补阳还五汤生物碱有效部位对人脐血干细胞体外增殖的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.19.018

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (19): 3533-3537.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.19.018

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补阳还五汤生物碱有效部位对人脐血干细胞体外增殖的影响

蔡咏¹，林金丽²，布林白乙拉³

1湛江市中心医院(广东医学院第二附属医院)普通外科，广东省湛江市 524000
2湛江市第二中医院骨伤科，广东省湛江市 524000
3广州医学院第四附属医院，广东省广州市 511447

收稿日期:2012-09-08 修回日期:2012-10-11 出版日期:2013-05-07 发布日期:2013-05-07
通讯作者: 布林白乙拉，硕士，主任医师，广州医学院第四附属医院，广东省广州市 511447
作者简介:蔡咏，男，1975年生，广东省湛江市人，汉族，1999年广东医学院毕业，副主任医师，主要从事普通外科临床研究。 caiyong2350226@yahoo.cn

Alkaloids of Buyang Huanwu decoction promote the in vitro proliferation of human umbilical cord blood stem cells

Cai Yong¹, Lin Jin-li², Bulinbaiyila³

1 Department of General Surgery, Central People’s Hospital of Zhanjiang (the Second Affiliated Hospital of Guangdong Medical College), Zhanjiang 524000, Guangdong Province, China
2 Department of Orthopedics and Traumatology, Second Chinese Medicine Hospital of Zhanjiang, Zhanjiang 524000, Guangdong Province, China
3 The Fourth Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou 511447, Guangdong Province, China

Received:2012-09-08 Revised:2012-10-11 Online:2013-05-07 Published:2013-05-07
Contact: physician, the Fourth Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou 511447, Guangdong Province, China
About author:Cai Yong, Associate chief physician, Department of General Surgery, Central People’s Hospital of Zhanjiang (the Second Affiliated Hospital of Guangdong Medical College), Zhanjiang 524000, Guangdong Province, China caiyong2350226@yahoo.cn

摘要/Abstract

摘要：

背景：研究表明补阳还五汤对各种细胞均有保护作用，但机制尚不清楚，有研究推测是它的生物碱有效部位起作用。
目的：观察补阳还五汤生物碱有效部位对人脐血干细胞体外增殖的影响。
方法：获取临床健康产妇的新鲜脐血，制备人脐血干细胞悬液，将纯化的人脐血干细胞接种于40个培养皿中进行传代。分组：川芎嗪组给予100 g/L川芎嗪，阿魏酸组给予50 g/L阿魏酸，生物碱有效部位组(川芎嗪+阿魏酸组)给予100 g/L川芎嗪+ 50 g/L阿魏酸；对照组：继续用含体积分数为20%小牛血清的DMEM培养液培养。培养2，4，6，8，10 d观察人脐血干细胞增殖情况；24，72 h后流式细胞仪测定S期细胞的比例，培养10 d后电流钳模式记录细胞静息膜电位变化。
结果与结论：川芎嗪组和阿魏酸组人脐血干细胞的增殖作用不明显，培养10 d时生物碱有效部位组细胞增殖情况明显高于川芎嗪组、阿魏酸组和对照组(P < 0.01)。生物碱有效部位组在培养24，72 h后处于S期的人脐血干细胞明显增多；川芎嗪+阿魏酸组细胞静息膜电位高于川芎嗪组、阿魏酸组和对照组(P < 0.01)。提示补阳还五汤生物碱有效部位能促进人脐血干细胞的体外增殖。

关键词: 干细胞, 干细胞与中医药, 人脐血干细胞, 补阳还五汤, 生物碱有效部位, 细胞增殖, 川芎嗪, 阿魏酸, 静息膜电位, S期, 流式细胞仪, 电流钳模式

Abstract:

