人脐血间充质干细胞移植治疗大鼠肝硬化模型

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.19.007

中国组织工程研究

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人脐血间充质干细胞移植治疗大鼠肝硬化模型

詹三华¹，张鲁峰¹，姚卫民¹，杨明辉¹，宋晓玲¹，焦红亮²

1武装警察部队河南省总队医院普内科，河南省郑州市 450052
2郑州大学第一附属医院神经外科，河南省郑州市 450052

收稿日期:2012-08-22 修回日期:2012-09-16 出版日期:2013-05-07 发布日期:2013-05-07
作者简介:詹三华，男，1965年生，河南省汝南县人，汉族，1989年新乡医学院毕业，主任医师，主要从事干细胞移植治疗技术研究。 zhansanhua123456@163.com
基金资助:
河南省武警总队创新基金资助项目

Human umbilical cord blood mesenchymal stem cell transplantation for the treatment of hepatic cirrhosis in rats

Zhan San-hua¹, Zhang Lu-feng¹, Yao Wei-min¹, Yang Ming-hui¹, Song Xiao-ling¹, Jiao Hong-liang²

1 Department of General Medicine, Henan Province Armed Police Hospital, Zhengzhou 450052, Henan Province, China
2 Department of Neurosurgery, the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, Henan Province, China

Received:2012-08-22 Revised:2012-09-16 Online:2013-05-07 Published:2013-05-07
About author:Zhan San-hua, Chief physician, Department of General Medicine, Henan Province Armed Police Hospital, Zhengzhou 450052, Henan Province, China zhansanhua123456@163.com
Supported by:
Innovation Foundation of People's Armed Police Corps of Henan Province*

摘要/Abstract

摘要：

背景：研究表明，脐血间充质干细胞可在特定环境下诱导为肝样细胞，移植入体内能行使正常肝细胞的功能。
目的：应用四氯化碳诱导制作大鼠肝硬化模型，观察脐血间充质干细胞移植对肝硬化模型大鼠的治疗作用。
方法：经四氯化碳诱导制作大鼠肝硬化模型，将20只肝硬化SD大鼠随机分为2组，对照组经尾静脉注射0.5 mL生理盐水，治疗组经尾静脉注射氯甲基苯甲酰胺标记的脐血间充质干细胞混悬液，干细胞量为1×10⁶个。2周后处死所有大鼠，取大鼠静脉血检测肝功能指标，并行肝脏组织切片观察。
结果与结论：肝硬化模型大鼠肝细胞疏松、浊肿，部分细胞变性、坏死，肝小叶结构模糊不清，有多个大小不等的假小叶形成，符合肝硬化诊断标准。与对照组相比，治疗组大鼠血清白蛋白质量浓度显著增高(P < 0.05)，胆红素浓度显著降低(P < 0.05)，转氨酶活性显著降低(P < 0.05)。治疗组大鼠肝脏内有大量氯甲基苯甲酰胺标记的红色脐血间充质干细胞。提示脐血间充质干细胞可通过肝硬化模型大鼠尾静脉有效改善肝组织的生理功能。

