体外培养骨髓干细胞及趋化因子受体CXCR4的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.19.003

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (19): 3437-3442.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.19.003

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体外培养骨髓干细胞及趋化因子受体CXCR4的表达

虞桂平^1，2，沈振亚²，陈国强¹，余云生²，郭士强²

1 东南大学医学院附属江阴医院胸心血管外科，江苏省江阴市 214400 2 苏州大学附属第一人民医院心血管外科，江苏省苏州市 215000

收稿日期:2012-10-16 修回日期:2013-03-15 出版日期:2013-05-07 发布日期:2013-05-07
作者简介:虞桂平☆，男，1980年生，江苏省靖江市人，汉族，苏州大学在读博士，主要从事胸外科基础疾病的研究，现工作于东南大学医学院附属江阴医院胸外科。 xiaoyuer97103@163.com

Bone marrow mesenchymal stem cells cultured in vitro and chemokine receptor CXCR4 expression

Yu Gui-ping^1,2, Shen Zhen-ya², Chen Guo-qiang¹, Yu Yun-sheng², Guo Shi-qiang²

1 Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, Jiangyin Hospital, Medical College of Southeast University, Jiangyin 214400, Jiangsu Province, China 2 Department of Cardiovascular Surgery, First People’s Hospital of Soochow University, Suzhou 215000, Jiangsu Province, China

Received:2012-10-16 Revised:2013-03-15 Online:2013-05-07 Published:2013-05-07
About author:Yu Gui-ping☆, Studying for doctorate, Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, Jiangyin Hospital, Medical College of Southeast University, Jiangyin 214400, Jiangsu Province, China; Department of Cardiovascular Surgery, First People’s Hospital of Soochow University, Suzhou 215000, Jiangsu Province, China xiaoyuer97103@163.com

摘要/Abstract

摘要：

背景：有实验证明骨髓间充质干细胞表面CXCR4的表达水平决定了细胞向靶组织归巢及随后血管生成的效率。
目的：分析骨髓间充质干细胞的分离、培养、鉴定及多向分化潜能，探讨细胞表面CXCR4的表达在促血管再生作用领域的意义。
方法：无菌条件下骨穿针垂直穿刺髂后上棘处抽取猪骨髓，并行分离及培养，得到传代的骨髓间充质干细胞，并行体外细胞凋亡检测，骨髓间充质干细胞表面蛋白CXCR4的检测：并行骨髓间充质干细胞的凋亡周期检测。
结果与结论：实验分离骨髓间充质干细胞的细胞形态比较均一。传代培养后，细胞不再以集落方式生长，而呈分布均匀的纺锤形。细胞在4 d左右开始快速增长，1周后细胞生长进入稳定期。流式细胞仪检测发现细胞表面CXCR4的表达较多。证明实验成功分离骨髓干细胞，CXCR4蛋白在细胞体外培养中明显高表达，提高CXCR4的表达将为骨髓间充质干细胞移植促进血管再生、治疗下肢缺血性疾病提供临床治疗依据。

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 细胞移植, 血管细胞, 下肢动脉远端闭塞, 体外培养, 抗凋亡, 再生技术, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Experiments have demonstrated that the expression level of CXCR4 on bone marrow mesenchymal stem cells determines cell homing to targeted tissue and subsequent angiogenesis.
OBJECTIVE: To analyze the isolation, culture, identification and multi-differentiation potential of bone marrow mesenchymal stem cells and investigate the significance of chemokine receptor CXCR4 expression on bone marrow mesenchymal stem cells in promotion of angiogenesis.
METHODS: Under sterile condition, bone marrow mesenchymal stem cells were isolated, cultured and purified by the while bone marrow adherence method. Cell apoptosis in vitro, CXCR4 protein expression on the bone marrow mesenchymal stem cells were detected, and cell cycle was analyzed.
RESULTS AND CONCLUSION: The isolated bone marrow mesenchymal stem cells exhibited uniform morphology. After passage, cells were spindle-shaped. Cells began to grow rapidly at about 4 days and grew stably 1 week later. Flow cytometry results showed increased CXCR4 expression on bone marrow mesenchymal stem cells. These findings suggest that bone marrow mesenchymal stem cells were successfully isolated, CXCR4 protein was highly expressed on cell surface after in vitro culture, and increased CXCR4 expression will provide theoretical evidence for bone marrow mesenchymal stem cell transplantation in promotion of angiogenesis and treatment of lower limb ischemic diseases in the clinic.

