鉴定钙结节的产生。反转录-聚合酶链反应法检测细胞骨桥蛋白基因表达^[14] 。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。骨桥蛋白引物的上游序列为：5’-CTA GGC ATC ACC TGT GCC ATA CC-3’，下游序列：5’-CTA CTT AGA CTA CTT GAC CAG TGA C-3’，扩增片段长度为330 bp。以β-actin作为内参照，上游序列为：5’-TGA CGG GGT CAC CCA CAC TGT GCC CAT CTA-3’，下游序列：5’-CTA GAA GCA TTT GCG GTG GAC GAT GGA GGG-3’，扩增片段长度为660 bp。聚合酶链反应条件设置如下：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性45 s，57 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，共循环28次，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存扩增产物。取扩增产物5 μL，置于1.5%琼脂糖上，80 V电压下电泳1 h，观察并拍照。
矿化面积百分率的计算：取成骨诱导培养21 d内的实验组细胞，倒置相差显微镜下观察其形态变化及矿化结节形成情况。图像信号采集与分析系统测定成骨诱导培养21 d时各组细胞矿化面积，每组随机取5个视野，根据公式计算矿化面积百分率^[15] 。

主要观察指标：①倒置相差显微镜下观察细胞形态改变。②盐酸四环素荧光检测及Von Kossa染色，鉴定钙结节的产生，测定矿化面积百分率。③反转录-聚合酶链反应法检测骨桥蛋白基因表达。
统计学分析：由第一作者采用SPSS 17.0软件进行统计学处理，实验所得数据以x(_)±s表示，两组间比较用t 检验，P < 0.05认为差异有显著性意义。

