纤维蛋白胶复合骨形态发生蛋白2塑形Bio-oss修复下颌骨缺损

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.08.003

摘要/Abstract

摘要：

背景：Bio-oss的颗粒状结构通常应用于洞形缺损的充填性移植，对于三壁以上的缺损修复难以成形。
目的：评价Bio-oss以纤维蛋白胶复合骨形态发生蛋白2作为赋形材料后的成骨性能。
方法：拔除9条杂种犬双侧下颌第2，4前臼齿及第2臼齿，造成1 cm×1 cm的骨缺损区，将Bio-oss+纤维蛋白胶+骨形态发生蛋白2、Bio-oss+纤维蛋白胶及Bio-oss材料分别植入第2，4前臼齿及第2臼齿骨缺损区。
结果与结论：各组软组织均一期愈合。Bio-oss复合纤维蛋白胶后，骨粉结合紧密，不易剥离。术后4，8，12周时 Bio-oss+纤维蛋白胶+骨形态发生蛋白2组新生骨百分率均高于其他两组(P < 0.05)。表明纤维蛋白胶的加入可以解决Bio-oss成形困难的问题，骨形态发生蛋白2的加入可促进成骨效果。

关键词: 生物材料, 组织工程骨材料, 组织工程软骨材料, 纤维蛋白胶, 骨形态发生蛋白, 无机牛骨, 下颌骨缺损, 塑形, 省级基金, 生物材料图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Bio-oss granular structure is normally used for hole-shaped defects in the form of filling transplantation, but it is difficult to forming for more than three-wall defects.
OBJECTIVE: To evaluate the osteogenic activities of Bio-oss after combination with fibrin glue and bone morphogenetic protein-2 in the repair of canine mandibular defects.
METHODS: The second and fourth premolar teeth and the second molar teeth were extracted bilaterally in nine hybrid canines, resulting in 1 cm × 1 cm bone defect. Bio-oss, Bio-oss+fibrin glue and Bio-oss+fibrin glue+bone morphogenetic protein-2 were implanted into bone defects of the second, fourth premolar teeth and the second molar teeth, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: Stage Ⅰ healing of soft tissues was achieved in all animals. Bio-oss was closely combined with fibrin glue, which was difficult to be separated. The proportion of new bone was higher in the Bio-oss+fibrin glue+bone morphogenetic protein-2 group than in the other two groups at 4, 8, and 12 weeks after extraction (P < 0.05). It shows that fibrin glue can solve the difficulty in Bio-oss formation, and Bio-oss combined with bone morphogenetic protein-2 can promote osteogenic activities.

Key words: biomaterials, tissue engineering bone materials, tissue engineering cartilage materials, fibrin glue, bone morphogenetic protein, inorganic bovine bone, mandibular defects, modeling, provincial grants-supported paper, biomaterial photographs-containing paper

中图分类号:

R318

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Tian Gang, Xu Xiao-gang, Zhou Zhong-hua, Gao Jian-yong. Bio-oss combined with fibrin glue and bone morphogenetic protein-2 to repair mandibular defects[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(8): 1344-1348.

图/表（结果） 4

2.1 软组织愈合情况 3组材料植入后伤口均达到一期愈合。

2.2 骨粉性状观察结果 术后4周时在使用纤维蛋白胶的部位，骨粉结合紧密，不易剥离，在未使用纤维蛋白胶的部位，发现有散在骨粉颗粒附着在正常骨质表面，容易剥离脱落。术后8，12周时情况类似。

2.3 各组材料植入后组织切片观察结果 见图1。

Bio-oss组：术后4周时，纤维结缔组织包绕骨粉颗粒，结缔组织之间有少量不成熟的新骨形成；8周时，骨粉颗粒周围被纤维结缔组织和新生骨组织包绕，新生骨的数量较纤维结缔组织多；12周时，新生骨组织包绕骨粉颗粒，可见到丰富的成骨细胞，骨粉出现凹陷的部位可以看见多核破骨细胞。