中图分类号:

R394.2

虞桂平，沈振亚，陈国强，余云生，郭士强. 体外培养骨髓干细胞及趋化因子受体CXCR4的表达[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(19): 3437-3442.

Yu Gui-ping, Shen Zhen-ya, Chen Guo-qiang, Yu Yun-sheng, Guo Shi-qiang. Bone marrow mesenchymal stem cells cultured in vitro and chemokine receptor CXCR4 expression[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(19): 3437-3442.

图/表（结果） 4

2.1 骨髓间充质干细胞形态学特征 刚接种的骨髓间充质干细胞悬液中细胞呈圆形，大小不一，难以辨认，并且在细胞中含有少量的造血干细胞及单核细胞等，换液可以除去红细胞，并且每次更换培养液后造血干细胞也随之被去除，在悬浮液培养4 h左右，有部分细胞贴壁生长，成扁平型，培养时间到24 h左右，可以发现部分细胞贴壁，此时更换细胞培养液后可见大部分贴壁细胞散布生长，成梭形，按此方法培养48 h后予以清除悬浮细胞，此时可以发现细胞体积较前变大，并且细胞的排列具备一定方向性，培养10 d左右骨髓间充质干细胞扩增至10⁷ L^-1。12 d左右达到细胞融合，细胞形态比较均一，见图1A，B。传代培养后，细胞不再以集落方式生长，而呈分布均匀的纺锤形，见图1C，D。

2.2 骨髓间充质干细胞的生长特点 培养24 h左右，可见骨髓间充质干细胞数量较前有所增加，但是在前3 d左右以缓慢速度生长，并且在4 d左右以快速增长的方式生长，在1周左右细胞生长进入稳定期，生长相对稳定期，细胞数目增加不明显。此时需分瓶行传代培养。

2.3 骨髓间充质干细胞的细胞周期与凋亡检测 流式细胞仪结果显示，第3代骨髓间充质干细胞中G₀/G₁期的细胞为89.43%，G₂期的细胞为2.82%，S期的细胞为7.65%，大部分细胞处于静止期，只有少数的细胞处于活跃的增殖期，符合间充质干细胞特征，见图3。

2.4 骨髓间充质干细胞表面蛋白CXCR4的检测 骨髓间充质干细胞经过流式细胞仪检测发现细胞表面CXCR4的表达较多。而CXCR4在细胞归巢、穿越血管内皮的迁移和造血干细胞或是祖细胞的迁入起关键作用^[8-9]，见图4。

参考文献

[1] Goldman BI, Wurzel J. Evidence that human cardiac myocytes divide after myocardial infarction. N Engl J Med. 2001;345(15):1131.

[2] Lange C,Brans H, Kluth D,et al.Hepatocytic differentiation of mesenchyrnal stem cells in eocuhures with fetai liver cells. World J Gastroenterol. 2006;12(15):2394-2397.

[3] Woedb D,Schwarz EJ,Prackop DJ,et al. Adutrat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons. J Neurosci Res. 2000;61(4):364-367.

[4] Krampera M,Marconi S,Pasini A,et al. Induction of neural-like differentiation in human mesenehymal stem cells derived from bone marrow, fat, spleen and thymus. Bone. 2007;40(2):382- 385.

[5] Cao Y, Lv G,Yu Y, et al. Liaoning Yixueyuan Xuebao. 2009; 30(2):105-106,115.曹阳,吕刚,于洋,等.趋化因子受体cxcr4在骨髓基质细胞中的表达及分析[J].辽宁医学院学报,2009,30(2):105-106,115.

