磷酸果糖抑制肌腱胶原产生和趾屈指肌腱吻合后的粘连

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.08.017

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (8): 1430-1434.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.08.017

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磷酸果糖抑制肌腱胶原产生和趾屈指肌腱吻合后的粘连

朱红¹，曹文¹，李娅娟²，杨选影²，夏长所²

1 青岛大学医学院附属医院手术室，山东省青岛市 266003
2 青岛大学医学院附属医院骨科，山东省青岛市 266003

收稿日期:2012-04-07 修回日期:2012-06-28 出版日期:2013-02-19 发布日期:2013-02-19
通讯作者: 夏长所，副教授，博士，青岛大学医学院附属医院骨科，山东省青岛市 266003 xcs009@163.com
作者简介:朱红★，女，1967年生，山东省青岛市人，汉族，在读硕士，主管护师，主要从事外科基础和术后监护研究。

Mannose-6-phosphate effects on collagen production and adhesion formation of the flexor tendon

Zhu Hong¹, Cao Wen¹, Li Ya-juan², Yang Xuan-ying², Xia Chang-suo²

1 Operative Room, the Affiliated Hospital of Medical College, Qingdao University, Qingdao 266003, Shandong Province, China 2 Department of Orthopedics, the Affiliated Hospital of Medical College, Qingdao University, Qingdao 266003, Shandong Province, China

Received:2012-04-07 Revised:2012-06-28 Online:2013-02-19 Published:2013-02-19
Contact: Xia Chang-suo, Doctor, Associate professor, Department of Orthopedics, the Affiliated Hospital of Medical College, Qingdao University, Qingdao 266003, Shandong Province, China xcs009@163.com
About author:Zhu Hong★, Studying for master’s degree, Nurse in charge, Operative Room, the Affiliated Hospital of Medical College, Qingdao University, Qingdao 266003, Shandong Province, China

摘要/Abstract

摘要：

背景：有实验证实外源性6-磷酸果糖能降低肌腱细胞Ⅰ型胶原的产生量，减轻肌腱术后粘连的形成。
目的：观察6-磷酸果糖对肌腱术后粘连形成的影响。
方法：取72只兔行中趾屈指肌腱切断吻合，随机分成实验组与对照组(n=36)，分别于腱鞘内注入6-磷酸果糖与生理盐水，术后4，8周后行肌腱粘连检测、生物力学测定、组织学观察和扫描电镜观察；术后1，2，4，8周采用原位杂交方法测定肌腱转化生长因子β1和Ⅰ型胶原mRNA的表达。
结果与结论：术后4，8周，与对照组比较，实验组肌腱缝合处光滑，屈趾肌腱滑动距离较长，肌腱滑动受限较轻(P < 0.05)，但两组最大抗断裂载荷差异无显著性意义(P > 0.05)；扫描电镜和组织学观察结果显示，对照组胶原纤维排列紊乱，实验组胶原纤维排列整齐。实验组转化生长因子β1和Ⅰ型胶原mRNA表达水平均低于对照组(P < 0.05)。证实6-磷酸果糖能有效抑制转化生长因子β1在肌腱损伤修复中的作用，减轻粘连形成。

关键词: 生物材料, 材料生物相容性, 组织工程复合支架材料, 6-磷酸果糖, 转化生长因子β1, Ⅰ型胶原, 肌腱粘连, 兔, 省级基金, 生物材料图片文章

Abstract:

BACKGROUND: It has been confirmed that exogenous mannose-6-phosphate can inhibit type Ⅰ collagen production in tendon cells and prevent tendon adhesion after repair of flexor tendon injury.
OBJECTIVE: To investigate the preventive effect of mannose-6-phosphate on adhesion formation following flexor tendon repair.
METHODS: Seventy-two adult New Zealand White rabbit forepaws underwent sharp transection of the middle digit flexor digitorum profundus and immediate repair, and then were randomly divided into experimental (injected with mannose-6-phosphate) and control (injected with normal saline) groups. Tendons were harvested at 4 and 8 weeks postoperatively, and biomechanics testing, histological evaluation and scanning electron microscope observation were conducted. In situ hybridization method was performed to determine the mRNA expression of transforming growth factor beta 1 and type Ⅰ collagen.
RESULTS AND CONCLUSION: At 4 and 8 weeks after operation, the suture line was smooth, the gliding excursion ratio of the flexor tendon was higher, and the tendon sliding was constrained less in the experimental group as compared with the control group (P < 0.05). However, there was no significant difference in the tensile strength of tendon anastomosis between the two groups (P > 0.05). Scanning electron microscope and histological observation showed that collagen fibers arranged irregularly in the control group, but arranged regularly in the experimental group. The in situ hybridization examination revealed that transforming growth factor beta 1 and type Ⅰ collagen mRNA expression in the experimental group was lower than that in the control group (P < 0.05). These findings indicate that mannose-6-phosphate can inhibit the function of the transforming growth factor beta 1 effectively in the flexor tendon repair and prevent adhesion formation.

Key words: biomaterials, material biocompatibility, composite scaffold materials for tissue engineering, mannose-6-phosphate, transforming growth factor beta 1, type Ⅰ collagen, tendon adhesion, rabbits, provincial grants-supported paper, biomaterial photographs-containing pa

中图分类号:

R318

朱红，曹文，李娅娟，杨选影，夏长所. 磷酸果糖抑制肌腱胶原产生和趾屈指肌腱吻合后的粘连[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(8): 1430-1434.

Zhu Hong, Cao Wen, Li Ya-juan, Yang Xuan-ying, Xia Chang-suo. Mannose-6-phosphate effects on collagen production and adhesion formation of the flexor tendon[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(8): 1430-1434.

图/表（结果） 4

2.1 实验动物数量分析 72只动物均进入结果分析。

2.2 两组肌腱粘连检测结果 术后4周，对照组肌腱缝合处形成少量粗大粘连带，充填鞘管腔，肌腱滑动轻度受限；实验组肌腱缝合处基本保持光滑，肌腱滑动不受限。术后8周，对照组肌腱缝合处及与皮肤间均形成大量粗大粘连带，充填鞘管腔，肌腱无明显滑动；实验组肌腱缝合处仍光滑，肌腱滑动受限较轻。

2.3 两组生物力学检测结果 术后4，8周，对照组屈趾肌腱滑动距离较短，模拟主动屈曲度明显受限(P < 0.05)。术后最大抗断裂载荷两组间比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见表1。

2.4 两组扫描电镜观察结果 术后4周，对照组肌腱胶原纤维与周围组织之间三四级粘连有5条肌腱，未见明显空隙，1条肌腱为2级粘连。实验组4条肌腱为一二级粘连，肌腱胶原纤维与周围组织间较疏松，可见明显空隙；2条肌腱为4级粘连。术后8周，对照组肌腱胶原纤维与周围组织之间三四级粘连肌腱4条，实验组5条肌腱为一二级粘连。

2.5 两组组织学观察结果 苏木精-伊红染色显示，术后4周，对照组胶原纤维增多，排列方向较紊乱；实验组新生胶原纤维增多，排列方向渐趋一致，与肌腱纵轴平行，成纤维细胞减少，毛细血管增生较多。术后8周，对照组吻合口处的胶原纤维排列紊乱、扭曲，方向不一；实验组肌腱吻合口的胶原纤维排列一致，与肌腱纵轴平行。

2.6 两组转化生长因子β1和Ⅰ型胶原mRNA的表达 原位杂交结果显示，术后各时间点实验组转化生长因子β1和Ⅰ型胶原mRNA表达水平均低于对照组(P < 0.05)，见表2，图1，2。

