胰岛素样生长因子1对骨髓间充质干细胞软骨分化及基质金属蛋白酶表达的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.19.001

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (19): 3421-3429.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.19.001

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胰岛素样生长因子1对骨髓间充质干细胞软骨分化及基质金属蛋白酶表达的影响

邬波，马旭，朱大木，刘素媛，王景续，张毅，付爱民，潘梁

沈阳市骨科医院关节外科，辽宁省沈阳市 110044

收稿日期:2012-12-07 修回日期:2013-03-06 出版日期:2013-05-07 发布日期:2013-05-07
通讯作者: 邬波★，男，1962年生，汉族，吉林省大安市人，2002年中国医科大学毕业，硕士，主任医师，博士生导师，主要从事创伤骨科、脊柱与关节外科研究。 wabc967@126.com
作者简介:邬波★，男，1962年生，汉族，吉林省大安市人，2002年中国医科大学毕业，硕士，主任医师，博士生导师，主要从事创伤骨科、脊柱与关节外科研究。 wabc967@126.com
基金资助:
课题受沈阳市科技计划资助项目(F11-262-9-30)资助

Effect of insulin-like growth factor-1 on chondrogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells and expression of matrix metalloproteinase

Wu Bo, Ma Xu, Zhu Da-mu, Liu Su-yuan, Wang Jing-xu, Zhang Yi, Fu Ai-min, Pan Liang

Department of Joint Surgery, Orthopaedic Hospital of Shenyang, Shenyang 110044, Liaoning Province, China

Received:2012-12-07 Revised:2013-03-06 Online:2013-05-07 Published:2013-05-07
Contact: Wu Bo, Master, Chief physician, Doctoral supervisor, Department of Joint Surgery, Orthopaedic Hospital of Shenyang, Shenyang 110044, Liaoning Province, China wabc967@126.com
About author:Wu Bo★, Master, Chief physician, Doctoral supervisor, Department of Joint Surgery, Orthopaedic Hospital of Shenyang, Shenyang 110044, Liaoning Province, China
Supported by:
Science and Technology Projects of Shenyang City, No. F11-262-9-30*

摘要/Abstract

摘要：

背景：以往促进骨髓间充质干细胞软骨分化的研究，多将胰岛素样生长因子1作为辅助因子与其他细胞因子联合应用，而胰岛素样生长因子1单独应用能否促进骨髓间充质干细胞分泌软骨特异性胶原仍存在争议，其对骨髓间充质干细胞软骨分化及软骨胶原纤维稳定性的影响尚不清楚。
目的：观察胰岛素样生长因子1对骨髓间充质干细胞软骨分化以及基质金属蛋白酶表达的影响。
方法：构建含有胰岛素样生长因子1基因完整编码区的表达载体，稳定转染至大鼠骨髓间充质干细胞，设为胰岛素样生长因子1稳定转染组，同时设未转染组作对照。
结果与结论：MTT检测结果显示，实验成功筛选得到胰岛素样生长因子1稳定过表达的骨髓间充质干细胞，转染后4 d，细胞增殖能力显著增强(P < 0.05)。RT-PCR，Western blot法及免疫细胞化学检测结果显示，与未转染组相比，胰岛素样生长因子1稳定转染组细胞胰岛素样生长因子1，Ⅱ型胶原 mRNA和蛋白的表达水平均显著升高(P < 0.01)，基质金属蛋白酶1，2，3 mRNA表达显著降低(P < 0.01)。结果证实，单独应用胰岛素样生长因子1能够有效促进骨髓间充质干细胞的增殖以及软骨分化，并维持软骨胶原纤维的稳定性。