Bio-oss+纤维蛋白胶组：术后4周时，骨粉颗粒被纤维结缔组织包绕，新生骨数量较少；8周时，骨粉颗粒周围被新生骨以及纤维结缔组织包绕，新生骨数量与纤维结缔组织基本相同；12周时，骨粉颗粒周围纤维结缔组织数量极少，基本上完全被新生骨围绕，相互联结成网状或片状。

Bio-oss+纤维蛋白胶+骨形态发生白2组：术后4周时，骨粉颗粒分布均匀，被纤维结缔组织包绕，可见新生骨形成；8周时，骨粉颗粒被纤维结缔组织以及新生骨包绕，新生骨的数量明显大于纤维结缔组织，同时可以看到骨粘合线形成；12周时，沉积到Bio-oss颗粒表面上的新生骨为已矿化的成熟骨，有些区域可见新生的类骨质沉积于新骨表面或Bio-oss颗粒表面，大多数Bio-oss颗粒上的骨陷窝内充满着骨细胞，个别区域内可见毛细血管。有的Bio-oss边缘不规则，呈锯齿状的“吞蚀现象”，可见到破骨细胞的存在。颗粒周围及界面均无炎症细胞浸润。

2.4 计算机图像分析结果 见表1。

由表1可见，术后4，8，12周时的新生骨百分率，Bio-oss+纤维蛋白胶组低于Bio-oss组，Bio-oss+纤维蛋白胶+骨形态发生蛋白2组均高于其他两组(P < 0.05)。表明使用纤维蛋白胶对Bio-oss塑形后降低了新骨形成的比例；复合骨形态发生蛋白2后，增加了新生骨比例。

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引言

材料方法

设计：对比观察动物实验。
时间及地点：于2009年11月至2011年2月在解放军第二军医大学动物实验中心及长海医院病理科完成。
材料：
实验动物：三四岁龄健康杂种犬9条，由解放军第二军医大学动物实验中心提供，雌雄不拘，体质量13-16 kg。
试剂：Bio-oss颗粒(瑞士盖氏制药有限公司)；重组人骨形态发生蛋白2(杭州华东基因技术研究所)；纤维蛋白胶(海松力生物科技有限公司)。
实验方法：
含有1 mg/L重组人骨形态发生蛋白2纤维蛋白胶的制备：称5 μg重组人骨形态发生蛋白2粉末放入量杯，将纤维蛋白胶5 mL注入量杯，混匀，备用。
Bio-oss的成形：体外配好纤维蛋白胶，以及含有1 mg/L重组人骨形态发生蛋白2的纤维蛋白胶，将Bio-oss骨粉与纤维蛋白胶按照1∶1的体积比混合后体外成形备用。
实验分组及干预：将犬标记、称质量后，3%戊巴比妥按照1 mL/kg剂量经后肢小隐静脉注射麻醉，同时静脉滴注青霉素钠盐160×10⁴ U，麻醉起效后，开始手术。参照Broggini等^[13]制备颌骨缺损动物模型方法，首先拔除犬右侧下颌的第2，4前臼齿及第2臼齿，分别将拔牙部位颊侧牙龈的近远中向前厅沟方向切开，切至骨膜，翻开黏骨膜瓣，舌侧不切开，仅将黏骨膜瓣与骨面剥离，此时已经暴露骨质，裂钻截除拔牙区的骨质，造成1 cm×1 cm大小骨缺损区。黏骨膜瓣剥离范围在缺损区外2 mm，此时在颊侧黏骨膜瓣蒂部切开骨膜，游离颊瓣减少张力，生理盐水冲洗伤口，等待修复。在第2，4前臼齿及第2臼齿缺损区分别植入Bio-oss+纤维蛋白胶+骨形态发生蛋白2、Bio-oss+纤维蛋白胶、Bio-oss。将颊瓣与舌侧牙龈对位缝合，关闭伤口。术后肌肉注射青霉素钠盐80×10⁴ U，2次/d，连续4 d。术后2周半流饮食，后改普通饲料喂养。术后第7天拆除缝线。
软组织愈合情况：于术后4，8，12周各处死3条犬，观察软组织愈合情况。
骨粉性状：取材后，大体标本观察骨粉性状。
新生骨组织形态学观察：标本取材后，脱钙、包埋、切片，苏木精-伊红染色，组织切片观察新生骨的生长情况。
新生骨百分比测定：组织切片采集图像后，采用Photoshop软件中的histogram(直方图)功能进行分析，每份样本随机测定3个部位后取平均值，分析新生骨在骨缺损区域所占面积的百分比，得出新生骨百分率。
主要观察指标：3组材料植入后软组织愈合、骨粉性状及新生骨组织形态学观察结果。
统计学分析：采用SAS统计软件分析，新生骨百分率各组间差异采用方差分析，以P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

