不同矫治正畸作用下牙周骨改建过程中压力侧相关因子的变化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.20.009

摘要/Abstract

摘要：

背景：近年来研究表明核因子κB受体活化因子配体与正畸牙移动骨改建过程中破骨细胞的形成、分化和功能密切相关。
目的：观察不同矫治器正畸作用下兔牙周组织改建过程中压力侧组织核因子κB受体活化因子配体表达的变化，探讨不同矫治器的正畸效果。
方法：将64只健康大耳白兔随机分为4组：对照组、MBT矫治器组、Begg矫治器组、Damon Ⅲ矫治器组，每组16只。MBT矫治器组、Begg矫治器组、Damon Ⅲ矫治器组分别应用对应的矫治器对兔上颌切牙和第一磨牙进行矫治，近中移动牵引力为80 g；对照组不进行矫治。分别于矫治后第3，7，14，21天每组取4只白兔进行检测。
结果与结论：苏木精-伊红染色显示加力后各矫治器组压力侧牙周膜腔变窄，牙槽骨边缘出现骨吸收陷窝。抗酒石酸酸性磷酸酶染色显示，矫治7 d时，骨改建活跃，破骨细胞数量达到高峰；同时实时荧光定量PCR检测发现加力后压力侧牙槽骨组织中核因子κB受体活化因子配体mRNA的表达明显增高，并于加力后第7天达到最高峰，而后逐渐降低。加力第7天时，Damon Ⅲ矫治器组破骨细胞数量和核因子κB受体活化因子配体mRNA表达水平均明显高于MBT矫治器组和Begg矫治器组(P < 0.05)。提示在骨改建过程中核因子κB受体活化因子配体mRNA表达的变化规律与破骨细胞数量相一致，Damon Ⅲ矫治器的矫治效果优于MBT矫治器、Begg矫治器。

关键词: 组织构建, 口腔组织构建, Damon Ⅲ矫治器, MBT矫治器, Begg矫治器, 正畸, 牙周组织, 核因子κB受体活化因子配体, 压力, 破骨细胞

Abstract:

BACKGROUND: Recent studies have shown that receptor activator of nuclear factor-κB ligand is closely related to osteoclast differentiation, formation and function in bone remodeling during orthodontic tooth movement.
OBJECTIVE: To observe the changes in receptor activator of nuclear factor-κB ligand expression in the pressure side during periodontal tissue remodeling under different appliance orthodontics, and to explore the effect of different orthodontic appliances.
METHODS: Sixty-four healthy rabbits were divided into four groups: control group, MBT appliance group, Begg appliance group, Damon Ⅲ appliance group, 16 rabbits in each group. In the MBT appliance group, Begg appliance group and Damon Ⅲ appliance group, corresponding appliances were used to correct the maxillary incisors and first molars respectively, and the mesial movement traction force was 80 g; the control group did not receive correction. Four rabbits were selected from each group for testing at 3, 7, 14 and 21 days after correction.
RESULTS AND CONCLUSION: Hematoxylin-eosin staining showed that the periodontal ligament cavity in the pressure side was narrow and the edge of the alveolar bone exhibited resorption pits. Tartrate-resistant acid phosphatase staining showed bone remodeling was active and the number of osteoclasts reached peak at 7 days after correction. Real-time quantitative PCR showed that the mRNA expression of receptor activator of nuclear factor-κB ligand on the pressure side of the alveolar bone tissue was significantly increased after force loading, and reached peak at 7 days after forcing, then gradually decreased. At 7 days after forcing, the number of osteoclasts and the mRNA expression of receptor activator of nuclear factor-κB ligand in the Damon Ⅲ appliance group were higher than those in the MBT appliance group and Begg appliance group (P < 0.05). In bone remodeling process, mRNA expression of receptor activator of nuclear factor-κB ligand was positively correlated with the number of osteoclasts, and the effect of Damon Ⅲ appliance was better than MBT and Begg appliances.

