神经干细胞培养及其影响因素

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.10.020

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (10): 1835-1840.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.10.020

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

神经干细胞培养及其影响因素

徐富翠，邹礼乐，梅欣明，郭勇

泸州医学院组织胚胎学教研室，四川省泸州市 646000

收稿日期:2012-05-05 修回日期:2012-07-13 出版日期:2013-03-05 发布日期:2013-03-05
通讯作者: 郭勇，教授，泸州医学院组织胚胎学教研室，四川省泸州市 646000 guoyong612@126.com
作者简介:徐富翠★，女，1970年生，四川省什邡市人，汉族，2006年泸州医学院毕业，硕士，副教授，主要从事干细胞基础与临床应用方向研究。 xfc707@yahoo.com.cn
基金资助:
泸医学院院级课题。

Culture of neural stem cells and the influencing factors

Xu Fu-cui, Zou Li-le, Mei Xin-ming, Guo Yong

Department of Histology and Embryology, Luzhou Medical College, Luzhou 646000, Sichuan Province, China

Received:2012-05-05 Revised:2012-07-13 Online:2013-03-05 Published:2013-03-05
Contact: Guo Yong, Professor, Department of Histology and Embryology, Luzhou Medical College, Luzhou 646000, Sichuan Province, China guoyong612@126.com
About author:Xu Fu-cui★, Master, Associate professor, Department of Histology and Embryology, Luzhou Medical College, Luzhou 646000, Sichuan Province, China xfc707@yahoo.com.cn

摘要/Abstract

摘要：

背景：神经干细胞移植治疗是中枢神经系统损伤性、难治性疾病研究的热点。如何有效提高神经干细胞存活率、克隆形成率将是其应用的重要基础和前提。
目的：探讨影响神经干细胞培养质量的可能因素，为神经干细胞的基础和临床应用研究提供参考。
方法：①神经干细胞分离和培养：分离出生24 h内SD大鼠的大脑，剪碎离心后以1×10⁸ L^-1的浓度接种，经含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基预培养4 h后改用无血清条件培养基(DMEM/F12，碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、B27)培养，2 d或3 d换液1次，6 d时传代。②神经干细胞鉴定：倒置显微镜下观察细胞形态及生物学特性；免疫组化检测第3代细胞神经巢蛋白表达和诱导分化后神经元特异性烯醇化酶和神经胶质酸性蛋白的表达。
结果与结论：出生24 h的新生大鼠可获得足量的神经干细胞；血清预培养可提高神经干细胞的增殖和存活率；免疫组化结合血清诱导分化可对培养的神经干细胞进行定性鉴定。取材时间、细胞接种密度、传代时间、细胞因子、血清等多种因素都将影响神经干细胞的培养质量。

关键词: 干细胞, 干细胞培养与分化, 神经干细胞, 培养, 取材时间, 细胞密度, 血清, 传代, 细胞因子, 影响因素, 其他基金, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Neural stem cells transplantation is the research hotspot for the treatment of central nervous system damage and refractory disease. How to improve the survival rate and the cloning formation rate of neural stem cells will be an important foundation and prerequisite for its application.
OBJECTIVE: To study the influencing factors on the culture of neural stem cells in vitro in order to provide reference for the basic and clinical application of neural stem cells.
METHODS: Neural stem cells were isolated from the brain of Sprague-Dawley rats within 24 hours after birth, centrifuged, and then inoculated at the concentration of 1×10⁸/L. Then the cells were pre-cultured with dulbecco’s modified eagle’s medium/F12 medium containing 10% fetal bovine serum for 4 hours and then serum-free conditioned medium (dulbecco’s modified eagle’s medium /F12, basic fibroblast growth factor, epidermal growth factor and B27) was used. The medium was changed every 2 or 3 days, and cells were passaged at 6 days. Morphological and biological characteristics of the cells were observed under inverted microscope to indentify neural stem cells. Immunocytochemistry was used to examine nestin expression on passage 3 neural stem cells and the expression of neuron-specific enolase and glial fibrillary acidic protein in differentiated cells.
RESULTS AND CONCLUSION: Neural stem cells could be obtained from newborn rats 24 hours after birth. Pre-culture with serum could increase the proliferation rate and survival rate. Immunohistochemistry combined with serum-induced differentiation could be used to identify neural stem cells. Sampling time, cell density, passage time, cytokines and serum all can influence the proliferation and differentiation of neural stem cells.

