大鼠骨髓间充质干细胞体外向血管平滑肌样细胞的诱导分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.10.002

摘要/Abstract

摘要：

背景：有研究表明，血管外膜成纤维细胞被激活早期参与动脉粥样硬化及血管再狭窄的形成，另有研究表明，骨髓间充质干细胞有部分黏附分化参与血管重塑，实验拟从血管外膜成纤维细胞与骨髓间充质干细胞之间相互作用的角度，来探讨动脉硬化及血管损伤后再狭窄过程中的可能机制。
目的：观察骨髓间充质干细胞与血管外膜成纤维细胞直接接触培养后，骨髓间充质干细胞形态改变及表达血管平滑肌肌动蛋白的情况。
方法：将骨髓间充质干细胞(DAPI标记细胞核)与外膜成纤维细胞按一定的比例混合培养7 d，细胞单独培养作对照，显微镜下观察细胞形态变化，免疫荧光检测骨髓间充质干细胞平滑肌肌动蛋白表达的情况。
结果与结论：骨髓间充质干细胞与血管外膜成纤维细胞共培养后，可见骨髓间充质干细胞的细胞核蓝染(DAPI标记细胞核)、胞浆红染(平滑肌肌动蛋白阳性)的双标细胞出现，且随培养时间的延长，骨髓间充质干细胞的平滑肌肌动蛋白表达阳性率明显增高。结果可见与血管外膜成纤维细胞直接接触有诱导骨髓间充质干细胞向血管平滑肌样细胞分化的趋势。

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 平滑肌肌动蛋白, 骨髓间充质干细胞, 血管外膜成纤维细胞, 共培养, 诱导分化, 省级基金, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Studies have shown that the early activated adventitial fibroblasts cells are involved in the atherosclerosis and in the formation of vascular restenosis, and other studies have shown that some bone marrow mesenchymal stem cells are adherent, differentiate and participate in vascular remodeling. The experiment was to explore the possible mechanism of bone marrow mesenchymal stem cells involved in the atherosclerosis and the formation of vascular restenosis through analyzing the interaction between adventitial fibroblasts and bone marrow mesenchymal stem cells.
OBJECTIVE: To observe the morphological changes of bone marrow mesenchymal stem cells and the expression of vascular smooth muscle actin after bone marrow mesenchymal stem cells directly contacted with adventitial fibroblasts.
METHODS: Rat bone marrow msenchymal stem cells (DAPI-labeled nucleus) and adventitial fibroblasts were mixed and co-cultured for 7 days. Bone marrow mesenchymal stem cells were cultured alone as controls. The morphological changes of co-cultured cells were observed. The expression of vascular smooth muscle actin was detected with immunofluorescence staining.
RESULTS AND CONCLUSION: After co-cultured with adventitial fibroblasts, bone marrow mesenchymal stem cells exhibited DAPI-labeled blue nuclei and red stained cytoplasm (positive smooth muscle actin). With the prolongation of culture time, smooth muscle actin expression in the bone marrow mesenchymal stem cells was significantly increased. These results indicate that bone marrow mesenchymal stem cells can differentiate into vascular smooth muscle cell-like cells after directly contacting with adventitial fibroblasts.

Key words: stem cells, bone marrow-derived stem cells, smooth muscle actin, bone marrow mesenchymal stem cells, adventitial fibroblasts, co-culture, induced differentiation, provincial grants-supported paper, stem cell photographs-containing paper

中图分类号:

R394.2

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图/表（结果） 6

2.1 骨髓间充质干细胞形态及免疫荧光鉴定结果

倒置显微镜下观察可见：骨髓间充质干细胞接种于培养瓶中后，部分细胞贴壁呈圆形，骨髓中的造血干细胞不会贴壁，可以在换液中逐渐清除掉，培养一两天的骨髓间充质干细胞短小，多呈圆形未伸展状态，3-5 d后出现少量伸展细胞，见图1，细胞开始增殖，细胞核较大，扁圆形，可见一两个核仁。大多数细胞带有两三个长的突起，呈梭形，有小部分细胞呈多角形，传代培养后，细胞旋涡状生长，形态逐渐统一呈长梭形。

免疫荧光染色鉴定结果显示：取培养至第3代的骨髓间充质干细胞行免疫组化染色：抗CD44阳性率达到90%以上，见图2，抗CD34阴性；骨髓间充质干细胞经DAPI染色后，细胞核呈蓝色荧光的达100%；骨髓间充质干细胞抗平滑肌肌动蛋白染色，呈弱阳性(阳性细胞百分率< 20%)。

2.2 血管外膜成纤维细胞形态及免疫荧光鉴定结果 倒置显微镜下观察可见，培养两三天时成纤维细胞从血管外膜组织块游出，亦呈贴壁生长，见图3，并分裂增殖，原代培养的细胞呈梭形或不规则多边形，传代后，细胞呈嵴状多层重叠，生长旺盛。细胞爬片行免疫荧光染色，抗Vimentin抗体阳性，抗平滑肌肌动蛋白阴性。

2.3 共培养细胞的形态学及免疫荧光鉴定 共培养的细胞逐渐融合，形态接近不易分辨，第5天时，与单独培养的细胞相比，都已接近70%的细胞融合，但失去各自典型的旋涡状及嵴状状态。共聚焦显微镜下可见，骨髓间充质干细胞核蓝染、细胞较小，失去单独培养时的长梭形态，呈多角形。抗平滑肌肌动蛋白阳性的胞质发红色荧光。共培养3 d时抗平滑肌肌动蛋白阳性细胞率为21%，5 d时为57%，7 d时为83%，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图4-6。