[6] Zhang S, Jia Z, Ge J, et al. Purified human bone marrow multipotent mesenchymal stem cells regenerate infarcted myocardium in experimental rats. Cell Transplant. 2005; 14(10):787-798.

[7] Abarbanell AM, Coffey AC, Fehrenbacher JW, et al. Proinflammatory cytokine effects on mesenchymal stem cell therapy for the ischemic heart. Ann Thorac Surg. 2009;88(3): 1036-1043.

[8] Meirelles Lda S, Nardi NB. Murine marrow-derived mesenchymal stem cell: isolation, in vitro expansion, and characterization. Br J Haematol. 2003;123(4):702-711.

[9] Lian F, Zhu HS, Zhu W, et al. Isolation, culture and identification of porcine bone marrow mesenchymal stem cells and transformation to myogenic cells in vitro. Shanghai Laboratory Animal Science. 2003;23(2):67-69.

[10] Möhle R, Bautz F, Rafii S, et al. he chemokine receptor CXCR-4 is expressed on CD34+ hematopoietic progenitors and leukemic cells and mediates transendothelial migration induced by stromal cell-derived factor-1. Blood. 1998; 91(12):4523-4530.

[11] Cheng T. Stem cell fate outcomes modulated by the CDK inhibitors. Cell Research. 2008;18:s94.

[12] Kinnaird T, Stabile E, Burnett MS, et al. Marrow-derived stromal cells express genes encoding a broad spectrum of arteriogenic cytokines and promote in vitro and in vivo arteriogenesis through paracrine mechanisms. c Res. 2004; 94(5):678-685.

[13] Tropel P, Noël D, Platet N, et al. Isolation and characterisation of mesenchymal stem cells from adult mouse bone marrow. Exp Cell Res. 2004;295(2):395-406.

[14] Kitano Y, Radu A, Shaaban A, et al. Selection, enrichment, and culture expansion of murine mesenchymal progenitor cells by retroviral transduction of cycling adherent bone marrow cells. Exp Hematol. 2000;28(12):1460-1469.

[15] Tang YL, Zhao Q, Zhang YC, et al. Autologous mesenchymal stem cell transplantation induce VEGF and neovascularization in ischemic myocardium. Regul Pept. 2004;117(1):3-10.

[16] Tang J, Xie Q, Pan G, et al. Mesenchymal stem cells participate in angiogenesis and improve heart function in rat model of myocardial ischemia with reperfusion. Eur J Cardiothorac Surg. 2006;30(2):353-361.

[17] Tang J, Xie Q, Pan G, et al. Mesenchymal stem cells participate in angiogenesis and improve heart function in rat model of myocardial ischemia with reperfusion. Eur J Cardiothorac Surg. 2006;30(2):353-361.

[18] Zhu J, Zhou ZJ, Gong ZL, et al. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2009;13(23):4485-4489.朱洁,周竹娟,龚自力,等.低氧对人骨髓间充质干细胞趋化因子受体CXCR4 和CX3CR1 表达的影响[J].中国组织工程研究与临床康复,2009,13(23):4485-4489.

[19] Pillarisetti K, Gupta SK. Cloning and relative expression analysis of rat stromal cell derived factor-1 (SDF-1)1: SDF-1 alpha mRNA is selectively induced in rat model of myocardial infarction. Inflammation. 2001;25(5):293-300.

[20] Peled A, Kollet O, Ponomaryov T, et al. The chemokine SDF-1 activates the integrins LFA-1, VLA-4, and VLA-5 on immature human CD34(+) cells: role in transendothelial/stromal migration and engraftment of NOD/SCID mice. Blood. 2000;95(11):3289-3296.

[21] Askari AT, Unzek S, Popovic ZB, et al. Effect of stromal-cell-derived factor 1 on stem-cell homing and tissue regeneration in ischaemic cardiomyopathy. Lancet. 2003;362 (9385):697-703.

