钠离子通道阻断剂抑制骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.23.001

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (23): 4181-4188.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.23.001

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钠离子通道阻断剂抑制骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的分化

郝春媛¹，马爱群²，王亭忠²，刘瑞³

1西安市第一医院心血管内科，陕西省西安市 710002
2西安交通大学医学院第一附属医院心血管内科，陕西省西安市 710061
3西安交通大学医学院生理和病理生理学系，陕西省西安市 710061

出版日期:2013-06-04 发布日期:2013-06-04
通讯作者: 马爱群，博士，教授，博士生导师，西安交通大学医学院第一附属医院心血管内科，陕西省西安市 710061 maaiqun@medmail.com.cn
作者简介:郝春媛★，女，1979年生，陕西省榆林市人，汉族，硕士，主治医师，主要从事干细胞向心肌细胞分化机制的研究。 45261743@qq.com
基金资助:
国家自然科学基金项目(81000063)。

Sodium channel blockers inhibit the differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells into cardiac-like cells

Hao Chun-yuan¹, Ma Ai-qun², Wang Ting-zhong², Liu Rui³

1 Department of Cardiology, No. 1 Hospital of Xi’an, Xi’an 710002, Shaanxi Province, China
2 Department of Cardiology, First Affiliated Hospital of Medical College of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710061, Shaanxi Province, China
3 Department of Physiology and Pathophysiology, First Affiliated Hospital of Medical College of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710061, Shaanxi Province, China

Online:2013-06-04 Published:2013-06-04
Contact: Ma Ai-qun, M.D., Professor, Doctoral supervisor, Department of Cardiology, First Affiliated Hospital of Medical College of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710061, Shaanxi Province, China Maaiqun@medmail.com.cn
About author:Hao Chun-yuan★, Master, Attending physician, Department of Cardiology, No. 1 Hospital of Xi’an, Xi’an 710002, Shaanxi Province, China 45261743@qq.com
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 81000063*

摘要/Abstract

摘要：

背景：研究发现人和动物的多种间充质干细胞均存在河豚毒素敏感性钠离子通道，但钠离子通道是否会影响间充质干细胞向心肌细胞分化尚无共识。
目的：观察钠离子通道特异性阻断剂河豚毒素对骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的影响。
方法：利用Percoll’s密度梯度离心法结合差速贴壁法分离大鼠骨髓间充质干细胞，用主动脉逆行生物酶灌流法分离大鼠成体心肌细胞。将DAPI标记的大鼠骨髓间充质干细胞与成体心肌细胞混合培养，应用0，10，100 μmol/L的河豚毒素进行干预，1周后观察骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的分化情况。
结果与结论：免疫荧光细胞化学染色显示，大鼠骨髓间充质干细胞和成体心肌细胞混合培养1周后，骨髓间充质干细胞显著表达心肌特异性蛋白结蛋白和肌球蛋白，而10，100 μmol/L的河豚毒素均可完全抑制结蛋白和肌球蛋白在骨髓间充质干细胞中的表达。提示钠离子通道是骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的必要条件。

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 骨髓间充质干细胞, 心肌损伤, 钠离子通道, 河豚毒素, 心肌样细胞, 细胞分化, 国家自然科学基金, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: The studies have found that the tetrodotoxin-sensitive sodium channels exist in various human and animal mesenchymal stem cells, but whether sodium channels may influence the differentiation of mesenchymal stem cells into myocardial cells has not been confirmed.
OBJECTIVE: To observe the effect of sodium channel blocker tetrodotoxin on the differentiation of mesenchymal stem cells into cardiac-like cells.
METHODS: Rat bone marrow mesenchymal stem cells were isolated with Percoll’s density gradient centrifugation and differential adhesion method, and then the adult rat myocardial cells were isolated by aorta retrograde collagenase perfusion; rat bone marrow mesenchymal stem cells labeled with 4',6-diamidino-2-phenylindole were co-cultured with adult rat myocardial cells, and induced with 0, 10 and 100 μmol/L tetrodotoxin; and then the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into cardiac-like cells was observed at 1 week after induction.
RESULTS AND CONCLUSION: Immunofluorescence staining showed that the bone marrow mesenchymal stem cells could express cardiac-specific protein desmin and myosin after bone marrow mesenchymal stem cells co-cultured with myocardial cells for 1 week, while 10 and 100 μmol/L tetrodotoxin could inhibit the expressions of desmin and myosin in bone marrow mesenchymal stem cells. The results indicate that sodium channel may play a pivotal role in the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into cardiac-like cells.

