三种比色法评价4种牙科金属材料对L-929细胞的毒性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.08.011

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (8): 1390-1397.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.08.011

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三种比色法评价4种牙科金属材料对L-929细胞的毒性

陈耀忠¹，刘根娣¹，宋萍²，高峰²

1 东南大学附属中大医院口腔科，江苏省南京市 210009
2 东南大学医学院，江苏省南京市 210009

收稿日期:2012-10-19 修回日期:2012-11-19 出版日期:2013-02-19 发布日期:2013-02-19
通讯作者: 刘根娣，主任医师，东南大学附属中大医院口腔科，江苏省南京市 210009 lgdourhome@163.com
作者简介:陈耀忠★，男，1972年生，安徽省巢湖市人，汉族，2004年江西医学院毕业，硕士，主治医师，主要从事口腔临床及基础研究。chenyz2003@126.com

Evaluating cytotoxicity of four different dental metal materials toward L-929 cells using three assay systems

Chen Yao-zhong¹, Liu Gen-di¹, Song Ping², Gao Feng²

1 Department of Stomatology, Zhongda Hospital, Medical College of Southeast University, Nanjing 210009, Jiangsu Province, China 2 Medical College, Southeast University, Nanjing 210009, Jiangsu Province, China

Received:2012-10-19 Revised:2012-11-19 Online:2013-02-19 Published:2013-02-19
Contact: Liu Gen-di, Chief physician, Department of Stomatology, Zhongda Hospital, Medical College of Southeast University, Nanjing 210009, Jiangsu Province, China lgdourhome@163.com
About author:Chen Yao-zhong★, Master, Attending physician, Department of Stomatology, Zhongda Hospital, Medical College of Southeast University, Nanjing 210009, Jiangsu Province, China chenyz2003@126.com

摘要/Abstract

摘要：

背景：采用不同方法评价材料的细胞毒性可能会得出不同的实验结果。
目的：采用3种比色法评价镍铬合金、钴铬合金、3铬13及纯钛等牙科金属材料对小鼠成纤维细胞(L-929细胞)的细胞毒性。
方法：以镍铬合金、钴铬合金、3铬13及纯钛4种牙科金属材料的浸提液分别作用于体外培养的L-929细胞24，72 h。以体积分数10%小牛血清+高糖DMEM培养液培养的L-929细胞为阴性对照组，以0.7%丙烯酰胺+体积分数10%小牛血清+高糖DMEM培养液培养的L-929细胞为阳性对照组，分别采用MTT、CCK-8及结晶紫3种比色法检测上述材料的细胞毒性。
结果与结论：①4种材料浸提液中培养的细胞形态正常，胞内结构清晰，随着培养时间延长细胞大量增殖，与阴性对照组细胞形态无明显差异。阳性对照组细胞数量明显减少，形态完整性受破坏，形成大量细胞碎片。②培养24 h时，CCK-8比色法检测中钴铬合金组的细胞相对增殖率低于阴性对照组(P < 0.05)，MTT及结晶紫比色法检测中钴铬合金组的细胞相对增殖率与阴性对照组比较差异无显著性意义(P > 0.05)；培养72 h时，MTT比色法检测中4种牙科金属材料组细胞相对增殖率低于阴性对照组(P < 0.01)，CCK-8及结晶紫比色法检测中4组的细胞相对增殖率与阴性对照组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，但材料细胞毒性均为0-1级。表明上述4种牙科金属材料细胞毒性均在临床应用的允许范围内，具有良好的生物安全性。