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引言

材料方法

设计：随机分组设计，对比观察。
时间及地点：实验于2011年3至11月在滨州医学院医学生物技术重点实验室完成。
材料：
实验动物：8周龄SD大鼠10只，体质量80-100 g，由滨州医学院实验动物中心提供，实验过程中对动物处置符合动物伦理学要求。
主要试剂和仪器：
Main reagents and instruments：

实验方法：
大鼠骨髓间充质干细胞的培养、鉴定：SD大鼠处死后，无菌分离双侧股骨及胫骨，L-DMED培养液冲洗出骨髓，收集于离心管中，1 000 r/min离心5 min(离心半径13.5 cm)，弃去上清液，加入适量含体积分数为15%胎牛血清的L-DMED充分吹打至单细胞悬液，调细胞浓度为4×10⁸ L^-1接种于培养瓶中，置于37 ℃，体积分数为5%CO2培养箱^[7]。于72 h后首次换液，弃去悬浮细胞，贴壁细胞继续培养，以后每3 d换液1次，待细胞长满瓶底的80%以上时进行传代，取第3代细胞，备细胞爬片。一抗分别为CD34、CD44(1∶200)，SABC法免疫组化染色法鉴定，随机选取不同的10个视野，计算阳性细胞率。
大鼠血管外膜成纤维细胞的培养、鉴定：无菌条件下用血管钳撕取大鼠胸主动脉薄层的血管外膜，采用组织块贴壁培养法，剪成小块，均匀铺于培养皿上培养[8]，待细胞长满瓶底，用0.25%胰酶消化传代，隔日更换培养液，取第3代细胞备细胞爬片，用Vimentin抗体、平滑肌肌动蛋白行免疫化学染色鉴定。
大鼠骨髓间充质干细胞与成纤维细胞共培养：首先取培养至第3代的骨髓间充质干细胞，用荧光染料0.02 g/L DAPI标记细胞核过夜，PBS漂洗后，常规消化制备细胞悬液，与成纤维细胞分别以5×10⁷L^-1的浓度共同传入6 孔板内，混合均匀后常规培养，同时两种细胞均单独以1×10⁸ L^-1浓度传代作为对照。分别于3，5，7 d 后结束培养，备细胞爬片。一抗为平滑肌肌动蛋白，二抗为荧光标记羊抗兔IgGCy3。以上培养重复3次，随机选取不同的10个视野，计算阳性细胞的转化率。
主要观察指标：①倒置相差显微镜观察传代培养的骨髓间充质干细胞形态变化及免疫组化染色鉴定结果。②激光共聚焦显微镜下观察骨髓间充质干细胞与外膜成纤维细胞共培养的平滑肌肌动蛋白α- actin的表达。
统计学分析：由第一作者采用SPSS 11.0软件完成统计处理，3组间比较用卡方检验。P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

近年来，人们逐渐发现血管损伤后增殖的平滑肌细胞一部分并非来自血管中层及外膜，Abedin等^[9]的研究发现，骨髓间充质干细胞可以存在于正常动脉管壁和微血管中，并且它们也可以进入血循环到达其他组织。已有研究发现骨髓间充质干细胞一定条件下可在受损部位聚集，并进一步分化为血管平滑肌和内皮细胞^[10]。Xu等^[11-13]最新研究发现：循环血液和血管的中膜、外膜均存在血管祖细胞，并且可参与动脉粥样硬化的形成。骨髓间充质干细胞是具有多项向分化潜能的细胞^[14-15]，且可诱导为血管平滑肌样细胞^[16]，其诱导方法不尽相同，并且受多种因素的影响。近几年，血管外膜成纤维细胞在血管再狭窄病中的作用逐渐被重视，课题组Xu等^[17-18]前期研究发现，在动脉硬化内膜病灶发生之前，最早在外膜成纤维细胞中检测到单核细胞趋化蛋白1蛋白和基因表达，并且细胞增殖也最早在外膜检测到。

实验通过骨髓间充质干细胞与血管外膜成纤维细胞共培养的方法，可以通过细胞与细胞之间及与细胞因子之间的旁分泌、接触反应、缝隙连接等方式诱导分化。结果显示：共培养的骨髓间充质干细胞平滑肌肌动蛋白阳性率增高，细胞阳性表达率随着培养时间的延长而增高，共培养第7天时，细胞阳性表达率最高。结果表明：在共培养环境下，有诱导骨髓间充质干细胞向平滑肌样细胞分化的趋势。并且推测血管损伤时不仅使成纤维细胞激活向损伤局部迁移并增殖，其表型转化也可能与骨髓间充质干细胞接触有关，两种细胞可能共同参与血管管壁结构的增殖重塑。骨髓间充质干细胞分化条件还应受多种因素影响。因此，实验可能存在不足之处，尚有待进一步的研究证实。

基金资助：山东省高校科技计划(J10LF61)。
作者贡献：实验设计为袁文丹，实验实施为李京敏、袁文丹，实验评估为徐芳，资料收集为袁文丹。袁文丹成文，徐芳审校，袁文丹对文章负责。
利益冲突：课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济组织直接或间接的经济或利益的赞助。
伦理要求：实验过程中对动物的处置符合2009年《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的条例。
作者声明：文章为原创作品，数据准确，内容不涉及泄密，无一稿两投，无抄袭，无内容剽窃，无作者署名争议，无与他人课题以及专利技术的争执，内容真实，文责自负。