Key words: stem cells, bone marrow-derived stem cells, bone marrow mesenchymal stem cells, myocardial injury, sodium channel, tetrodotoxin, cardiac-like cells, cell differentiation, National Natural Science Foundation of China, stem cell photographs-containing paper

中图分类号:

R394.2

郝春媛，马爱群，王亭忠，刘瑞. 钠离子通道阻断剂抑制骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的分化[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(23): 4181-4188.

Hao Chun-yuan, Ma Ai-qun, Wang Ting-zhong, Liu Rui. Sodium channel blockers inhibit the differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells into cardiac-like cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(23): 4181-4188.

图/表（结果） 6

2.1 分离培养的大鼠骨髓间充质干细胞的形态 原代细胞在接种24 h后开始有少量细胞贴壁生长，细胞呈长梭形或纺锤形，培养三四天时可见部分细胞开始增殖，呈成纤维细胞样生长，并表现出集落生长的特性，见图1A；随着培养时间的延长，贴壁细胞明显增多，集落逐步增大，细胞密度较高时排列成漩涡状或放射状，见图1B。培养至第9，10天，细胞融合成单层，见图1C。悬浮细胞在培养过程中随着换液次数的增多逐渐被去除。传代后细胞很快贴壁，增殖迅速，细胞形态、大小与原代细胞相似，但已失去集落生长的特性而呈均匀分布，见图1D。

2.2 大鼠骨髓间充质干细胞的标记情况 用DAPI进行细胞标记后，倒置荧光显微镜下观察发现，几乎所有细胞都发蓝色荧光，标记率几乎为100%，见图2。

2.3 分离培养的大鼠骨髓间充质干细胞的表型 流式细胞鉴定结果显示，传至第2代的大鼠骨髓间充质干细胞表面抗原CD90和CD54呈阳性表达，而CD4、CD5、CD8、CD34、CD44、CD45为阴性表达，见图3。

2.4 分离培养的成体大鼠心肌细胞的形态 分离培养的成体大鼠心肌细胞呈杆状，横纹清晰，整齐有序，细胞轮廓清楚透亮，长宽比例为4-6∶1，见图4。

2.5 河豚毒素对大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的影响 大鼠骨髓间充质干细胞和成体心肌细胞混合培养1周后，免疫荧光细胞化学染色显示，正常对照组骨髓间充质干细胞表达结蛋白和肌球蛋白，提示骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化。而100，10 μmol/L河豚毒素组骨髓间充质干细胞均不表达结蛋白和肌球蛋白，见图5，6。

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引言

大量体内外实验证实，干细胞可以在一定条件下被诱导分化为心肌细胞，这些干细胞包括胚胎干细胞、骨骼肌卫星细胞、骨髓来源的干细胞等^[1-5] 。其中骨髓间充质干细胞因具有易于获取、体外扩增容易、免疫原性低、不涉及伦理问题、在一定条件诱导下可以分化为心肌细胞等优势，被较多用于基础和临床实验^[6-9] 。
虽然干细胞移植为心肌损伤的治疗带来新的希望，但其中仍然存在很多问题^[10-12] ，例如移植的干细胞在宿主体内定向分化为心肌细胞后，新生的心肌细胞是否具备与天然心肌细胞相同的电生理功能，是否能与宿主心肌细胞发生有效的结构和功能整合^[13-14] 。因此，深入阐明调控干细胞向心肌细胞定向分化的机制仍是需要迫切解决的关键问题。
离子通道是生物膜上具有选择性允许某种离子跨膜流动的亲水性蛋白质孔道，通过调节离子流的动力学，使细胞得以维持内环境动态平衡^[15-18] 。钠离子通道为选择性允许钠离子跨膜通过的离子通道，其主要功能是参与产生动作电位，维持细胞膜的兴奋性和传导性^[19-20] ，钠离子通道产生的钠离子电流可以被河豚毒素特异性阻断^[21-22] 。最近的研究表明，钠离子通道不仅仅调节进出细胞膜的钠离子流，而且能够调控上皮细胞以及癌细胞的增殖和迁移^[23-25] 。另外，钠离子通道也可以影响组织细胞的分化和发育^[26-27] 。
缺血性心脏病发生时多伴有离子通道表达和功能的改变^[28] ，那么心脏电活动紊乱和生物电微环境的改变是否会影响干细胞向心肌细胞的分化？近期研究发现人和动物的多种间充质干细胞均存在河豚毒素敏感性的钠离子通道^[29-32] ，但关于钠离子通道是否会影响间充质干细胞向心肌细胞的分化，尚未发现有报道。
实验拟采用与成体心肌细胞混合培养的方法诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化，观察不同浓度河豚毒素对骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的影响，探讨钠离子通道在骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化中的作用。