讨论

近20年来，组织工程取得了迅猛发展，为骨缺损修复提供了新的思路和治疗途径，要构建理想的组织工程化骨，其前提就是要有生物学特性良好的种子细胞和适合的支架材料，随着干细胞研究的不断深入，给组织工程种子细胞的选择带来了新的希望^[16-17] 。目前骨髓是实验和临床研究中间充质干细胞的主要来源，但存在自身局限性。骨髓每10⁶个细胞中含有1-10个干细胞，并且成人骨髓源间充质干细胞的细胞数量及增殖分化潜能随供者年龄的增大而下降，病毒感染率较高，且供者间充质干细胞的采集须行骨髓穿刺术，其来源受到限制^[18] 。脐血间充质干细胞来源充足，但间充质干细胞分离效率低，限制了其在组织工程和细胞治疗中的广泛应用^[19] 。
脐带中富含造血、间充质、神经及内皮等多种干/祖细胞。有研究表明，平均每厘米脐带组织中含有4×10⁶个成纤维样细胞[20]，远远高于骨髓中的含量。与骨髓来源的间充质干细胞相比较，人脐带来源的间充质干细胞有着众多优势。同时，脐带中含有韧性强的胶原蛋白及弹性好的纤维组织，可以为骨细胞生长提供适宜的条件^[13] 。另外，含有大血管也许可以提供丰富的成骨促进因子，例如血管内皮生长因子。因此，脐带以上特点，使其能够成为理想的骨组织工程材料^[21] 。
实验正是基于脐带的这些优点，利用植块法分离纯化人脐带间充质干细胞，所获得的细胞具有贴壁生长的特性，形态类似成纤维细胞，体外增殖能力强，并能长期稳定培养。流式细胞仪检测结果表明，实验分离得到的间充质干细胞能够高表达间质细胞标志CD29，CD73，CD90，不表达造血系标志CD31，CD34和人白细胞抗原HLA-DR。间充质干细胞的分化由机体发育的需要和它们所处的微环境而定，其体外的分化因加入的诱导剂不同而发生变化。实验分离得到的人脐带间充质干细胞经成骨培养基诱导后，细胞的形态由梭形变为多角形或不规则形，胞浆色深，3周时细胞呈现聚集生长现象，其上逐渐出现无定形的折光物质沉集，并逐渐增大、增多，可见类似结节状的结构，4周时可见局部由棕黑色细胞外基质沉积。通过盐酸四环素特异荧光及Von Kossa染色结果显示人脐带间充质干细胞可分化为成骨细胞。经成脂诱导后，生长明显减慢，细胞逐渐由长梭形变为短梭形或椭圆形，诱导21 d，油红O染色可见细胞胞质内有红染脂滴，大小不等，部分脂滴发生融合。油红O染色结果证实其可分化为脂肪细胞。因此，根据国际细胞治疗协会(ISCT)发布的鉴定标准[5]，作者从人脐带中获取的这些细胞即为间充质干细胞。
研究表明地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C是间充质干细胞向成骨细胞分化的必要条件^[22-23] 。诱导体系中的维生素C可以促进间充质干细胞合成胶原，形成钙化，能调节碱性磷酸酶的活性。β-甘油磷酸钠在培养液中迅速被碱性磷酸酶水解，产生大量磷酸离子，促进生理性钙盐的沉积和钙化。地塞米松促进间充质干细胞向成骨细胞分化的同时促进Ⅰ型前胶原、碱性磷酸酶、骨钙素及骨涎蛋白mRNA的表达。实验根据Mountziaris 等^[24]和张建萍^[25]研究得到提示，地塞米松对间充质干细胞的成骨分化存在重要影响，并参照王伟等^[15]研究主要了解不同地塞米松浓度对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响，并在此基础上建立地塞米松的诱导浓度梯度，观察地塞米松浓度对人脐带间充质干细胞成骨分化的影响。此外，石文俊等^[26]和张文信等^[27]研究结果显示地塞米松对不同物种骨髓来源的间充质干细胞的增殖、凋亡和细胞周期也存在着影响。可见，地塞米松对间充质干细胞的成骨分化和增殖凋亡等生物学特性都会产生重要的影响。
研究显示地塞米松在10^-8 mol/L浓度时成骨作用最明显^[28] 。地塞米松是通过与激素相关受体结合，在转录水平促进各种成骨标志物的表达，增强成骨分化[29]。有学者使用含有1×10^-8，1×10^-7，1×10^-6，1×10^-5 mol/L 地塞米松的成骨培养液对脂肪干细胞进行诱导，通过比较成骨诱导各组细胞外矿化结节数，提出1×10^-7 mol/L地塞米松有利于脂肪干细胞向成骨细胞分化[30]。王伟等[15]同样使用含有1×10^-9，1×10^-8，1 ×10^-7，1×10^-6，1×10^-5 mol/L地塞米松的成骨培养液对脂肪干细胞进行诱导，则得出1×10^-8 mol/L地塞米松诱导成骨过程中，所形成的细胞外矿化沉积较多，具有更好的成骨诱导效果。实验结果采用1×10^-8，5×10^-8，1×10^-7 mol/L 3种地塞米松浓度的成骨诱导液对人脐带来源的间充质干细胞进行诱导，通过比较非诱导组和成骨诱导各组细胞外钙结节的数量、体积以及骨桥蛋白mRNA的表达量，实验结果显示，地塞米松的浓度为1×10^-7 mol/L时，所形成的矿化结节数量多，矿化面积大，成骨标志物骨桥蛋白基因表达最强，具有更好的成骨诱导效果。各科研小组所报道了间充质干细胞成骨分化过程中地塞米松的不同优选浓度，这可能与间充质干细胞的来源、成骨分化的实验条件以及矿化结节的入选标准不同有关。
实验筛选了人脐带间充质干细胞的高效成骨诱导体系，为进一步利用人脐带间充质干细胞进行骨缺损的治疗和修复提供了一定的实验依据，但其骨形成等分子机制及经其诱导分化的成骨细胞在生物体内的安全问题尚需进一步研究。

地塞米松浓度与脐带间充质干细胞的成骨分化

Osteogenic differentiation of human umbilical cord mesenchymal stem cells induced with different concentrations of dexamethasone in vitro

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