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 胰岛素样生长因子1, 骨髓间充质干细胞, 载体构建, 细胞增殖, 软骨分化, Ⅱ型胶原, 基质金属蛋白酶, 组织工程软骨, 其他基金, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Studies have shown that insulin-like growth factor-1 serves as a helper factor and is combined combines with other factors to promote the differentiation of bone marrow mesenchymal stem
cells into chondrocytes. However, whether insulin-like growth factor-1 alone could promote the secretion of cartilage specific collagen remains controversial, and its effect on cell proliferation and stability of cartilage collagenfiber has been rarely reported.
OBJECTIVE: To investigate the effect of insulin-like growth factor-1 on chondrogenic differentiation and matrix metalloproteinase expression of bone marrow mesenchymal stem cells.
METHODS: The expression vector carrying complete coding sequence of insulin-like growth factor-1 was constructed, and stably transfected to rat bone marrow mesenchymal stem cells, serving as insulin-like growth factor-1 stable transfection group. Meanwhile, the non-transfection group was taken as the control.
RESULTS AND CONCLUSION: The 3-(4,5)-dimethylthiahiazo-2-yl-3,5-di-phenytetrazoliumromide assay showed that, insulin-like growth factor-1 stable expressing bone marrow mesenchymal stem cells was successfully established, and cell proliferation was significantly increased after 4 days of transfection (P < 0.05). Reverse transcription-polymerase chain reaction, western blot analysis and immunocytochemistry detection showed that, the mRNA and protein levels of insulin-like growth factor-1 and collagen type Ⅱ were significantly increased in the stable transfection group (P < 0.01), while mRNA levels of matrix metalloproteinase-1, -2 and -3 were significantly decreased compared with the non-transfection group (P < 0.01). Experimental findings confirm that, insulin-like growth factor-1 alone can promote the proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells as well as chondrogenic differentiation, and maintain the stability of collagen fibers.

Key words: stem cells, bone marrow-derived stem cells, insulin-like growth factor-1, bone marrow mesenchymal stem cells, vector construction, cell proliferation, chondrogenic differentiation, collagen type Ⅱ, matrix metalloproteinase, tissue-engineered cartilage, other grants-supported paper, stem cell photographs-containing paper

中图分类号:

R394.2

邬波，马旭，朱大木，刘素媛，王景续，张毅，付爱民，潘梁. 胰岛素样生长因子1对骨髓间充质干细胞软骨分化及基质金属蛋白酶表达的影响[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(19): 3421-3429.

Wu Bo, Ma Xu, Zhu Da-mu, Liu Su-yuan, Wang Jing-xu, Zhang Yi, Fu Ai-min, Pan Liang. Effect of insulin-like growth factor-1 on chondrogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells and expression of matrix metalloproteinase[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(19): 3421-3429.

图/表（结果） 4

2.1 胰岛素样生长因子1载体的鉴定结果 以大鼠总RNA为模板扩增得到单一明亮的谱带，大小约455 bp，与预期长度一致，见图1。经DNAMAN6.0软件分析比对，测序结果与已NCBI数据库公布的大鼠胰岛素样生长因子1的序列同源性为100%，表明已成功获得胰岛素样生长因子1的翻译区。

实验提取pUM-胰岛素样生长因子1质粒DNA进行PCR，结果同样获得与预期大小一致的谱带，见图1B，双酶切结果分别得到胰岛素样生长因子1短片段与质粒载体长片段，见图1C，测序结果完全正确，表明成功获得了胰岛素样生长因子1表达载体pUM-IGF-1。

2.2 大鼠骨髓间充质干细胞的鉴定 流式细胞术分析结果表明，所分离细胞CD44阳性率为99.04%，CD45阳性率为4.75%，CD90阳性率为98.78%。表明所培养的长梭形细胞确为骨髓间充质干细胞，可以用于后续实验。 2.3 转染胰岛素样生长因子1基因后大鼠骨髓间充质干细胞的增殖 连续7 d对细胞进行MTT增殖检测，读取各组细胞在450 nm处的吸光度值绘制细胞生长曲线，结果见图3。骨髓间充质干细胞的生长曲线整体呈S型，转染后1-3 d为潜伏期，细胞生长较为缓慢，3 d时进入对数生长期，4 d以后胰岛素样生长因子1稳定转染组的细胞增殖能力显著高于未转染组，差异有显著性意义 (P < 0.01)。

2.4 转染胰岛素样生长因子1基因后大鼠骨髓间充质干细胞胰岛素样生长因子1的表达 胰岛素样生长因子1的表达检测结果如图4。

胰岛素样生长因子1稳定转染组胰岛素样生长因子1 mRNA及蛋白的表达分别为未转染组的1.88和1.98倍(P < 0.01)，表明胰岛素样生长因子1在骨髓间充质干细胞中得到了稳定的高表达。

2.5 转染胰岛素样生长因子1基因后大鼠骨髓间充质干细胞Ⅱ型胶原的表达

RT-PCR及Western blot的检测结果：RT-PCR及Western blot的检测结果均可见单一的特异性谱带，且大小与预期一致，见图5。与未转染组相比，胰岛素样生长因子1稳定转染组Ⅱ型胶原 mRNA以及蛋白的表达均升高 (P < 0.01)。