实验利用纤维蛋白胶的黏合力，将散在骨粉颗粒成形，使其更加容易操作。但纤维蛋白胶复合Bio-oss后的新生骨百分率较单纯使用Bio-oss有所下降^[10，14-15]。实验将Bio-oss-纤维蛋白胶与骨形态发生蛋白2复合后修复骨缺损，在术后4，8周时的成骨百分率均大于Bio-oss组10个百分点以上，证实骨形态发生蛋白2促进了早期骨缺损的修复再生。这说明单纯使用Bio-oss难以在短时间内形成新骨，通过在Bio-oss中复合具有骨诱导活性的骨形态发生蛋白2则可以更快、更有效修复骨缺损^[16]；而纤维蛋白胶与骨形态发生蛋白2复合后也并未影响骨形态发生蛋白本身的骨诱导活性。原因是纤维蛋白胶的网状微观结构有助于骨形态发生蛋白2的附着^[17]，其内部良好的微环境及大分子蛋白可以保护骨形态发生蛋白2不发生非特异性蛋白水解，这与某些学者的报道也相同^[18-19]。但是随着时间的推移，在8-12周时，Bio-oss组新生骨百分率增加了25%左右，而Bio-oss+纤维蛋白胶+骨形态发生蛋白2组只增加了10%左右，并且两组成骨率在12周时无差异，这说明骨形态发生蛋白2在8周以后不能发挥骨诱导的作用。原因是虽然纤维蛋白胶的可吸收性有利于骨形态发生蛋白2的缓慢释放，随着纤维蛋白胶的吸收，在植入材料周围形成了一个骨形态发生蛋白2的浓度梯度，延长了骨形态发生蛋白2的作用时间，使其诱导活性得以最大限度发挥，但纤维蛋白胶的吸收时间为4周左右，所以骨形态发生蛋白2的作用时间只能延长至4周以后，在8周以后，随着纤维蛋白胶的吸收，骨形态发生蛋白2的骨诱导作用也逐渐消失，因此纤维蛋白胶的缓释作用是短暂的。有报道指出，纤维蛋白胶与生物制剂混合使用，可以使生物制剂在局部缓释并维持有效浓度，从而延长有效作用时间，提高其生物利用效能，但是这种缓释作用延长的有效作用时间依赖于纤维蛋白胶的吸收时间^[20]，因此，这种缓释作用仅在早期有效，这与本实验的结果一致。