关键词: 干细胞, 干细胞移植, 脐血间充质干细胞, 肝硬化, 白蛋白, 胆红素, 转氨酶, 肝功能, 四氯化碳, 大鼠, 省级基金, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Studies have shown that cord blood mesenchymal stem cells can be induced into hepatocyte-like cells in a specific environment, and the transplanted cells can exercise the normal function of liver cells.
OBJECTIVE: To establish the rat model of hepatic cirrhosis induced with carbon tetrachloride, and to observe the therapeutic effect of umbilical cord blood mesenchymal stem cell transplantation on a rat model of hepatic cirrhosis.
METHODS: Hepatic cirrhosis models were established through carbon tetrachloride inducing, then 20 rat models of hepatic cirrhosis were randomly divided into two groups. The control group was injected with 0.5 mL normal saline via the tail vein; the treatment group was injected with chloromethyl benzamide labeled umbilical cord blood mesenchymal stem cell suspension, and the number of the stem cells was 1×10⁶. After 2 weeks, all animals were sacrificed. Liver tissues were obtained for the histological observation and the venous blood was collected to detected the liver function indicators.
RESULTS AND CONCLUSION: The liver cells of the hepatic cirrhosis models were loose and cloudy swelling, part of the cells were degenerated and necrosis, the structure of the hepatic lobule was vague, and several pseudolobules with different sizes were formed which meet the diagnostic criteria of hepatic cirrhosis. Compared with the control group, the level of serum albumin in the treatment group was significantly increased (P < 0.05), while the levels of bilirubin and transaminases in the treatment group were significantly decreased (P < 0.05). There were lots of red chloromethyl benzamide labeled umbilical cord blood mesenchymal stem cells in the liver tissue of the treatment group. Human umbilical cord blood mesenchymal stem cells can effectively improve the physiological function of hepatic cirrhosis through tail vein.

Key words: stem cells, stem cell transplantation, umbilical cord blood mesenchymal stem cells, hepatic cirrhosis, albumin, bilirubin, transaminase, liver function, carbon tetrachloride, rats, provincial grants-supported paper, stem cell photographs-containing paper

中图分类号:

R394.2

詹三华，张鲁峰，姚卫民，杨明辉，宋晓玲，焦红亮. 人脐血间充质干细胞移植治疗大鼠肝硬化模型[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.19.007.

Zhan San-hua, Zhang Lu-feng, Yao Wei-min, Yang Ming-hui, Song Xiao-ling, Jiao Hong-liang. Human umbilical cord blood mesenchymal stem cell transplantation for the treatment of hepatic cirrhosis in rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.19.007.

图/表（结果） 6

2.1 实验动物数量分析 20只SD大鼠分为2组：治疗组和对照组各10只，全部进入结果分析，无脱失。

2.2 大鼠一般情况及肝脏组织观察结果 正常大鼠肝脏色泽红润，表面光滑无结节，肝叶边缘锐利，质地柔软。肝硬化模型大鼠肝脏较正常大鼠肝脏缩小，颜色晦暗，呈棕褐色，表面弥漫大小不等结节，直径为0.2-0.5 cm，肝叶边缘变钝呈波浪形，肝脏质地明显变硬。

苏木精-伊红染色切片光镜下观察：见图1，2。

正常大鼠肝脏见肝小叶结构清晰，肝细胞索规则，肝窦无扩张，肝细胞形态正常，见图1。肝硬化模型大鼠肝脏肝细胞疏松、浊肿，有少许脂肪变，部分细胞变性、坏死，有炎细胞浸润，肝小叶结构模糊不清，有多个大小不等的假小叶形成，符合肝硬化诊断标准，见图2。

2.3 脐血间充质干细胞的观察结果 刚分离的脐血间充质干细胞观察有大量红细胞，换液后，可见贴壁细胞形态呈三角形、梭形，大小不一，交接在一起呈网状。3 d后三角形和梭形细胞集落式生长增殖，10 d基本融合。融合80%时开始传代，传代后脐血间充质干细胞有长突起，细胞长梭形，核椭圆，见图3。

2.4 脐血间充质干细胞的流式细胞仪检测结果 90%的细胞表达CD29，96%的细胞强阳性表达CD44，CD34 阴性表达。证明得到纯度较高的脐血间充质干细胞，见图4，5。

2.5 对照组及治疗组大鼠反应、肝功能和示踪结果

对照组：肝硬化模型大鼠的体质量减轻，毛发微黄、无光泽、凌乱，精神萎靡，反应迟钝，活动减少，进食水均减少。

治疗组：大鼠体质量逐渐增加，毛发逐渐白净、光亮，活动自如，进食水逐渐增加。治疗组大鼠肝脏有大量荧光标记的脐血间充质干细胞，见图6。

血清学检测结果提示，相对于对照组，移植脐血间充质干细胞肝硬化模型大鼠血清白蛋白质量浓度显著增高(P < 0.05)，胆红素浓度显著降低(P < 0.05)，转氨酶活性显著降低(P < 0.05)，见表1。