免疫细胞化学染色结果：胰岛素样生长因子1稳定转染组细胞染色明显加深，见图6，表明胰岛素样生长因子1转染的细胞表达Ⅱ型胶原的能力显著提高。

2.6 转染胰岛素样生长因子1基因后大鼠骨髓间充质干细胞基质金属蛋白酶的表达 RT-PCR检测基质金属蛋白酶的表达结果见图7，与未转染组相比，胰岛素样生长因子1稳定转染组基质金属蛋白酶1，2，3 mRNA的表达降低(P < 0.01)。

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引言

软骨损伤可造成关节疼痛、畸形甚至功能障碍，严重影响患者的生活质量。然而，软骨组织的修复与再生能力较弱，普遍认为直径大于4 mm的损伤则不能自行修复且损伤后易发展为退行性变^[1]。传统的软骨损伤治疗方法包括关节成形、自体软骨膜或骨膜移植等，但均存在着一定的局限性，治疗效果均不够理想^[2]。

与传统方法相比，软骨组织工程其所需供体组织较少，避免了患者的再次损伤，可根据修复的需要改变植入物的结构，同时能够减少免疫排斥反应。因此，软骨组织工程受到了广大医疗工作者的广泛关注。骨髓间充质干细胞具有分化为骨、软骨、肌腱及脂肪等多项分化潜能^[3]，且增殖传代能力较强，免疫应答耐受性好，在软骨组织工程中作为种子细胞得到了广泛应用^[4]，然而骨髓间充质干细胞并不能自发的分化为软骨细胞，所以加入诱导因子促进其软骨分化成为软骨组织工程学研究的重要课题。

胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)是软骨发育过程中一个重要的生长因子，能够促进软骨细胞增殖，并且刺激细胞分泌细胞外基质，维持蛋白聚糖的代谢并且在转录水平调节Ⅱ型胶原表达而在软骨缺损治疗中发挥重要作用^[5]。以往在促进骨髓间充质干细胞软骨分化的研究中多将胰岛素样生长因子1作为辅助因子与其他细胞因子联合应用^[6-7]，而胰岛素样生长因子1单独应用能否促进骨髓间充质干细胞分泌软骨特异性胶原仍存在争议^[8-9]。实验拟采用基因工程手段建立胰岛素样生长因子1稳定过表达的骨髓间充质干细胞，并对其软骨特异性胶原的分泌情况进行探讨，明确胰岛素样生长因子1在成软骨分化中的作用。

基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)为一组能够降解所有细胞外基质成分的蛋白酶家族。正常情况下，关节软骨基质的分解和合成代谢是通过分解性细胞因子和合成性细胞因子的平衡来维持的，在此过程中基质金属蛋白酶与其特异性组织抑制剂发挥着重要作用，基质金属蛋白酶的过度分泌将引起软骨细胞外基质的降解，诱发骨性关节炎的发生^[10]。已有研究报道胰岛素样生长因子1能够调控软骨细胞中基质金属蛋白酶的表达^[11]，而在骨髓间充质干细胞中其能否抑制基质金属蛋白酶的表达而维持胶原的稳定性还未见报道。

实验拟进一步观察胰岛素样生长因子1对骨髓间充质干细胞基质金属蛋白酶表达的影响，探讨其在维持胶原纤维稳定性中的作用，为软骨组织工程研究提供实验依据。

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：于2011年5月至2012年10月于中国医科大学中心实验室完成。

材料：

实验动物：健康三四周龄SD大鼠12只，雌雄不限，体质量约100 g，购自辽宁长生生物技术有限公司，动物许可证号：0003759，用于骨髓间充质干细胞的分离。

载体：pUM-T Simple Vector购自北京百泰克生物技术有限公司。

菌种：大肠杆菌BL21感受态细胞购自北京天根生化科技有限公司。

大鼠骨髓间充质干细胞增殖及分化检测应用的相关试剂及仪器：

Main experimental reagents and instruments:

实验方法：

胰岛素样生长因子1载体的构建：查找NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，设计大鼠胰岛素样生长因子1编码区扩增引物并分别引入Xho Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位点。分别采用总RNA提取试剂盒提取大鼠肝组织总RNA，RT试剂盒反转录成cDNA。以cDNA为模板进行PCR反应，在200 μL反应管中加入cDNA 1 μL，上、下游引物各1 μL，2×Taq PCR Master-mix 10 μL，ddH₂O补足总体积至20 μL，PCR反应程序为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃ 5 min。反应结束后于1.0%琼脂糖凝胶进行电泳并回收产物进行测序鉴定。