材料方法

设计：细胞学体外对比观察实验。
时间及地点：于2009年7月至2012年3月在陕西省分子心脏病学重点实验室完成。
材料：
实验动物：健康清洁级SD大鼠，雌雄不限，由西安交通大学医学院实验动物中心提供，许可证号：SCXK(陕2007-001)。取4周龄体质量70 g左右的大鼠5只用于分离骨髓间充质干细胞，取8周龄体质量270 g左右的大鼠5只用于分离心肌细胞。动物饲养环境为清洁级。
河豚毒素对骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化影响实验中所用主要试剂与仪器：
Main reagents and instruments:

方法：
大鼠骨髓间充质干细胞分离与培养：取70 g左右SD大鼠，敲击头部处死，浸泡于体积分数75%的乙醇中20 min以消毒全身皮肤，无菌条件下分离剪取四肢骨，剥除骨周软组织，PBS冲洗3遍洗去残留血液，视骨长短剪至两三段，用DMEM培养液反复冲洗骨髓腔及干骺端至骨质发白。吸取含有骨髓细胞的DMEM液经200目不锈钢滤网过滤，将滤液充分吹打混匀后，贴壁缓慢加入盛有等体积Percoll’s液的离心管内，保证二者之间界面清楚，800×g离心20 min，可见上下两层中间有宽约2 mm的白色条带，此处为骨髓单个核细胞，小心吸取中间层细胞置于另一离心管中，PBS洗涤2遍，400×g离心10 min。沉淀的细胞加入含有体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液中混匀，将细胞悬液以5×10⁸ L^-1细胞浓度接种于50 mL培养瓶中，放入37 ℃的体积分数5%CO₂培养箱中孵育。24 h后更换培养基，加入新鲜培养液，每三四天换液1次，待细胞占瓶底的80%或接近融合时传代培养。
流式细胞分析鉴定：取第2代骨髓间充质干细胞，用2.5 g/L胰酶消化，血清终止胰酶反应，400×g离心 5 min，弃上清，加入PBS调整细胞浓度为2×10⁹L^-1，以每管0.5 mL分装到9个Eppendorff管中，400×g离心5 min，弃上清，每管加入0.5 mL PBS重悬细胞，各管中分别加入抗大鼠CD4-FITC、CD5-FITC、CD8-FITC、CD34-PE、CD44-FITC、CD45-FITC、CD54-FITC和CD90-FITC各10 μL，同型抗体作为对照，室温孵育20 min，PBS洗涤，400×g离心5 min，再重复1次，每管中加入500 μL 40 g/L多聚甲醛固定，上机检测。
DAPI标记大鼠骨髓间充质干细胞：当细胞接近于80%融合时，用2.5 g/L的胰蛋白酶消化，加入无抗生素DMEM培养基，按2×10⁵/孔接种至预置盖玻片的12孔培养板，在骨髓间充质干细胞传至第2代时进行标记。吸去培养板各孔中的培养基，取离心管2支，各加入DMEM 6 mL，再加入1 mg/L的DAPI 6 μL混匀，于每孔中加入DAPI稀释液0.5 mL，静置30 min，吸去DAPI-DMEM，用DMEM清洗2遍，之后再加入含血清的DMEM继续培养。