关键词: 生物材料, 组织工程口腔材料, 镍铬合金, 钴铬合金, 3铬13, 纯钛, 牙科金属材料, 细胞毒性, L-929细胞, MTT比色法, CCK-8比色法, 结晶紫比色法, 省级基金, 生物材料图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Different methods to evaluate cytotoxicity of the same material may produce different results.
OBJECTIVE: To evaluate the cytotoxicity of nickel-chromium alloy, cobalt-chromium alloy, 3Cr13 stainless steel and pure titanium toward L-929 cells by using three assay systems.
METHODS: The L-929 cells were cultivated in vitro in the extracts of four different dental metal materials (nickel-chromium alloy, cobalt-chromium alloy, 3Cr13 stainless steel and pure titanium) at 24 hours and 72 hours, separately. The L-929 cells, cultured in high-glucose Dulbecco’s modified Eagle’s medium supplemented with 10% fetal calf serum, served as the negative control group. And cells, cultured in high-glucose Dulbecco’s modified Eagle’s medium supplemented with 10% fetal calf serum and 0.7% acrylamide, served as the positive control group. The detection methods for the cytotoxicity included MTT, cell counting kit-8 and crystal violet cell proliferation assay system.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Microscopy showed that the L-929 cells, cultivated in the extracts of four different dental materials, were normal and their intracellular structure was clear. They proliferated well with extension of incubation time. There were no significant differences between the test and negative control groups at all times. However, the number of cells in the positive control group significantly reduced as compared with the negative control group. The morphological integrity destroyed and a lot of cell debris formed. (2) After culture for 24 hours, the cell counting kit-8 assay revealed that the relative growth rate of the cobalt-chromium alloy group was significantly lower than that of the negative group (P < 0.05), while the MTT and crystal violet assay revealed that there were no significant differences in cell viability between the cobalt-chromium alloy and negative control group (P > 0.05). After culture for 72 hours, the MTT assay revealed that the relative growth rate of four dental metal materials groups was significantly lower than that of the negative group (P < 0.01), while the cell counting kit-8 and crystal violet assay revealed that there were no significant differences in cell viability between the four dental metal materials and negative control group (P > 0.05). The cytotoxicity of the tested dental metal materials was grade 0-1, which meets the safety standard. These indicate that these four dental metal materials have good biological safety.

Key words: biomaterials, tissue engineering oral materials, nickel-chromium alloy, cobalt-chromium alloy, 3Cr13, pure titanium, dental metal materials, cytotoxicity, L-929 cells, MTT colorimetric assay, cell counting kit-8 assay, crystal violet assay, provincial grants-supported paper, biomaterial photographs-containing paper

中图分类号:

R318

陈耀忠，刘根娣，宋萍，高峰. 三种比色法评价4种牙科金属材料对L-929细胞的毒性[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(8): 1390-1397.

Chen Yao-zhong, Liu Gen-di, Song Ping, Gao Feng. Evaluating cytotoxicity of four different dental metal materials toward L-929 cells using three assay systems[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(8): 1390-1397.

图/表（结果） 5

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引言

镍铬合金是最常用的口腔修复材料之一，具有价格低廉、制作简单、强度高等优点，但由于长期暴露在口腔环境中，其腐蚀析出的镍离子、铍离子及铬离子被认为是导致机体牙龈炎症、过敏反应等不良反应的重要因素^[1-4]。

与镍铬合金相比，钴铬合金强度高，硬度大，耐腐蚀性能更好，但其所含的钴也是一种常见的致敏元素，其远期疗效不能确定^[3-5]。相对于镍铬合金、钴铬合金等常用非贵金属材料，纯钛具有密度小、强度高、耐腐蚀、生物相容性好等优点，是一种较为理想的口腔修复材料，其临床应用显著增加^[6-7]。不同于上述3种口腔修复金属材料，3铬13是一类马氏体不锈钢，因含碳较高，具有较高的强度、硬度和耐磨性，但耐蚀性稍差，主要应用于制作牙钳、牙挺及手术刀片等医疗器械。

由于上述4种牙科金属材料与口腔软硬组织如牙龈、口腔黏膜、牙釉质及牙本质等直接接触，且镍铬合金、钴铬合金及纯钛等牙科修复用金属材料长期暴露在口腔环境中，口腔中的唾液及食物中所含有的酸性或碱性等物质会造成牙科金属材料的电化学腐蚀，导致材料中镍、钴、铍、铝及铬等金属离子的析出。虽然从这些牙科金属材料中释放的金属离子引起全