配制连接反应体系如下：纯化PCR产物10 μL，纯化pUM-T Simple酶切产物2 μL，10×Buffer 2 μL，T₄ DNA Ligase 1 μL，ddH₂O补足总体积至20 μL，16 ℃连接过夜。将连接产物转化大肠杆菌，37 ℃培养过夜后挑取单菌落进行PCR以及双酶切鉴定，若所得片段大小与预期一致则为阳性产物。

胰岛素样生长因子1引物序列：

Insulin-like growth factor-1 (IGF-1) primer sequences:

大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及鉴定：麻醉后颈椎脱臼法处死大鼠，无菌条件下取出股骨和胫骨，于超净工作台上剪断股骨和胫骨骨干两端，暴露骨髓腔。用 2 mL注射器吸取L-DMEM培养液反复冲洗骨髓腔，收集冲洗液并吹打制成均匀的细胞悬液。将骨髓细胞悬液缓慢加入HISTOPAQUE-1083分离液液面上， 3 000 r/min离心30 min。吸取白膜层细胞，1 800 r/min 离心10 min。加入含体积分数10% FBS的DMEM/F12培养液悬浮细胞，调整细胞浓度至2×10⁹ L^-¹，接种于25 cm²培养瓶中，置于37 ℃、体积分数5%CO₂饱和湿度的细胞培养箱中培养，每隔3-5 d全量换液1次，待细胞长至70%-80%融合进行消化传代。取传至第2代的细胞，分别加入荧光标记的CD44，CD45，CD90抗体，避光孵育30 min，流式细胞仪检测。

大鼠骨髓间充质干细胞转染及稳转细胞系的筛选：将传至第3代的细胞接种于6孔板，置于细胞培养箱中培养，待细胞长至单层后进行转染。在240 μL无血清培养基中加入10 μL Lipofectamine 2000试剂，室温静置 5 min，另外再将10 μL质粒DNA加入240 μL无血清DMEM培养液中，将上述两溶液混合，室温孵育20 min，逐滴加入细胞培养板中，置于细胞培养箱培养，5 h后吸弃转染试剂，加入体积分数10%FBS的DMEM/F12培养液继续培养。24 h后换液为含G418 800 mg/L的筛选培养液，每隔两三天全量换液1次，未转染组(空白对照组)中加入等量的G418置于同等条件下培养，待未转染组正常细胞完全死亡后将胰岛素样生长因子1稳定转染组中的细胞克隆消化接种至新的培养板。采用维持剂量的G418继续筛选，培养14 d后更换为DMEM完全培养液扩大培养。

MTT法绘制细胞生长曲线：DMEM完全培养液重悬细胞并计数，按1×10⁸ L^-¹的细胞浓度将细胞接种至96孔板，置于细胞培养箱中培养，24 h后加入质量浓度为5 g/L的MTT溶液20 μL，继续培养4 h，弃去培养液，加入DMSO 100 μL/孔，室温孵育5 min后于酶标仪上测定450 nm波长处的吸光度值，绘制细胞生长曲线。

免疫细胞化学法检测大鼠骨髓间充质干细胞Ⅱ型胶原的表达：将无菌盖玻片置于6孔板内进行细胞爬片，待细胞长至70%-80%融合时取出盖玻片，PBS洗涤细胞2次并进行乙醇固定冻存。将盖玻片粘固于载玻片上，体积分数3%H₂O₂灭活内源性过氧化物酶，兔血清封闭20 min，加入按1∶100稀释的Ⅱ型胶原多克隆抗体孵育2 h，加入生物素化的山羊抗兔IgG，20 min后滴加过氧化物酶标记的链霉亲和素，DAB显色，苏木精复染，脱水，透明，封固，置于光学显微镜下观察拍照。

RT-PCR检测大鼠骨髓间充质干细胞胰岛素样生长因子1、Ⅱ型胶原、基质金属蛋白酶1，2，3 mRNA的表达：利用总RNA提取试剂盒提，采用TRIzol法提取细胞总RNA，采用RT试剂盒将总RNA反转录为cDNA。分别设计并合成胰岛素样生长因子1，Ⅱ型胶原、基质金属蛋白酶1，2，3的检测引物如下。