Key words: stem cells, stem cell culture and differentiation, neural stem cells, culture, sampling time, cell density, serum, passage, cytokine, influencing factors, stem cell photographs-containing paper

中图分类号:

R394.2

徐富翠，邹礼乐，梅欣明，郭勇. 神经干细胞培养及其影响因素[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(10): 1835-1840.

Xu Fu-cui, Zou Li-le, Mei Xin-ming, Guo Yong. Culture of neural stem cells and the influencing factors[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(10): 1835-1840.

图/表（结果） 9

2.1 原代、传代及分化培养的细胞形态 常规培养组新生大鼠脑组织原代接种培养细胞均呈悬浮球型、折光性强、单个或成对存在，培养两三天后可见极少的克隆形成，大部分细胞死亡或形成碎片，少数细胞开始贴壁，而血清预培养组培养两三天可见克隆形成率明显高于常规培养组，且细胞死亡率明显降低，见图1。

随着培养时间延长，克隆球逐渐增大形成数十到数百个细胞组成的神经球，七八天达到高峰。随后，克隆球中央细胞折光性逐渐减弱、周边边界清楚、未见突起生长，见图2。

采用机械吹打或酶消化分离神经球传代均造成细胞大量死亡，而采用神经球裂解液分离的细胞死亡率明显降低，传代后细胞分裂速度明显加快，传3代时第1，2天细胞增殖较慢，第3天开始细胞进入快速增殖期，第6天进入平台期，根据吸光度值绘制细胞生长曲线呈“S”型，见图3和图4，细胞呈悬浮致密球形生长，未见突起细胞生长，见图5和图6。

将传3代的神经球细胞经血清诱导分化后24 h见有少数细胞开始出现形态改变，有突起从胞体伸出，三四天后分化明显增加，六七天形态变化明显，生长出胞体呈圆形有突起的神经元样细胞和呈多角形，有多个突起的星形胶样细胞。

2.2 神经干细胞鉴定结果 对培养的克隆球细胞行免疫组织化学显示呈神经干细胞标志蛋白Nestin阳性反应，见图7。

此细胞经血清诱导分化后细胞形态明显改变，Nestin显示为阴性；对分化细胞进行鉴定，结果显示：出现胞体呈圆形有突起的细胞神经元特异性烯醇化酶染色呈阳性的神经元样细胞，见图8，以及细胞呈多角形有多个突起且神经胶质酸性蛋白染色呈阳性的星形胶样细胞，见图9。结合培养时呈悬浮生长的神经球的形成现象及诱导分化后细胞形态和种类，提示培养的细胞为神经干细胞。

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引言

材料方法

设计：以细胞为对象的观察实验。
时间及地点：实验于2008年1月至2011年1月在泸州医学院医学实验中心完成。
材料：
实验动物：出生24 h内SD大鼠，由泸州医学院动物实验中心提供。
主要试剂：
Main reagents:

实验方法：
神经干细胞的分离：将出生24 h内的新生SD大鼠脱颈处死后置于体积分数为75%乙醇中浸泡消毒15 min，无菌条件下取出全脑并置于PBS培养皿中去除小脑、脑干、血管和脑膜，剪碎成糜状后加入PBS反复吹打，200目不锈钢滤网过滤。离心(1 000 r/min，离心半径10 cm) 5 min×2次，去上清液，以1×10⁸ L^-1的浓度接种培养。
神经干细胞的培养及传代：将培养细胞分为常规培养组和血清预培养组。常规培养即用不含血清的条件培养基(DMEM/F12，碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、B27)培养；血清预培养组即先用含体积分数为10%胎牛血清基础培养基DMEM/F12(1∶1)预培养(37 ℃，体积分数为5% CO2，饱和湿度的恒温培养箱)4 h后，改用不含血清的条件培养基培养，比较两组细胞生长状况，2 d或3 d半量换液，6 d时分别使用机械吹打、酶消化分离法和神经球裂解液分离法分离神经球，比较分离效果，倒置显微镜观察细胞形态，测定第3代细胞的生长曲线。神经干细胞鉴定：将第3代神经球经巢蛋白免疫组织化学染色鉴定(操作参照说明书)；另一部分用神经球化学解离试剂盒分离成单个的细胞后，接种于预先经 40 g/L多聚赖氨酸包被的盖玻片并置于含血清撤去细胞因子的基础培养基中培养，倒置显微镜观察细胞形态及生物学特性，6 d后检测神经元标志物神经元特异性烯醇化酶和星形胶质细胞标志物神经胶质酸性蛋白表达。将免疫组织化学染色阳性的细胞用图像分析软件分析。
主要观察指标：悬浮培养的细胞形态、细胞表面标志免疫组织化学检测、第3代细胞的生长曲线。

讨论

神经干细胞作为一种多能干细胞，既具有自我复制、增殖的能力，同时又具有向神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞分化的特征，因此神经干细胞培养的关键就是在促进其增殖的同时能有效抑制其分化，此外，多种因素都将对神经干细胞培养质量产生影响。

3.1 供体年龄和取材部位的影响 神经干细胞可从胚胎、新生、成年脑或脊髓中获得^[4-8]，大鼠的神经干细胞于胚胎第12天开始出现，第15天达到高峰^[9-10]，虽然胚胎动物的神干细胞相对较多，细胞增殖也较快，但脑组织小、绝对量也较少，需处死多个胚胎才能达到需要；且血管和脑膜分离难度大，一般采用全脑培养，但杂细胞多。成年动物脑神经干细胞数量极为局限，因自身基因调控和干细胞生成的微环境Niche壁龛的老化导致干细胞的活性和增殖能力明显下降而致干细胞衰老^[11-13]，而新生24 h大鼠神经干细胞的数量接近胎鼠，脑组织镜下辨认容易，杂细胞少，利于培养和纯化。本实验综合上述因素，选择新生24 h内大鼠脑组织作为细胞供体，既能保障神经干细胞的数量和质量，且神经球的形成率也较高。

3.2 神经干细胞分离方法的选择 细胞分离常规采用机械分离和酶消化分离两种方法[14]，实验中发现酶消化的浓度和时间难控制，易造成细胞死亡，而针对新生鼠脑组织的组织学结构特点：细胞外基质和结缔组织较少，神经细胞间联系较为松散，神经细胞相对容易分离等特点，通过适当力度的吸管吹打后通过200目不锈钢滤网能获得较好的单细胞悬液，但需注意吹打时力度要适宜。对于成年神经组织，因神经细胞间连结紧密、轴突和突触联系非常发达，适宜使用酶消化法，但需要控制酶作用的时间，避免对细胞活性和干细胞表面受体的影响。因此，应根据动物不同年龄阶段，选用不同的分离方法。

3.3 细胞接种浓度和换液时间的选择 神经干细胞的生长具有浓度依赖性。赵志英等[15]研究发现，神经干细胞的适宜接种浓度一般可用1×10⁸ L^-1-1×10⁹L^-1，浓度太低(1×10⁵ L^-1或1×10⁷ L^-1)不利于细胞增殖^[16]，作者参照文献^[16]，反复摸索，选择1×10⁸ L^-1作为接种的适宜浓度，提示神经干细胞间相互作用在其增殖过程中的重要性，可能与培养细胞在增殖中可能存在自分泌现象(能分泌一些重要的促增殖因子)有关。其次，体外培养细胞有一定的适应期，对换液量和换液时间的选择也很重要，在实验中作者发现，每2 d或3 d换液，且采用半量换液法更有利于神经干细胞增殖。