成体大鼠心肌细胞的分离与培养：取270 g左右SD大鼠1只，体积分数2%戊巴比妥钠(1∶200肝素；45 mg/kg)腹腔注射麻醉，无菌解剖取出心脏，修剪主动脉根部，丝线绑缚于Langendorff灌注架上，37 ℃连续灌注无钙台氏液[NaCl：2 045.4 mg，KCl：100.65 mg，MgCl₂ (1.8 mmol/L)：4.5 mL，HEPES：595.75 mg，葡萄糖：495.42 mg，用1 mol/L NaOH调节pH值至7.35-7.40] 5 min左右，然后用消化酶液(0.06 mmol/L Ca ²⁺台氏液30 mL，Ⅰ型胶原酶20 mg，蛋白酶3 mg，小牛血清20 mg)循环灌注6 min，再用含0.06 mmol/L Ca ²⁺的台氏液灌注60 mL，随后剪下心室，在含100 μmol/L Ca ²⁺的KB液[KCl：93.18 mg，KH₂PO₄：68.05 mg，MgCl₂ (3 mmol/L)：1.5 mL，葡萄糖：99.09 mg，EGTA： 9.51 mg，牛磺酸：125.1 mg，L-谷氨酸：514.95 mg，HEPES：119.15 mg，溶于50 mL去离子水中，用3 mol/L KOH调节pH值至7.35-7.40]中用眼科剪剪碎，37 ℃轻摇10 min，200 μm滤网过滤，将滤液以500×g离心 1 min。弃上清，加入含Ca ²⁺500 μmol/L的KB液500×g离心1 min。再用含1 mmol/L Ca ²⁺的KB液重复1次，弃上清，加6 mL DMEM培养基，然后接种到60 mm培养皿中。静置60 min后，轻轻吸取悬液，混匀，于血细胞计数板上计数，并调整细胞浓度为5×10⁸L^-1备用。
实验分组：将DAPI标记的大鼠骨髓间充质干细胞(2×10⁵个/孔)与心肌细胞(8×10⁵个/孔)混合培养，实验分为4组：①正常对照组：将新鲜分离的大鼠成体心肌细胞与培养的骨髓间充质干细胞按4∶1比例混合培养。②100 μmol/L河豚毒素组：两种细胞混合培养的同时，加入河豚毒素，使其终浓度为100 μmol/L。③10 μmol/L河豚毒素组：两种细胞混合培养的同时，加入河豚毒素，使其终浓度为10 μmol/L。④阴性对照组：为单纯干细胞培养组。
免疫荧光细胞化学染色：在两种细胞混合培养1周后，用40 g/L多聚甲醛固定细胞，室温孵育30 min，PBS洗涤3次，加入含体积分数0.1% Triton X-100的PBS，置室温作用30 min，再次用PBS洗涤3次，加山羊血清封闭，4 ℃过夜，吸去山羊血清，加一抗(浓度1∶100)，4 ℃过夜，PBS洗涤3次后加荧光二抗(浓度1∶100)，37 ℃孵育30 min，暗室内吸去二抗，PBS洗涤3次后封闭盖玻片，在荧光倒置显微镜下观察各组骨髓间充质干细胞心肌特异性蛋白结蛋白和肌球蛋白的表达情况。
主要观察指标：①大鼠骨髓间充质干细胞体外生长情况及形态学改变。②流式细胞分析鉴定间充质干细胞表型。③大鼠间充质干细胞与心肌细胞混合培养及加入河豚毒素干预后表达心肌特异性蛋白的情况