在200 μL反应管中加入cDNA 1 μL，上、下游引物各1 μL，2×Taq PCR Master-mix 10 μL，ddH₂O补足总体积至20 μL，PCR反应程序为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃ 5 min。PCR产物于1.2%琼脂糖凝胶上进行电泳。

Western blot检测大鼠骨髓间充质干细胞胰岛素样生长因子1及Ⅱ型胶原蛋白的表达：取40 μg总蛋白加入上样缓冲液，调整上样总体积至20 μL，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结束后电转移至PVDF膜上。体积分数5%脱脂奶粉室温封闭1 h，PBS洗膜5次。分别加入1∶800稀释的山羊抗大鼠胰岛素样生长因子1多克隆抗体和1∶1 000稀释的Ⅱ型胶原多克隆抗体，于4 ℃孵育过夜，PBS洗膜5次。加入1∶10 000倍稀释的驴抗山羊HRP标记二抗，37 ℃孵育1 h，ECL法进行底物发光，曝光成像并扫描入电脑。

主要观察指标：大鼠骨髓间充质干细胞转染后胰岛素样生长因子1，Ⅱ型胶原，基质金属蛋白酶1，2，3的表达。

统计学分析：计量资料以x(_)±s表示，实验重复3次，采用SPSS 16.0软件进行数据分析，组间均数差异比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

骨髓间充质干细胞因子具有多向分化潜能，均一性好，增殖能力强，易于在短时间内获得充足的种子细胞，且细胞性状以及分化特性不会随传代扩增而丢失，目前已成为骨、软骨以及神经等组织修复与重建领域最具发展潜力的种子细胞之一^[12-13]。

研究表明，骨髓间充质干细胞的表面抗原具有多样性，贴壁后能够表达SH2、SH3，CD29，CD44，CD71，CD90，CD44，CD71，CD106，CD120a以及CD124等多种表面蛋白，而不表达CD1a，CD31，CD34，CD14，CD45和CD56^[9]，近年来，有学者进一步明确，扶绥间充质干细胞的独特表征为：CD29，CD44，CD166阳性，而CD34，CD45，HLADR阴性^[12]。实验采用HISTOPAQUE-1083分离液分离了大鼠骨髓间充质干细胞，经流式细胞术鉴定其CD44，CD90呈阳性表达而CD45表达阴性，表明成功获得了脊髓间充质干细胞，所得细胞可以用于后续实验。

在体外培养环境中，骨髓间充质干细胞并不会自发的向特定方向分化^[14]，因此，在干细胞培养环境中引入诱导因素支持其向特定表型分化并最终发挥相应生理功能成为组织工程学研究中的重要课题。骨髓间充质干细胞不仅易于外源基因的转染而且能够稳定表达外源基因，因此利用基因工程技术将主要的诱导分化因子转入骨髓间充质干细胞，使外源基因在一定时期内高表达，能够进一步促进其分化和维持表型的稳定性。胰岛素样生长因子1为丝裂素类生长因子，具有促进细胞有丝分裂、加速细胞分化增殖、提高细胞成熟度的作用^[15]。

最新研究表明，胰岛素样生长因子1注射能够有效抑制软骨移植后的免疫反应^[16]，在体外培养的软骨细胞中加入胰岛素样生长因子1不仅能够促进细胞分裂，还能够有效抑制软骨细胞在CL胶中的迁移^[17]。将胰岛素样生长因子1单独应用于体外培养的兔关节软骨细胞，结果细胞增殖能力显著增强^[18]，胰岛素样生长因子1转染的脂肪间充质干细胞增殖能力显著增强且软骨细胞外基质糖胺聚糖的分泌显著增多^[19]，实验采用分子生物学手段构建了胰岛素样生长因子1表达载体并建立了稳定过表达的骨髓间充质干细胞系，为组织工程研究提供了有力的实验工具，而胰岛素样生长因子1转染的骨髓间充质干细胞增殖能力显著增强，进一步证明了胰岛素样生长因子1在组织工程研究中的应用潜力。