Key words: tissue construction, oral tissue construction, Damon Ⅲ appliance, MBT appliance, Begg appliance, orthodontics, periodontal tissues, receptor activator of nuclear factor-κB ligand, pressure, osteoclasts

中图分类号:

R318

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图/表（结果） 5

2.1 实验动物数量分析 实验共纳入64只大耳白兔，均进入结果分析。

2.2 不同矫治器正畸作用下兔牙周改建组织的病理学改变 苏木精-伊红染色结合光镜观察见与对照组各时间点相比，MBT矫治器组、Begg矫治器组、Damon Ⅲ矫治器组压力侧牙周膜腔变窄，牙槽骨边缘出现骨吸收陷窝，陷窝内有多核破骨细胞。矫治7 d时，骨改建活跃，压力侧骨吸收陷窝进一步增大，见图1。加力14，21 d时，压力侧骨吸收陷窝中的破骨细胞数量逐渐减少；张力侧新骨沉积厚度进一步增加，新形成骨小梁表面见成骨细胞呈柱状，排列整齐。

2.3 不同矫治器正畸作用下兔牙周改建组织中破骨细胞数量的改变 见图2，见表2。

抗酒石酸酸性磷酸酶染色显示阳性细胞可见红色颗粒，定位于胞浆。多核破骨细胞及少部分单核破骨细胞前体为抗酒石酸酸性磷酸酶染色阳性。显微镜下见加压后，压力侧牙槽骨中破骨细胞数量明显增多；矫治7 d时，骨改建活跃，压力侧骨吸收陷窝进一步增大，破骨细胞数量达到高峰，见图2。加力矫治7- 21 d，Damon Ⅲ矫治器组抗酒石酸酸性磷酸酶染色阳性破骨细胞数量明显高于MBT矫治器组和Begg矫治器组(P < 0.05)，见表2。

2.4 不同矫治器正畸作用下兔牙周改建组织核因子κB受体活化因子配体mRNA的表达 实时荧光定量PCR检测各目的基因的扩增过程(半对数图谱)和熔解曲线，其中核因子κB受体活化因子配体mRNA扩增过程和熔解曲线见图3，4；β-actin mRNA扩增过程及熔解曲线见图5。

实时荧光定量PCR检测各基因表达水平及变化规律发现，与对照组相比，各试验组压力侧牙槽骨组织中核因子κB受体活化因子配体mRNA的表达均明显增高；其表达在加力后的第3-7天随时间的增加而增加，并于加力后第7天达到最高峰，而后逐渐降低，见表3。加力后第7，14，21天时，Damon Ⅲ矫治器组核因子κB受体活化因子配体mRNA表达高于MBT矫治器组和Begg矫治器组(P < 0.05)。

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引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：于2011年2月至2012年2月在保定市第二医院动物实验室完成。

材料：

实验动物：健康清洁级成年纯种新西兰白兔64只，5.0-6.0月龄，雌雄不拘，体质量2.5- 3.0 kg，由山东大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(鲁)2006-0012。实验中对动物的处置方法符合动物伦理学要求。

仪器：

MBT矫治器：购自杭州普特医疗器械有限公司，为MBT直丝弓第三代矫治器。

Begg矫治器：购自杭州普特医疗器械有限公司，为Begg细丝弓矫治器。

Damon Ⅲ矫治器：购自美国ORMCO公司，为Damon Ⅲ自锁托槽矫治器。

方法：

实验动物分组：将64只兔随机分为4组：MBT矫治器组、Begg矫治器组、Damon Ⅲ矫治器组和对照组，每组16只。

正畸牙移动模型的建立及矫治器的安装：所有动物适应性饲养1周。应用体积分数1%的戊巴比妥钠(4 mL/kg)腹腔注射麻醉，使用牙科高速涡轮车针在实验动物左、右侧上颌切牙和第一磨牙龈缘处作一浅的固位沟，用直径0.25 mm镍钛弓丝分别将MBT矫治器、Begg矫治器、Damon Ⅲ矫治器结扎在上颌切牙与第一磨牙之间，使螺旋弹簧产生80 g的拉力，牵引上颌第一磨牙向近中移动。用测力计确定牵引力。各组实验动物相同牙托槽结扎在相同的位置。对照组不进行任何处理。

组织标本的制备：于正畸后第3，7，14，21天处死各组动物，取上颌标本置于体积分数10%甲醛溶液中固定12 h，复合酸脱钙72 h，常规脱水浸蜡，包埋。沿磨牙长轴进行近远中向连续切片，片厚5 μm或8 μm。

苏木精-伊红染色观察牙槽骨组织病理学的改变：将已固定的5 μm厚切片用蒸馏水冲洗，浸入苏木精染液中 5 min。蒸馏水清洗，再浸入体积分数0.5%盐酸乙醇溶液中数秒。蒸馏水冲洗后再置入稀碳酸锂溶液1.0- 2.0 min，取出后放入伊红染液中2 min。浸入体积分数95%乙醇及无水乙醇内脱水，各5 min。显微镜下观察各组牙槽骨组织病理学的改变。