BACKGROUND: Studies have shown that Buyang Huanwu decoction has protection effect on various cells, but the mechanism is unclear. Some studies have speculated that the alkaloids of Buyang Huanwu decoction play a role.
OBJECTIVE: To observe the effect of alkaloid of Buyang Huanwu decoction on the in vitro proliferation of human umbilical cord blood stem cells.
METHODS: Fresh umbilical cord blood was obtained from healthy puerperant to prepare the human umbilical cord blood stem cells suspension, then the purified human umbilical cord blood stem cells were seeded into 40 culture dishes for passage. The cells were divided into four groups. The cells in the tetramethylpyrazine group were cultured with 100 g/L tetramethylpyrazine, the cells in the ferulic acid group were cultured with 50 g/L ferulic acid and the cells in the alkaloids group (tetramethylpyrazine+ferulic acid group) were cultured with 100 g/L tetramethylpyrazine and 50 g/L ferulic acid; cells in the control group were continuously cultured with Dulbecco’s modified Eagle’s medium containing fetal bovine serum with the volume fraction of 20%. The proliferation of human umbilical cord blood stem cells were observed after cultured for 2, 4, 6, 8 and 10 days; after cultured for 24 and 72 hours, the ratio of human umbilical cord blood stem cells in S phase was determined by flow cytometry, and after cultured for 10 days, the resting membrane potential changes were recorded with current clamp mode.
RESULTS AND CONCLUSION: The proliferation of human umbilical cord blood stem cells in the tetramethylpyrazine group and ferulic acid group was not obvious; after cultured for 10 days, the proliferation of human umbilical cord blood stem cells in the alkaloids group was significantly higher than that in the tetramethylpyrazine group, ferulic acid group and control group (P < 0.01). After cultured for 24 and 72 hours in the alkaloids group, the number of human umbilical cord blood stem cells in S phase was increased; the resting membrane potential in the alkaloids group was higher than that in the tetramethylpyrazine group, ferulic acid group and control group (P < 0.01). The results indicate that the alkaloid of Buyang Huanwu decoction can promote the proliferation of human umbilical cord blood stem cells.

Key words: stem cells, stem cells and traditional Chinese medicine, human umbilical cord blood stem cells, Buyang Huanwu decoction, alkaloid, cell proliferation, tetramethylpyrazine, ferulic acid, resting membrane potential, S phase, flow cytometry, current clamp mode

中图分类号:

R394.2

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Cai Yong, Lin Jin-li, Bulinbaiyila. Alkaloids of Buyang Huanwu decoction promote the in vitro proliferation of human umbilical cord blood stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(19): 3533-3537.

图/表（结果） 3

参考文献

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引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2011年1至8月在广东医学院实验动物中心完成。

材料：

脐血标本：在产妇知情同意的情况下，经医院伦理委员会批准，获取临床健康产妇的新鲜脐血。

补阳还五汤：由黄芪60 g、赤芍9 g、川芎6 g、当归9 g、地龙9 g、红花9 g和桃仁9 g组成。

实验方法：

补阳还五汤生物碱有效部位川芎嗪和阿魏酸的提取：补阳还五汤生物碱有效部位川芎嗪和阿魏酸由广东医学院中药研究室提取。提取方法参照唐映红等^[15]方法。

制备人脐血干细胞悬液：参照参考文献[16]方法采集脐血单个核细胞，如果在培养过程中发现成纤维细胞生长，给予阿糖胞苷进行纯化培养。在培养过程中用蛋白抗体行免疫组织化学染色鉴定^[6-7]。

人脐血干细胞增殖分析：取上述纯化的人脐血干细胞接种于40个培养皿中进行传代，分组：川芎嗪组给予 100 g/L川芎嗪；阿魏酸组给予50 g/L阿魏酸；川芎嗪+阿魏酸组给予100 g/L川芎嗪+ 50 g/L阿魏酸；对照组：继续用含体积分数为20%小牛血清的DMEM培养液培养。每2 d换培养液1次，共换10 d。在相差显微镜下行形态学观察，每2 d在每个培养皿中随机选取3个视野进行人脐血干细胞计数，做好标记，计数时每视野的标记均位于指针的尖端，并用体积分数为4%的甲醛将细胞固定后行S-100免疫染色，计数染色阳性的细胞。