身性反应的情况较少见，造成重要脏器损害的情况极其罕见，但在一些金属与组织紧密接触的

区域如牙龈沟、金属支架接触区域会出现金属离子高浓度的微环境区域，可引起口腔局部不良反应，如牙龈变灰、牙龈炎等^[8-12]。

学者们对镍铬合金等牙科金属材料进行了一系列生物相容性研究，例如：李榕卿等^[13]观察镍铬合金烤瓷冠对患牙牙周组织的影响，结果显示采用镍铬合金烤瓷冠进行上颌切牙修复6-9个月后，患牙的菌斑指数没有明显改变，但龈沟液量、探诊深度、龈沟内出血指数、龈沟液内C-反应蛋白和肿瘤坏死因子α水平明显高于健康牙(P < 0.05)，提示镍铬合金烤瓷冠对患牙的牙周组织有一定的不良影响。Li-Chun等^[14]比较了镍铬合金及金铂合金等两种烤瓷冠及固定桥修复36个月后的临床疗效，结果显示两组修复体在观察期间均未发生崩瓷折裂情况，但金铂合金修复组患牙在修复体色泽、边缘适合性、牙龈着色及牙龈状态方面要明显优于镍铬合金修复组(P < 0.05)。白轶昕等^[15]评价钴铬合金烤瓷冠及含钛镍铬合金烤瓷冠的临床应用效果，结果显示采用上述两种修复体修复完成1，30个月后，两组烤瓷冠在颜色、边缘适合性、菌斑指数、牙龈指数方面差异无显著性意义(P > 0.05)，但在颈缘变色方面钴铬合金烤瓷组优于含钛镍铬合金烤瓷组 (P < 0.05)；张英^[16]探讨钴铬合金、纯钛及全瓷等3种不同材料全冠修复体对基牙龈沟液中天冬氨酸转氨酶和碱性磷酸酶水平的影响，结果显示修复后3，6个月时钴铬合金烤瓷冠组龈沟液中的天冬氨酸转氨酶和碱性磷酸酶值均高于纯钛烤瓷冠和全瓷冠组；而纯钛烤瓷冠组与全瓷组龈沟液中的天冬氨酸转氨酶和碱性磷酸酶值无显著变化，且2组之间各项指标无明显差异，提示钴铬合金烤瓷冠可导致龈沟液量及其成分变化，对牙周组织有一定的不利影响，而纯钛烤瓷冠和全瓷冠对牙周组织健康的影响相对较小，因此对镍铬合金等牙科金属材料进行细胞毒性研究具有重要的临床应用价值。

为了获得较为客观的实验结果，实验采用四甲基偶氮唑盐(MTT)、Cell Counting Kit-8 (CCK-8)及结晶紫等3种比色方法来检测上述4种金属材料的细胞毒性，为这4种材料的临床使用提供可靠的生物学依据。

材料方法

设计：口腔材料的细胞毒性实验-体外法。
时间及地点：实验于2011年9月至2012年3月在东南大学医学院中心实验室完成。
材料：
三种比色法评价4种牙科金属材料对L-929细胞的毒性实验的细胞、试剂及仪器：
Cells, reagents and instruments for evaluation of the cytotoxicity of four dental metal materials toward L-929 cells by using three assay systems:

实验方法：
材料浸提液的制备：将上述4种牙科金属材料分别制备成10 mm×10 mm×1 mm块状样品，每种材料10个试样。用蒸馏水超声波清洗10 min，高温高压(15磅、121 ℃)条件下灭菌处理20 min。根据ISO 10993-12：2002标准^[17]，按照3 cm2/mL比例加入含体积分数10%小牛血清的高糖DMEM培养液，静置于培养箱，37 ℃、体积分数5%CO²、湿度95%下浸提72 h作为实验材料的浸提液。
细胞培养：L-929细胞为梭形，呈贴壁生长，培养液为高糖DMEM培养液。细胞培养置于37 ℃、体积分数5% CO₂饱和湿度的孵箱中培养，孵育二三天后用0.25%胰蛋白酶消化传代，实验时选对数生长期细胞进行实验。
实验分组：实验组分别为镍铬合金、钴铬合金、纯钛及3铬13等金属材料的浸提液；阴性对照组为含体积分数10%小牛血清的高糖DMEM培养液；阳性对照组为含0.7%丙烯酰胺、体积分数10%小牛血清的高糖DMEM培养液。
MTT比色法检测：取对数生长期L-929细胞以 3×10⁷ L^-1浓度的细胞悬液接种于96孔培养板，每组6个复孔，每孔200 μL，置于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中培养24 h；再分别以镍铬合金等实验材料浸提液、阴性对照组与阳性对照组替换(200 μL/孔)，继续置于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中培养24，72 h。倒置显微镜下观察细胞生长情况并拍照，加入5 g/L MTT溶液20 μL/孔，继续在体积分数5%CO2培养箱孵育4 h，去培养上清，加入二甲基亚砜150 μL/孔，在自动酶标仪上振荡10 min，使溶液完全混匀并溶解结晶蓝，在酶标仪上用492 nm波长测出吸光度(A)值，并记录。
CCK-8比色法检测：取对数生长期L-929细胞以浓度为3×10⁷ L^-1的细胞悬液接种于96孔培养板，每组6个复孔，每孔200 μL，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养24 h；再分别以镍铬合金等实验材料浸提液、阴性与阳性对照组替换(200 μL/孔)，继续置于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中培养24，72 h。每孔加入20 μL的CCK-8溶液，继续在体积分数5%CO₂培养箱孵育4 h，将96孔平底细胞培养板置于摇床上摇动1 min，在酶标仪上用450 nm波长测其A值。
结晶紫比色法检测：取对数生长期L-929细胞以浓度为3×10⁷ L^-1的细胞悬液接种于96孔培养板，每组6个复孔，每孔200 μL，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养24 h；再分别以镍铬合金等实验材料浸提液、阴性与阳性对照组替换(200 μL/孔)，继续置于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中培养24，72 h后，去培养液，加入1%戊二醛固定20 min，去离子水洗2遍，置空气中自然干燥，再加入0.02%结晶紫液对细胞染色，振摇15 min，用蒸馏水洗涤3遍，置空气中干燥后，添加150 μL体积分数70%的乙醇对细胞吸收的结晶紫进行提取，室温放置并轻度振荡15 min；在酶标仪上用595 nm波长测其A值。
细胞相对增殖率的计算：各组材料浸提液培养细胞后，用MTT等三种比色法测得的A值，按下面公式计算出细胞相对增殖率(relative growth rate，RGR)的范围。

细胞毒性评价标准：根据各组材料的细胞相对增殖率，按6级毒性分级法评定材料的细胞毒性程度^[18]。
细胞毒性评价标准：
Standard for cytotoxicity evaluation:

主要观察指标：①L-929细胞生长形态。②4种牙科金属材料浸提液对L-929细胞相对增殖率的影响。
统计学分析：用SPSS 11.5统计软件对各组材料数据进行单因素方差分析(ANOVA)，以P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

镍铬合金等4种牙科金属材料是口腔临床中常用的材料，且与口腔软硬组织直接接触，研究材料生物相容性具有非常重要的意义。由于牙科金属材料在口腔内可能导致的不良生物学反应主要是因为其释出的金属离子引起的，因此实验参照ISO10993-12：2002标准^[17]，通过将这4种牙科金属材料浸泡于细胞培养液中使金属离子释放，并用该培养液进行细胞培养来模拟金属合金对机体的影响^[19]。