讨论

实验通过大鼠骨髓间充质干细胞与心肌细胞混合培养，并加入不同浓度河豚毒素阻断相关通道的钠离子电流，证明河豚毒素可以抑制骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化。结果表明钠离子通道或者钠离子电流可能是骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化的重要条件，钠离子通道可能通过改变离子信号调控干细胞向心肌细胞的分化过程。
越来越多的研究表明，钠离子通道不仅仅控制着细胞膜上的离子流，而且还参与细胞多种功能的调控^[33-34] 。Mauro等^[26]去除了小鼠上皮的钠离子通道α亚基，发现去除钠离子通道的小鼠表现为上皮增生、细胞核异常、透明角质颗粒和外皮蛋白的表达和形成异常，提示上皮细胞钠离子通道可能通过影响离子信号来调节与上皮细胞分化相关的某些环节。Scn5a是编码一类钠通道蛋白的基因，有研究发现，Scn5a-/-小鼠胚胎一般会发生自溶死亡，其心脏显示为非协调性收缩，心室腔存在发育性缺陷，表现为心室腔缩小、心室壁小梁形成少、心肌细胞数量少，细胞变薄等^[27] 。这些研究结果提示钠离子通道对心肌细胞发育和心室形态发生有至关重要的作用。
近年来的研究发现多种来源的间充质干细胞均存在钠离子通道^[29，35-36] ，包括小鼠、大鼠和家兔的骨髓间充质干细胞^[31，37-38] ，以及人源骨髓间充质干细胞和脐静脉间充质干细胞等^[32，39] 。Mareschi等^[30]发现羊水来源的间充质干细胞在向神经细胞分化的过程中，钠离子通道的表达量上调，其电生理特性也逐渐和神经细胞的钠离子通道接近。Maltsev等^[40]对胚胎干细胞分化为心肌细胞的整个过程进行了离子通道表达和相应电生理特性的全面鉴定，发现钠离子通道在干细胞分化为心肌细胞的中期开始表达，随着分化时间的推移，钠离子通道密度和钠离子电流密度均明显增加，并且在晚期的心房和心室肌样细胞中占优势。上述研究表明干细胞不但存在着钠离子通道的基础表达，而且在其分化的过程中，钠离子通道的表达量会出现伴随性变化，这种分化过程中钠离子通道的表达变化是分化的调控因素还是仅仅是分化的结果，目前仍没有明确的结论。
实验应用河豚毒素阻断细胞的钠离子电流，发现间充质干细胞向心肌细胞的分化明显受到抑制，尽管实验还不能确认河豚毒素具体是通过阻断间充质干细胞的钠离子通道还是心肌细胞的钠离子通道而发挥干扰作用，但是实验结果证明了间充质干细胞中钠离子通道的表达以及变化可能参与了调控干细胞分化为心肌细胞的
过程。实验结果与上述文献报道的研究结果支持了电生理微环境对细胞的分化，尤其是对心肌细胞的成熟和特异性蛋白的表达具有重要作用。
总之，实验初步揭示了骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的影响因素，证实钠离子通道是骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的必要条件，对于研究干细胞的详细分化调控机制具有重要意义。实验仅观察了细胞形态学和特异性蛋白表达的变化，后续研究中，将会使用膜片钳技术从功能上确立钠通道离子流在干细胞向心肌细胞分化过程中的作用。

文章快阅

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1实验设计构思介绍：越来越多的研究表明，钠离子通道不仅控制着细胞膜上的离子流，而且还参与细胞多种功能的调控及组织细胞的分化和发育，干细胞在体外培养过程中表达河豚毒素敏感性的钠离子通道，钠离子通道是否会影响干细胞向心肌细胞分化尚未见报道，实验采用钠通道阻滞剂河豚毒阻断钠离子流可以初步观察钠通道在干细胞分化为心肌细胞中的作用。
2 国内外同类研究水平的介绍：干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞，大量体内外实验已证实了干细胞在一定条件下可被诱导分化为心肌细胞，但是分化的心肌细胞是否具有同天然心肌细胞一样的功能尚未得知。因此更多的研究开始关注于干细胞离子通道的表达及其电生理特性。近期研究发现多种来源的间充质干细胞均表达河豚毒素敏感性的钠离子通道，钠离子通道不仅控制着细胞膜上的离子流，而且还参与细胞多种功能的调控，并影响组织细胞的分化和发育，这为探讨干细胞多向分化潜能的机制研究提供了一条新的思路。
3与其他同类研究的比较：其他同类研究集中于多种来源的干细胞表达离子通道的种类及其电生理特性观察，对离子通道在干细胞向特定细胞分化过程中的影响并无涉及。实验采用大鼠骨髓间充质干细胞与心肌细胞混合培养的方法诱导干细胞向心肌细胞分化，并在分化过程中使用钠通道阻滞剂河豚毒进行干预，探讨河豚毒素敏感性的钠通道在干细胞向心肌细胞分化中的作用及意义。
4 本文创新性：首次通过使用钠离子通道阻滞剂，研究钠离子通道在间充质干细胞分化为心肌细胞中的作用，实验结果表明钠离子通道或者钠离子电流可能是骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化的必要条件。

钠离子通道阻断剂抑制骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的分化

Sodium channel blockers inhibit the differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells into cardiac-like cells

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