软骨细胞为终末分化细胞，增生能力极弱，且体外培养时表型难以保持稳定，容易失去其固有的生物学特征。蛋白聚糖和Ⅱ型胶原为软骨细胞基质分泌功能以及保持分化状态的标志物。胰岛素样生长因子1是最早被确认为对软骨细胞自分泌作用具有调节功能的生长因子，其不仅能够诱导软骨细胞Ⅱ型胶原和蛋白聚糖基因的表达^[20]，刺激细胞分裂，还能够促进Sox-9的表达，调控软骨分化^[21-22]，保持软骨细胞分化表型的稳定性^[23]，同时还具有抑制胶原酶引起的软骨细胞凋亡的作用^[24]。而以往对于胰岛素样生长因子1的研究多集中于软骨细胞，在骨髓间充质干细胞中单独应用胰岛素样生长因子1的研究较少。晏杰等^[8]在体外培养的骨髓间充质干细胞中单独加入胰岛素样生长因子1，培养7，4，12 d后检测，均未检测到Ⅱ型胶原的表达，Nixon等^[25]采用病毒载体将胰岛素样生长因子1转染入骨髓间充质干细胞，结果细胞Ⅱ型胶原的表达显著提高。实验对胰岛素样生长因子1稳定转染的骨髓间充质干细胞进行检测，结果其Ⅱ型胶原表达显著升高，与Nixon等^[25]的结论一致，提示胰岛素样生长因子1在骨髓间充质干细胞向软骨分化以及软骨细胞合成代谢中具有显著的促进作用。

基质金属蛋白酶广泛存在于各结缔组织中，在细胞外基质的生理和病理性降解过程中发挥着重要作用。已有多项研究表明基质金属蛋白酶活性的增加能够引起细胞外基质合成-降解平衡的失调，导致软骨生物力学功能的降低^[26]。根据作用底物的不同，机制金属蛋白酶可分为胶原酶(基质金属蛋白酶1，8，13)、基质溶解素(基质金属蛋白酶3，7，10，11)、明胶酶(基质金属蛋白酶2，9)等^[27]。基质金属蛋白酶1在软骨退行性变中表达最为稳定，其表达量与软骨退变程度呈正相关^[28]。基质金属蛋白酶1不仅能够直接降解Ⅱ型胶原还能够介导其他基质金属蛋白酶对Ⅱ型胶原的降解^[29]，所以基质金属蛋白酶1的变化能够明显反应软骨基质中Ⅱ型胶原的代谢情况。有报道指出，胰岛素样生长因子1能够通过抑制基质金属蛋白酶的表达而抑制胶原以及软骨的退化^[30-31]。实验结果表明，胰岛素样生长因子1转染的细胞中基质金属蛋白酶1，2，3 mRNA的表达均显著降低，提示胰岛素样生长因子1不仅能够促进骨髓间充质干细胞的软骨分化，对软骨胶原纤维的稳定性也具有一定的保护作用。

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1实验设计及文章构思：

软骨损伤在临床上较为常见，但是因软骨组织的自我修复与再生能力较弱，给临床软骨损伤的治疗带来极大挑战，而组织工程的发展为软骨损伤的修复带来了希望。目前组织工程研究主要集中于种子细胞、载体材料以及细胞因子的选择三个方面。骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能，且增殖能力强，细胞均一性好，成为最具潜力的种子细胞之一。有报道指出，胰岛素样生长因子1具有促进细胞增殖、促进干细胞的软骨分化以及保持软骨细胞分化表型稳定性的作用。所以本研究将胰岛素样生长因子1转染入骨髓间充质干细胞，并建立稳转细胞系，从细胞增殖、软骨分化以及骨胶原纤维稳定等方面对胰岛素样生长因子1作为组织工程骨细胞因子的应用潜力进行探讨，以期为软骨组织工程的研究提供实验依据。

2课题设计中区别于以往相关研究的特点：

以往研究多采用在体外培养的细胞中直接加入细胞因子或者采用慢病毒转染等方法将细胞因子引入种子细胞中，而本研究采用脂质体转染法将细胞因子引入种子细胞，同时利用骨髓间充质干细胞传代增殖能力强且长期传代后生物学特征不发生改变的特点进行了G418筛选，此方法不仅保证了细胞因子在种子细胞中的稳定高表达而且还具有安全性高、毒副作用小以及操作简便的特点。

软骨细胞为终末分化细胞，体外培养时表型难以保持稳定。本研究不仅对软骨细胞机制分泌以及保持分化状态的标志物进行了检测，同时还考虑到了移植后软骨胶原纤维的稳定性，对调节细胞外基质合成-降解平衡的关键酶基质金属护蛋白酶进行了检测，较为全面的对胰岛素样生长因子1在软骨组织工程中的应用进行了探讨。

胰岛素样生长因子1对骨髓间充质干细胞软骨分化及基质金属蛋白酶表达的影响

Effect of insulin-like growth factor-1 on chondrogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells and expression of matrix metalloproteinase

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