3.4 传代时间及神经球分离方法的选择 原代培养的细胞，由于受到周围杂细胞及死亡细胞释放毒性物质的影响，细胞生长速度较慢。传代后会加快细胞增殖速度，克隆形成率也明显增加(原代小于3%，传代后5-7 d可形成克隆球)。但当神经球直径达到150-200 μm时，球心会出现大量坏死细胞^[17]，因此及时传代是控制神经球直径的有效方法，虽然有研究发现神经干细胞可在体外增殖培养25代以上，仍保持原来的生物学特征^[18]。但神经球结构致密，为了既能分离得到单个神经干细胞又不至于影响细胞活性^[19]，在实验中作者选用Stem cell公司的神经球化学解离试剂盒，且随着传代次数的增加，细胞增殖活性会降低，因此，认为第3代神经干细胞较理想，细胞纯度高，增殖活力好，适合后续实验使用。

3.5 血清及细胞因子对神经干细胞培养的影响 血清是一种含有多种营养因子(包括促使干细胞增殖和诱导细胞分化的因子)的混合物，常作为细胞培养的重要辅助成分，但由于血清中含有的成分容易导致细胞分化，因此对神经干细胞的培养一般采用无血清培养。

血清预培养能缩短神经干细胞体外适应期，但血清作用的时间不能过长，否则将导致其分化。在实验中发现，血清预培养4 h与无预培养相比，神经球形成率明显增加，因此推测，血清可能有丝裂原和缩短神经干细胞对离体环境适应能力的双重作用。其次，血清诱导分化实验可作为神经干细胞鉴定的简易方法，这与文献报道一致^[20]。在实验中选用DMEM/F12、2%B27、20 mg/L表皮生长因子和20 mg/L碱性成纤维细胞生长因子能有效促进神经干细胞增殖，作为常用的促进神经干细胞增殖的生长因子，具有丝裂原作用，能促进神经干细胞的生长、分裂，缩短细胞倍增时间^[21-22]，且有明显的协同作用，与单独应用表皮生长因子或碱性成纤维细胞生长因子相比有显著差异^[23]。因此，在无血清培养基中添加表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子，能成功地提高神经干细胞培养质量。

3.6 神经干细胞的鉴定 目前对神经干细胞鉴定主要有形态、巢蛋白、Musashi、转录因子及细胞黏附分子等细胞表面特异性标志物、自我更新能力(单细胞克隆分析、BrdU标记S期细胞)和多向分化潜能等^[24-27]。在实验中发现，根据细胞生长特性及血清诱导分化实验可以对神经干细胞进行鉴定，具有操作简便等特点。取材时间、细胞接种密度、传代时间、培养基成分、血清等多种因素都将影响神经干细胞的培养质量。实验中发现出生 24 h的新生大鼠可获得足量的神经干细胞；血清预培养4 h可提高神经干细胞的增殖和存活率；巢蛋白染色和血清诱导分化检测神经元特异性烯醇化酶阳性的神经元和神经胶质酸性蛋白阳性的星型胶质细胞可对培养神经干细胞进行定性分析。

基金资助：泸医学院院级课题。
作者贡献：实验设计为第一作者，实验实施为第一~第四作者，实验评估为第一、二作者，资料收集为第三作者。第一作者成文，第一作者、通讯作者审校，通讯作者对文章负责。
利益冲突：课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济组织直接或间接的经济或利益的赞助。
伦理要求：实验过程中对动物的处置符合2009年《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的条例。
作者声明：文章为原创作品，数据准确，内容不涉及泄密，无一稿两投，无抄袭，无内容剽窃，无作者署名争议，无与他人课题以及专利技术的争执，内容真实，文责自负。

神经干细胞培养及其影响因素

Culture of neural stem cells and the influencing factors

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