与所有的生物材料研究方法一样，学者们主要是从整体水平、细胞水平、分子水平等3个层次对上述金属材料的生物相容性进行研究。生物相容性整体水平的评价方法主要是通过动物实验，也包括一些临床的人体实验进行的，它的优点是最接近实际应用，因而能真实全面地反映材料作用于机体后的总体情况；其缺点在于成本高昂，实验复杂、耗时且繁琐，不容易控制个体差异和干扰因素等。相对于整体水平研究而言，细胞毒性实验具有操作简单、易标准化、周期短、敏感性强，且能定量分析等优点，是生物医学材料生物安全性评价体系中最重要的检测指标之一。

细胞毒性评价的方法有很多，常用的方法有琼脂覆盖法、分子滤过法、细胞增殖度法、细胞生长抑制法等，但目前对牙科金属材料的细胞毒性研究多采用某一种方法，例如Imirzalioglu等^[20]采用MTT比色法研究显示镍铬合金与钴铬合金对牙龈成纤维细胞的毒性差别无显著性意义；Wang等^[21]采用MTT法研究显示钴铬合金及镍铬合金的细胞毒性为1级，但镍铬合金与阴性对照组之间的细胞毒性差异有显著性意义；乔广艳等^[22]采用CCK-8比色法研究显示镍铬合金组的细胞毒性显著高于钴铬合金组和金合金组，而钴铬合金组与金合金组之间无显著差异，但3种材料的细胞毒性分级均为1级，表现为轻微毒性；金长山等_[23]采用MTT法研究显示在自制镍铬烤瓷合金、纯钛组、镍铬合金组与阴性对照组之间的细胞毒性差异均无显著性意义。通过上述研究结果不难发现不同的细胞毒性研究方法对同一类材料的研究结果并不完全一致。Tu等^[24]采用了MTS、WST-1及CellTiter-GLO荧光细胞活性检测系统等3种不同细胞毒性检测方法对9种市售树脂黏结剂及2种树脂单体对人口腔上皮细胞毒性进行了研究，结果也显示采用不同的实验方法检测相同材料的细胞毒性其结果并不完全一致。为了获得较为客观的结果，在实验采用MTT等3种比色方法来检测上述4种金属材料的细胞毒性，为4种材料的临床使用提供可靠的生物学依据。

MTT法原理是利用活细胞的线粒体脱氢酶在代谢过程中将黄色的可溶性MTT还原为不溶于水的紫色产物2甲臜晶体，晶体生成的量与活细胞数量和细胞活化状态呈线性关系。2甲臜经合适的裂解液如二甲亚砜作用，结晶溶解显色，再通过酶标仪测量该细胞液的A值，检测出待测细胞样品存活细胞数量的多少及细胞代谢活性的强弱。自1983年Mosmann创立了MTT比色法以来，由于其经济、无放射性污染等特点，使之成为细胞生物学及相关研究领域的一种常用的细胞活性检测方法[25]，如吕晓迎等^[26]应用MTT实验法对25种牙科合金材料的细胞毒性进行了评定，认为该方法优点突出，有良好的实用价值。然而，在使用MTT法测试细胞活性时需要使用裂解液溶解甲臜晶体沉淀，可能遇到颗粒不完全溶解，以及在吸取上清的操作中也极易带走部分细胞等问题，导致MTT法的检测稳定性不佳，对于重复性实验，结果容易出现较大差异^[27]。