图1，2显示转化生长因子β1 mRNA和Ⅰ型胶原mRNA在2-4周表达水平最高，应用6-磷酸果糖后，明显降低转化生长因子β1 mRNA和Ⅰ型胶原mRNA的表达。

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引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。
时间及地点：于2010年10月至2011年6月在青岛大学医学院附属医院实验动物中心完成。
材料：
主要试剂、仪器：
Main experimental reagents and instruments:

实验动物与分组：72只成年新西兰大白兔，雌雄不拘，购自青岛市实验动物中心，许可证号SCXK(鲁)2010005，体质量4.0-4.5 kg，随机分为对照组与实验组，每组36只。其中每组取12只用于肌腱粘连检测、生物力学测定、组织学观察和扫描电镜观察，剩余24只用于转化生长因子β1和Ⅰ型胶原mRNA表达的检测。
实验方法：
实验造模与分组干预：将上述72只兔用氯胺酮 (50 mg/kg)肌肉注射麻醉后，于前肢中趾相当于屈指肌腱Ⅱ区位置切开皮肤和腱鞘，显露屈趾深肌腱并切断，立即用5-0无创缝线采用标准Kessler缝合技术进行修补。关闭腱鞘，实验组与对照组分别于鞘内注射100 μL 6-磷酸果糖或生理盐水，石膏固定左前肢2周。术后分笼饲养，前3 d每天注射青霉素80×10⁴ U。
肌腱粘连检测：术后4，8周每组各处死6只兔取中趾，沿原手术切口切开，观察吻合口处肌腱愈合及周围组织的粘连程度和范围、肌腱的滑动性及吻合口处的表面光滑程度。
生物力学检测：将上述肌腱1 h内在多功能材料测试机上进行测试，以5 mm/min速度拉伸，载荷单位N，伸长单位cm。观察肌腱滑动距离、模拟主动屈曲度和最大抗断裂载荷。
扫描电镜观察：术后4，8周各组处死6只动物后，在缝合段取长2 cm、宽5 mm趾深屈肌腱，2%戊二醛固定4 h，PBS清洗；4 ℃，12.5%，25%，50%DMSO梯度置换，液氮冷冻断裂，PBS清洗；乙醇梯度脱水，乙酸异戊脂置换，CO2临界点干燥，离子镀膜仪喷金镀膜，扫描电镜观察。随机选取3个视野拍照，图像分析仪分析评价细胞周围粘连情况。具体粘连分级按照王振海等^[3]的标准评价。
组织学观察：同上法取缝合段趾深屈肌腱，体积分数10%甲醛固定，体积分数70%-100%乙醇梯度置换，石蜡透明、包埋、10 μm厚度切片，苏木精-伊红染色，光镜下观察。
转化生长因子β1和Ⅰ型胶原mRNA的表达：各组于术后1，2，4，8周各处死6只动物，沿原切口切开皮肤，切取吻合处肌腱，按转化生长因子β1和Ⅰ型胶原原位杂交试剂盒说明，采用原位杂交方法，用图像分析技术观察肌腱吻合处组织的转化生长因子β1和Ⅰ型胶原mRNA阳性表达情况，并计数单位面积内的阳性细胞表达数，每个标本肌腱取10个位置，取其均值。
主要观察指标：两组肌腱粘连检测、生物力学测定、组织学观察和扫描电镜观察结果及转化生长因子β1和Ⅰ型胶原mRNA的表达。
统计学分析：采用SPSS 10.0统计软件包进行分析。数据以x(_)±s表示，组间比较采用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