亚倍体细胞比例的测定：将纯化的1.5 mL人脐血干细胞悬液(浓度约1×10⁹ L^-¹)接种于3.5 cm培养器中，培养24 h后分为对照组、川芎嗪组、阿魏酸组和生物碱有效部位组(川芎嗪+阿魏酸组)，培养72 h后吸取培养液，用D-Hank’s液洗涤1次，0.25%胰酶-0.02%EDTA消化瓶中细胞，待细胞脱离瓶底后滴入血清终止消化，吹打成单细胞悬液，并将悬液移入10 mL离心管，以1 500 r/min离心5 min，弃上清液加入无水乙醇固定细胞。上流式细胞仪(FACS caliiburi，美国BD公司)前取样本细胞悬液，1 500 r/min离心5 min，弃上清液，加入1% Tritonx- 100静置5 min，再次离心弃上清液，加入1%RNA酶，37 ℃水浴、振荡10 min、1 500 r/min离心5 min，弃上清液，加入0.5%PI，避光染色30 min后上机检测(波长480 nm)G₀/G₁期之前的亚二倍体峰。

主要观察指标：补阳还五汤生物碱有效部位对人脐血干细胞增殖的影响；流式细胞仪检测补阳还五汤生物碱有效部位培养人脐血干细胞24，72 h后S期比例；补阳还五汤生物碱有效部位对人脐血干细胞电生理指标的影响。

统计学分析：由第二、三作者采用SPSS 13.0软件进行两样本均数t 检验，实验数据以x(_)±s表示，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

脐血的采集是在新生儿出生以后，贴近母端采集^[17-18]。脐血里含有大量的干细胞，目前脐带干细胞治疗肝脏疾病的研究较多^[19-21]。肝脏疾病因缺血、缺氧、水肿、组织酸中毒及微循环障碍等一系列病理变化，形成以缺氧为中心环节的恶性循环，特别是超氧化物歧化酶、表皮细胞因子降低，脂质过氧化物升高，从而加重继发损伤。氧自由基是一类具有高度化学反应活性的含氧基团，通过氧化及共价结合等方式造成损伤。在生理状态下，机体为维持各种细胞结构和亚细胞结构，可产生氧自由基，但与体内超氧化物歧化酶等抗氧化能力达到平衡而不显毒性。

生物碱有效部位川芎嗪与阿魏酸能提高患病肝脏损伤组织内的超氧化物歧化酶活性，降低脂质过氧化物水平，能使表皮细胞因子保持高水平状态；也改善微循环，促进毛细血管再生和侧支循环的形成，保护病灶区周围的细胞^[22-24]。

流式细胞技术在细胞生物研究中最重要的应用是生物细胞增殖周期的定量分析^[25-26]。通过对细胞DNA进行特异性的荧光标记，常用的荧光染色有PI、EB、AO等，经流式细胞仪测量，获得DNA含量分布的组方图，采用DNA细胞周期分析程序，快速计算生长期分布百分比，用增殖数、M期或S期的百分比以表示细胞群体的增殖状态和DNA的合成速度。DNA细胞增殖周期的分析对反映细胞群体的增殖活性具有重要意义。

实验结果显示，补阳还五汤生物碱有效部位(川芎嗪和阿魏酸)作用24 h时就能够促进人脐血干细胞增殖，这一作用可一直延续10 d。流式细胞仪测定结果也显示，生物碱有效部位(川芎嗪和阿魏酸)组人脐血干细胞增殖活力有明显增高的趋势，川芎嗪和阿魏酸单成分虽然有促进人脐血干细胞增殖作用，但效果不如补阳还五汤生物碱有效部位(川芎嗪和阿魏酸)；这说明补阳还五汤生物碱有效部位(川芎嗪和阿魏酸)对体外培养的人脐血干细胞有促进增殖作用，而有效单成分效果不明显。

细胞电生理记录检测到，川芎嗪组和阿魏酸组细胞静息电位高于对照组，有效组分组细胞静息电位高于川芎嗪组和阿魏酸组，说明有效组分组细胞兴奋性增高，细胞活力高于其他组。

以上作用机制可能与生物碱有效部位(川芎嗪和阿魏酸)内的小分子部位抗氧化^[27]，抑制细胞钙超载^[28-29]，刺激星形胶质细胞分泌生物活性物质有关^[30-31]，其机制有待进一步探讨。

补阳还五汤生物碱有效部位对人脐血干细胞体外增殖的影响

Alkaloids of Buyang Huanwu decoction promote the in vitro proliferation of human umbilical cord blood stem cells

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