CCK-8是MTT的一种升级替代产品，CCK-8试剂中所含的WST-8(2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4- nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H)在电子载体(1-Methoxy PMS)的作用下能被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的橙黄色甲臢物，生成的甲臢物的数量与活细胞的数量成正比，直接通过酶标仪测量细胞液的吸光度值A值，便可检测出待测细胞样品的存活细胞数量的多少及细胞代谢活性的强弱。由于在使用CCK-8检测细胞毒性评价中不需要使用裂解液溶解沉淀，不需要吸取上清，因而不容易造成细胞的丢失，实验结果更加稳定^[27]。熊建文等^[27]利用人前髓细胞(HL60)作为研究对象，对比了MTT法和CCK-8法在最佳检测时刻和检测波长等参数的差异，实验结果表明用CCK-8法检测的吸光度A值与活细胞数的线性相关度要优于MTT法，是一种灵敏度较高、重复性好的的细胞活性检测方法。张丹等^[28]及李宁等^[29]分别通过MTT法和CCK-8法的对比研究，结果表明CCK-8法较MTT法检测的灵敏度高，准确性好，是一种优于MTT法的检测细胞增殖活性的方法。

与MTT，CCK-8比色法检测原理不同，结晶紫比色法是利用碱性阳离子染料结晶紫将活细胞DNA染色，通过酶标仪测量细胞液的吸光度值A值或分光光度计比色来反映细胞的数量。例如：Eckhardt等^[30]用结晶紫比色法检测牙科树脂单体成分三乙二醇二甲基丙烯酸酯(triethylene glycol dimethacrylate,TEGDMA)的细胞毒性，Thumwanit等[31]采用结晶紫比色法检测口腔粘接剂的细胞毒性。结晶紫比色法的优点为快而灵敏，且细胞形态能够被保留；但其特异性不高，一些情况下，所有的吸附细胞包括死亡细胞也都被认为是活细胞，会出现假阳性。

比较MTT等3种比色方法来检测上述4种金属材料的细胞毒性的实验结果，发现不同的实验方法其实验结果并不完全一致。例如在24 h组，CCK-8比色法研究结果显示钴铬合金组的细胞相对增殖率低于阴性对照组(P < 0.05)，而MTT及结晶紫比色法研究结果显示钴铬合金组的细胞相对增殖率与阴性对照组比较差异无显著性意义(P > 0.05)；在72 h组，4种牙科金属材料的MTT比色法的实验结果与其CCK-8及结晶紫比色法结果不一致。尽管上述实验方法的结果并不完全一致，但3组实验结果数据均证实这4种牙科金属材料的细胞毒性均为0-1级，符合GB/T16886.5-2003标准，均为合格。

另外实验通过形态学观察发现，4种牙科金属材料实验组的细胞形态与阴性对照组无明显差异，细胞生长良好，胞内结构清晰，无空泡变性，并随着培养时间延长细胞数量大量增殖；而0.7%丙烯酰胺阳性对照组的细胞数量明显减少，形态完整性受破坏，形成大量细胞碎片，表明细胞已丧失健康的生长状态，增殖活力降低。该细胞形态学研究结果也提示上述4种牙科金属实验组材料具有良好的细胞相容性，与MTT等3种比色方法实验结果相一致。

虽然实验结果数据均显示镍铬合金等4种牙科金属材料具有良好的细胞相容性，但仅从细胞水平对其此类材料的生物相容性进行了研究，还有待于深入到分子水平对该材料的生物相容性进行进一步评估，以确保该材料安全地用于口腔临床领域。

基金资助：江苏省科技型企业技术创新资金项目(BC2009001)，东南大学生物电子学国家重点实验室开放研究基金资助课题 (2011E15)。
作者贡献：课题设计为通讯作者，实施为第一、二、三、四作者，评估为第一作者。采用盲法评估。
利益冲突：课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济组织直接或间接的经济或利益的赞助。
伦理要求：未涉及与伦理相冲突的内容。
作者声明：文章为原创作品，数据准确，内容不涉及泄密，无一稿两投，无抄袭，无内容剽窃，无作者署名争议，无与他人课题以及专利技术的争执，内容真实，文责自负。

三种比色法评价4种牙科金属材料对L-929细胞的毒性

Evaluating cytotoxicity of four different dental metal materials toward L-929 cells using three assay systems

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