[22] Clavin NW, Fernandez J, Schönmeyr BH, et al. Fractionated doses of ionizing radiation confer protection to mesenchymal stem cell pluripotency. Plast Reconstr Surg. 2008;122(3): 739-748.

[23] Zhu ZL, Mi N, Li J, et al. Jujie Shoushuxue Zazhi. 2010;19(6): 462-464.朱志立,米娜,李靖,等.趋化因子受体CXCR4在骨髓间充质干细胞中的表达[J].局解手术学杂志,2010,19(6):462-464.

引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2009年7月至2011年6月在苏州大学心血管外科实验室完成。

材料：

实验动物：3月龄健康太湖梅山猪5只，均为雄性，体质量(22.5±2.9) kg，由苏州大学实验动物中心提供，实验动物许可证号：SYXK2007-0035。所有动物的喂养、观察均按照GLP(非临床研究管理规范)规定执行，实验过程中对动物的处置符合医学伦理学标准。

实验方法：

干细胞的培养：采用肌注氯胺酮25 mg/kg和地西泮25 mg/kg诱导麻醉。实验猪采取侧卧位，常规消毒铺巾，无菌条件下骨穿针垂直穿刺髂后上棘处抽取骨髓。18号骨髓穿刺针接内含肝素的无菌注射器，分多点抽取骨髓液。分离培养方法采用密度梯度离心法^[5]：抽取骨髓，加入Lympholyte淋巴细胞分离液，保持两液面之间的明显分界，予以离心机离心20 min，1 500 r/min，离心半径12.5 cm，离心后予以弃上清液，并小心吸取云雾状带内细胞，置入离心，1∶5加入无血清DMEM，快速离心12 min，1 000 r/min，加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液，保持pH 7.2，按1×10⁹ L^-¹细胞浓度接种培养，并将配样瓶置入恒温保湿孵育箱中培养，24 h予以更换培养液，贴壁细胞培养，一般24 h内骨髓间充质细胞贴壁培养，予以更换培养基，定期换液，并去除未贴壁的细胞，在倒置显微镜下观察培养细胞的特征及其培养的情况，一般至2周左右贴壁生长至贴满瓶底时予以0.25%胰蛋白酶室温下消化5-10 min，按1∶3比例传代培养，由此得到间充质干细胞，待传至第4代后，备移植用。通过本方法培养得到的细胞经长期传代后仍具有多能转化活性，确系骨髓间质干细胞^[8]。骨髓间充质干细胞以4×10⁴ L^-¹浓度接种于24孔板21个孔中，每孔1 mL，从接种时算起，每隔24 h取3孔，连续取7 d，经0.25%胰酶充分消化后以1 000 r/min速度离心5 min，计数各孔内的细胞浓度，算出平均值，根据细胞计数结果以培养时间(d)为横坐标、细胞浓度为纵坐标绘制细胞生长曲线图。

体外细胞凋亡检测：将传至第2代细胞完全汇合后予以0.25%胰蛋白酶消化贴壁细胞5-10 min，牛血清终止反应。加入含血清DMEM培养基至12 mL。将消化下来的干细胞加入培养板中，每隔三四天换液，行体外凋亡检测。0.25%胰蛋白酶消化贴壁细胞，细胞消化下来后用无菌PBS冲洗2遍。取1 mL的5×annexinV加入4 mL去离子蒸馏水中配成缓冲液。将洗净的细胞用新配成的缓冲液重悬，调整细胞悬液的细胞浓度为1×10⁹ L^-¹。将调整好的细胞每份取100 μL。每100 μL细胞悬液中分别加入 1 μL 100 mg/L的PI，5 μL Alexa Flour 488 annexinV。室温避光孵育15 min。孵育结束后每100 μL细胞悬液中加入配好的缓冲液400 μL，轻轻混匀，置于冰水中等待上机检测。调整好流式细胞仪后检测样品。