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引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：于2011年8月在武装警察部队河南省总队医院实验室完成。

材料：20只健康10周龄雄性SD大鼠，体质量300-400 g，由河南省实验动物中心提供。

主要试剂及仪器：

Main reagents and instruments:

方法：

大鼠肝硬化模型制备：食用普通大鼠饲料。按5 mL/kg 剂量予以腹腔注射40%四氯化碳中性植物油溶液，2次/周，持续3周；同时以体积分数10%乙醇溶液为其惟一饮用水。第4周开始改为用50%四氯化碳中性植物油溶液，以5 mL/kg标准腹腔注射，3次/周，持续3周；同时改为以体积分数30%乙醇溶液为其惟一饮用水至实验结束。制备肝硬化大鼠模型时间共计6周。6周后取3只大鼠，取肝脏组织做病理学检查，检验大鼠肝硬化模型制备情况，并与正常大鼠肝脏组织进行对比。

分组：20只肝硬化SD大鼠按随机数字表法分为2组，每组10只。对照组经尾静脉注射生理盐水0.5 mL，治疗组经尾静脉注射氯甲基苯甲酰胺标记的脐血间充质干细胞混悬液，干细胞量为1×10⁶个。

人脐血间充质干细胞的原代分离和培养：足月产胎儿脐血为供者自愿捐献，且得到医院伦理委员会批准。将脐血收集在含有抗凝剂的200 mL采血袋，配平后用离心机离心，2 500 r/min，5 min。将上面的血浆收集在50 mL采血袋内，加入等量的生理盐水，充分混匀。缓慢加入预先加有密度为1.077 g/cm³的淋巴细胞分离液。1 900 r/min水平离心25 min后，弃去上面的液体，小心吸取中间的含有单个核细胞的白膜层。加入生理盐水，1 000 r/min，离心5 min后，洗涤2次，弃上清。所得单核细胞经锥虫蓝染色、光学显微镜下计数活细胞，以1.0×10⁶ L^-¹的细胞浓度接种于含体积分数10%胎牛血清的DMEM/ F12培养基，置于37 ℃、体积分数5%的CO₂饱和湿度培养箱内培养。培养72 h即倾去全部上清液体，以后每3 d全量换液1次，同时记录显微镜下培养细胞的形态变化。

鉴定细胞免疫表型：取第3代脐血间充质干细胞，制成细胞悬液，计数1×10⁶细胞，用PBS洗涤2次，取1 mL液体，脐血间充质干细胞混匀，加入2 μL一抗(CD29- PE，CD44-FITC，CD34-PE)，室温孵育1.5 h，流式细胞仪检测，通过CellQuest软件分析。

荧光染料氯甲基苯甲酰胺标记：将氯甲基苯甲酰胺用二甲基亚砜配成1 g/L溶液。选生长良好的第3代脐血间充质干细胞，0.25%胰蛋白酶消化，用PBS制成细胞悬液，计数按每10⁶细胞加2 μL的量加入氯甲基苯甲酰胺，37 ℃孵育10 min，PBS洗2遍，后重悬备用。

检测肝功和示踪：细胞注入后2周，将大鼠血清送至全自动生化分析仪检测各项指标，分别按照溴甲酚紫法检测血清白蛋白，重氮法检测胆红素，速率法检测转氨酶。

主要观察指标：治疗组与对照组大鼠肝功能指标：谷丙转氨酶、谷草转氨酶、间接胆红素、直接胆红素、白蛋白。

统计学分析：由第一作者采用SPSS 13.0软件完成统计处理，实验数据以x(_)±s表示，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