抗酒石酸酸性磷酸酶染色观察压力侧牙槽骨组织破骨细胞数量的改变：取8 μm厚切片，参照日本宝生物公司抗酒石酸酸性磷酸酶染色试剂盒进行染色。反应温度为室温至37 ℃，反应时间为30-45 min或60 min。用甲基绿几秒即可使核染色，水洗后在37 ℃下干燥，经二甲苯透明，经屈大麻酚永久封固。显微镜下计数破骨细胞数目，每张切片随机选取5个视野，面积为0.5 mm× 1.0 mm，计算破骨细胞的平均值。

实时荧光定量PCR检测压力侧牙槽骨组织核因子κB受体活化因子配体mRNA的表达：正畸后第3，7，14，21天，取各组兔第一磨牙压力侧约2 mm宽的牙槽骨组织约100 mg，溶解于1 mL Trizol容易中，参照Takara公司试剂说明书介绍的方法提取牙槽骨组织总RNA，-70 ℃冰箱冻存备用。反转录合成cDNA，按试剂说明书操作，取1 μL总RNA，随机引物0.5 μL，反应总体积10 μL，在M-MLV反转录酶作用下合成cDNA，反应参数为 30 ℃，10 min→2 ℃，30 min→98 ℃，5 min→5 ℃，5 min。所得cDNA -20 ℃保存。实时荧光定量PCR按试剂盒说明书操作，采用荧光染料Cyber green Ⅰ掺入法。反转录所得cDNA为模板，相关引物序列见表1。取上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL，40 μL体系。扩增参数：94 ℃，2 min→(95 ℃，30 s→53 ℃，30 s→72 ℃，30 s→测定荧光值)×40循环→72 ℃，5 min。反应所得为各样品各时间点的荧光值。存储荧光信号，分析mRNA的扩增曲线，做必要的误差分析。以β-actin为内参基因。

主要观察指标：不同矫治器正畸作用下兔压力侧牙槽骨组织的病理改变、破骨细胞数目的变化及牙槽骨组织中核因子κB受体活化因子配体mRNA的表达。

统计学分析：所有数据均以x(_)±s表示，采用SPSS 14.0软件进行统计学分析，组间比较采用重复测量方差分析和t 检验进行统计学检验。P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

Damon Ⅲ矫治器具有美观、舒适、易于维护口腔卫生、矫治过程中矫治力量柔和，正畸牙移动安全以及矫治过程中摩擦力小，支抗损失少等优点，是近期矫治器改良的新方向^[17-21]。研究发现，核因子κB受体活化因子配体是破骨细胞分化、激活及发挥骨吸收活性所必须的^[22-23]。正畸牙移动的过程是一个骨组织改建的过程，包括骨吸收与骨形成。核因子κB受体活化因子配体在诱导压力侧牙周组织中破骨细胞的分化和成熟中发挥重要作用^[23-25]。

最近的研究还证实，核因子κB受体活化因子配体能够直接作用于破骨细胞基质金属蛋白酶9及基质金属蛋白酶抑制剂1，上调金属蛋白酶9/基质金属蛋白酶抑制剂1表达的比率。而基质金属蛋白酶是破骨细胞发挥骨吸收活性和启动骨吸收过程的关键因素^[26-30]。抗酒石酸酸性磷酸酶染色阳性的破骨细胞数也在这个时期达到最高峰。加力后第7天，Damon Ⅲ矫治器组核因子κB受体活化因子配体mRNA表达及抗酒石酸酸性磷酸酶染色阳性破骨细胞数高于MBT矫治器组和Begg矫治器组。因此，从分子生物学角度及骨组织形态计量学角度说明了Damon Ⅲ矫治器的矫治效果优于MBT矫治器和Begg矫治器。

同时研究表明，压力侧牙槽骨核因子κB受体活化因子配体mRNA的变化规律与正畸牙移动过程中抗酒石酸酸性磷酸酶染色阳性的破骨细胞数量及骨改建过程的变化规律相一致。与王威等^[31]对核因子κB受体活化因子配体在大鼠正畸牙移动压力侧牙槽骨改建中的表达及时间分布特点相一致。Kawasaki等^[32]的研究表明成年患者压力侧龈沟液中核因子κB受体活化因子配体的表达低于青少年患者。因此，核因子κB受体活化因子配体mRNA的变化与年龄也存在着一定的联系。

总之，Damon Ⅲ矫治器的的开发、研制是正畸矫治器历史上的一次革命。目前国内外的研究多集中于单一矫治器的骨组织形态计量学分析^[33-40]，而不同矫治器矫治效果之间的比较相关报道较少。实验从分子生物学角度及骨组织形态计量学角度说明了Damon Ⅲ矫治器的矫治效果优于MBT矫治器和Begg矫治器，值得临床应用推广。