骨髓间充质干细胞表面蛋白CXCR4的检测：体外流式细胞仪检测表面表达CXCR4的骨髓间充质干细胞的数量^[6]，0.25%胰蛋白酶消化贴壁细胞，行体外骨髓间充质干细胞表面蛋白检测，细胞消化下来后用无菌PBS冲洗2遍。将洗净的细胞用新配成的缓冲液重悬，调整细胞悬液的细胞浓度为1×10⁹ L^-¹。

骨髓间充质干细胞的细胞周期检测：取第3代大鼠骨髓间充质干细胞，0.25%胰蛋白酶室温消化后制成细胞悬液，收集大约1×10⁶个细胞，4 ℃预冷，用体积分数70%乙醇固定30 min，PBS冲洗3次，50 mg/L RNA酶0.3 mL，37 ℃处理30 min，将细胞悬液移入流式细胞仪专用试管，加入50 mg/L的碘化丙啶(PI)0.4 mL，4 ℃避光染色30 min，流式细胞仪检测^[7]。

主要观察指标：分离的骨髓间充质干细胞的细胞形态、生长分化规律以及细胞周期。同时体外流式细胞仪检测细胞表面CXCR4的表达。

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Bone marrow mesenchymal stem cells cultured in vitro and chemokine receptor CXCR4 expression

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[1]	蒲锐, 陈子扬, 袁凌燕. 不同细胞来源外泌体保护心脏的特点与效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 1-.
[2]	张秀梅, 翟运开, 赵杰, 赵萌. 类器官模型国内外数据库近10年文献研究热点分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1249-1255.
[3]	王正东, 黄娜, 陈婧娴, 郑作兵, 胡鑫宇, 李梅, 苏晓, 苏学森, 颜南. 丁酸钠抑制氟中毒可诱导小胶质细胞活化及炎症因子表达增多[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1075-1080.
[4]	汪显耀, 关亚琳, 刘忠山. 提高间充质干细胞治疗难愈性创面的策略[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1081-1087.
[5]	万然, 史旭, 刘京松, 王岩松. 间充质干细胞分泌组治疗脊髓损伤的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1088-1095.
[6]	廖成成, 安家兴, 谭张雪, 王倩, 刘建国. 口腔鳞状细胞癌干细胞的治疗靶点及应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1096-1103.
[7]	谢文佳, 夏天娇, 周卿云, 刘羽佳, 顾小萍. 小胶质细胞介导神经元损伤在神经退行性疾病中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1109-1115.
[8]	李珊珊, 郭笑霄, 尤冉, 杨秀芬, 赵露, 陈曦, 王艳玲. 感光细胞替代治疗视网膜变性疾病[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1116-1121.
[9]	焦慧, 张一宁, 宋雨晴, 林宇, 王秀丽. 乳腺癌类器官研究进展及临床应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1122-1128.
[10]	王诗琦, 张金生. 中医药调控缺血缺氧微环境对骨髓间充质干细胞增殖、分化及衰老的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1129-1134.
[11]	曾燕华, 郝延磊. 许旺细胞体外培养及纯化的系统性综述[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1135-1141.
[12]	孔德胜, 何晶晶, 冯宝峰, 郭瑞云, Asiamah Ernest Amponsah, 吕飞, 张舒涵, 张晓琳, 马隽, 崔慧先. 间充质干细胞修复大动物模型脊髓损伤疗效评价的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1142-1148.
[13]	侯婧瑛, 于萌蕾, 郭天柱, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理激活HIF-1α/MALAT1/VEGFA通路促进骨髓间充质干细胞生存和血管再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 985-990.
[14]	史洋洋, 秦英飞, 吴福玲, 何潇, 张雪静. 胎盘间充质干细胞预处理预防小鼠毛细支气管炎[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 991-995.
[15]	梁学奇, 郭黎姣, 陈贺捷, 武杰, 孙雅琪, 邢稚坤, 邹海亮, 陈雪玲, 吴向未. 泡状棘球绦虫原头蚴抑制骨髓间充质干细胞向成纤维细胞的分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 996-1001.