转化生长因子β1是一种具有多种生物学功能的生长因子，在肌腱损伤修复过程中，它一方面刺趋化炎性细胞，促进免疫应答，激胶原纤维的合成；另外，它又促进创面肉芽组织增生并形成瘢痕组织而引起肌腱粘连。在各种瘢痕组织形成过程中，转化生长因子β1能够增加Ⅰ、Ⅲ型胶原组织的表达，以前研究表明，外源性的转化生长因子β1能增加肌腱细胞Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型胶原的产生，其中Ⅰ型胶原的产生量最大，也是形成肌腱粘连重要因素^[4]。故瘢痕粘连形成与转化生长因子β1有直接的关系，转化生长因子β1的表达被抑制则可能减轻瘢痕粘连的产生。研究证实转化生长因子β1和转化生长因子β2中和抗体能显著减少鼠的手术切口皮肤瘢痕的形成^[5]，但局部应用抗体存留时间较短，作用有限，实验通过应用6-磷酸果糖抑制细胞内转化生长因子β1的表达降低转化生长因子β1水平，达到抑制瘢痕产生的作用。

在肌腱愈合过程中，转化生长因子β均能增加腱鞘、腱外膜和腱内膜胶原组织的产生。有作者证实外源性6-磷酸果糖能降低3种肌腱细胞Ⅰ型胶原的产生量，并能减轻肌腱术后粘连的形成^[6]。转化生长因子β1、转化生长因子β2和转化生长因子β3在体外均能增加3种细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原的产生。以前实验结果显示，6-磷酸果糖能显著降低3种细胞的转化生长因子β及其受体的合成，其中腱鞘细胞的转化生长因子β1转化生长因子β2平均降低程度最大，而腱外膜的转化生长因子β1受体1的平均降低程度最大，因此转化生长因子β1和转化生长因子β2是调节胶原纤维形成主要因素，也提示腱鞘和腱外膜在肌腱愈合与粘连形成中具有重要作用^[7]。实验结果同时也显示，转化生长因子β合成的降低与6-磷酸果糖下调肌腱细胞转化生长因子β1mRNA 的表达有关。

一般认为，在肌腱愈合过程中，存在内源性和外源性两种愈合机制，内源性愈合主要由肌腱细胞本身完成，外源性愈合则主要是腱鞘细胞和周围组织细胞的作用^[8]。有学者发现肌腱不同部位的细胞，即腱鞘、腱外膜和腱内膜细胞可产生不同的胶原成分，故认为传统的内、外源性愈合机制应增加为3个部位共同参与的愈合过程^[9]。既往实验表明，外源性转化生长因子β能增加肌腱细胞Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原的产生，但Ⅰ型胶原的产生量最大，也是肌腱粘连形成的重要因素^[10-11]。抑制转化生长因子β1活性则可抑制瘢痕组织的产生，减轻肌腱术后粘连，但是抑制胶原的形成是否否会影响到肌腱愈合的质量？根据肌腱的愈合机制，肌腱愈合由腱鞘、腱外膜和腱内膜共同完成，而腱鞘在粘连形成过程中的作用尤为重要^[12-15]，如能有效抑制腱鞘在肌腱愈合中的作用，较少影响腱外膜和腱内膜的愈合过程，则能既防止粘连又不影响肌腱的愈合质量。实验结果表明，应用6-磷酸果糖能明显减轻肌腱术后粘连而不影响肌腱的愈合强度。

基金资助：山东省自然科学基金资助项目(Y2006C19)。
作者贡献：夏长所进行实验设计，实验实施为曹文，李亚娟，实验评估为杨选影，资料收集为朱红，朱红成文，夏长所审校，夏长所对文章负责。
利益冲突：课题未涉及任何厂家及相关雇主或其它经济组织直接或间接的经济或利益的赞助。
伦理要求：实验过程中对动物的处置符合2009年《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的条例。
作者声明：文章为原创作品，数据准确，内容不涉及泄密，无一稿两投，无抄袭，无内容剽窃，无作者署名争议，无与他人课题以及专利技术的争执，内容真实，文责自负。

磷酸果糖抑制肌腱胶原产生和趾屈指肌腱吻合后的粘连

Mannose-6-phosphate effects on collagen production and adhesion formation of the flexor tendon

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