国内虽然近年临床上在肝硬化的多学科综合治疗方面已取得长足的进步，但肝硬化患者的总体生存率并未得以显著提高。原位肝移植虽已成为终末期肝病最理想的治疗选择，但因供体肝脏紧缺，移植后免疫排斥反应及高昂的医疗费用等限制了其临床上的广泛应用。

干细胞移植是治疗肝功能衰竭的一个新的研究方向^[1-6]，常见的有脐血间充质干细胞、外周血干细胞、胚胎干细胞、骨髓间充质干细胞。目前为止研究表明这些细胞均可在特定环境下诱导为肝样细胞，移植入体内能行使正常肝细胞的功能。脐血间充质干细胞移植治疗肝硬化具有很多优势：脐血间充质干细胞取脐带，取材广泛；脐血间充质干细胞体外分离培养方便，并可通过扩增获取大量移植所需细胞；脐血间充质干细胞免疫原性低，能够有效减少移植后引起的免疫反应。本实验选择鼠尾静脉注射，发现脐血间充质干细胞有效到达肝脏发挥功能。

临床试验表明，Zhang等^[7]应用脐血间充质干细胞治疗肝硬化患者，可以提高肝硬化患者的生存期。动物实验表明，骨髓间充质干细胞注入肝硬化大鼠模型中能有效改善肝脏的生理功能，对临床试验有很好的指导作用^[8-12]。经门静脉及尾静脉移植脂肪间质干细胞对大鼠肝硬化模型有治疗作用，能改善肝功能及肝硬化程度^[13]。临床上应用骨髓间充质干细胞可以明显肝硬化症状体征^[14]。经尾静脉移植人脐带源间充质干细胞，可明显改善四氯化碳诱导肝硬化大鼠的肝纤维化程度^[15]。Zhang等^[16]应用羊膜间充质干细胞治疗大鼠肝硬化模型，可以提高肝硬化模型鼠的生存期。干细胞应用于大鼠肝硬化模型方面具有积极疗效，在安全应用于临床还需要进一步研究，在肝脏组织再生方面有广泛前景^[17-21]。

本实验中注入术后2周，组织病理检查可见新生干细胞及肝小叶。治疗组与对照组肝功能指标相比，血清白蛋白显著增高(P < 0.05)，胆红素显著降低(P < 0.05)，转氨酶显著降低(P < 0.05)。治疗组肝脏内有大量氯甲基苯甲酰胺标记的红色脐血间充质干细胞，表明脐血间充质干细胞对受损肝脏组织有修复作用。

脐血间充质干细胞移植后取得良好的效果，推测可能的修复机制：①激活肝硬化模型中受损的细胞。脐血间充质干细胞能激发高效的肝细胞内源性增生，有效增加肝细胞的数量。②脐血间充质干细胞在大鼠肝脏中分化成正常的肝脏细胞，补充大鼠肝细胞数量，行使正常肝的功能。③降解肝内过量的细胞外基质，降低肝硬化进程。实验证明脐血间充质干细胞高表达基质金属蛋白酶可以降解胶原纤维，逆转肝脏组织纤维化，提高生存率。④脐血间充质干细胞可与大鼠体内肝细胞发生融合，促进细胞增殖分裂增强肝脏功能。⑤脐血间充质干细胞注入后可分泌多种生长因子如肝细胞生长因子、转化生长因子β、白细胞介素。肝细胞生长因子诱导脐血间充质干细胞分化为肝细胞，同时抑制转化生长因子β1的产生，阻止纤维化。

本实验仅为初步研究，对于脐血间充质干细胞在肝内如何定植分布、细胞增殖分化情况及如何表达功能等一系列问题仍未有涉及。但实验结果至少提示，脐血间充质干细胞移植对肝硬化动物模型具有一定的治疗作用。对于目前尚未解决的问题，后续的进一步实验探索具有较大的研究价值。

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