另一方面可能的原因是在早期(4-8周)，骨形态发生蛋白2和纤维蛋白胶复合后发生了这样的作用：骨形态发生蛋白2能够使未分化间充质细胞不可逆的分化形成骨细胞，并且促进骨组织特异性标志物的形成，而纤维蛋白胶首先刺激了未分化间充质细胞的增殖和分化，从而为骨形态发生蛋白2的骨诱导以及促进增殖活动提供了丰富的靶细胞环境和理想的微环境，随着纤维蛋白胶的吸收，释放后的骨形态发生蛋白与靶细胞直接接触而发挥其骨诱导作用，促进成骨。但是纤维蛋白胶在4周时已经吸收，4周后骨形态发生蛋白随着纤维蛋白胶的吸收而降解，到了8周以后，骨形态发生蛋白2的活性逐渐降低，因此，在后期(12周)，Bio-oss+纤维蛋白胶+骨形态发生蛋白2组的成骨百分率与Bio-oss组无明显差别。

不过实验并未对骨形态发生蛋白2浓度和活性进行检测，只是根据成骨量的变化分析骨形态发生蛋白2的效能。从实验结果推测，Bio-oss-纤维蛋白胶复合骨形态发生蛋白2后，Bio-oss的骨引导能力与骨形态发生蛋白2的诱导成骨性相结合，一方面骨形态发生蛋白2随着纤维蛋白胶的吸收而释放后，吸附于Bio-oss颗粒表面，骨诱导活性得以发挥，另一方面Bio-oss的支架结构利于新生骨的长入，维持缺损区的外形。因此，Bio-oss-纤维蛋白胶复合骨形态发生蛋白2作为骨修复材料，可以缩短骨缺损修复愈合的疗程。但随着骨形态发生蛋白2的降解，其作用也逐渐消失。

对于牙槽嵴这类缺损的修复难度面临两个问题，即成骨后骨吸收和成形困难。自体骨移植后60%发生吸收，而Bio-oss植入后仅有20%发生吸收。3种材料复合后，Bio-oss发挥支持作用，骨形态发生蛋白2诱导骨组织再生，纤维蛋白胶对骨粉进行体外成形，纤维蛋白胶同时又是成骨细胞爬行和骨再生细胞因子的良好载体，纤维蛋白具有促进血管化、骨传导等多种特性和生理功能，又是骨形态发生蛋白2的良好载体，这样既解决了成骨问题，又解决了成形困难的问题。3种材料复合后具有以下特性：①良好的生物相容性。②Bio-oss的力学特性。③Bio-oss的骨传导性。④骨形态发生蛋白的骨诱导性。⑤可塑性。这些特性与理想修复材料的要求接近，因此，推断这3种材料的复合物是良好的骨缺损修复材料，可以促进成骨。但实验骨缺损范围仅1 cm，对于较大的缺损修复是否可行还有待进一步研究。

致谢：感谢解放军第二军医大学动物实验中心袁卫老师及长海医院病理科吴小辉老师在实验中给予的指导与帮助。
基金资助：上海医院“1255”学科建设计划科研创新探索项目(CH125541800)；上海市卫生局局级课题面上项目。
作者贡献：田刚进行实验实施、资料收集、成文，徐晓刚进行实验设计，周中华审校，高建勇为手术助手。田刚对文章负责。
利益冲突：课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济组织直接或间接的经济或利益的赞助。
伦理要求：实验中对动物的处置符合2009年《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的条例。
作者声明：文章为原创作品，数据准确，内容不涉及泄密，无一稿两投，无抄袭，无内容剽窃，无作者署名争议，无与他人课题以及专利技术的争执，内容真实，文责自负。

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延伸阅读

本实验利用纤维蛋白胶的黏合力，将散在骨粉颗粒成形，使其更加容易操作。但纤维蛋白胶复合Bio-oss后的新生骨百分率较单纯使用Bio-oss有所下降。本实验将Bio-oss-纤维蛋白胶与骨形态发生蛋白2复合后修复骨缺损，在术后4，8周时的成骨百分率均大于Bio-oss组10个百分点以上，证实骨形态发生蛋白2促进了早期骨缺损的修复再生。这说明，单纯使用Bio-oss难以在短时间内形成新骨，通过在Bio-oss中复合具有骨诱导活性的骨形态发生蛋白2则可以更快、更有效修复骨缺损；而纤维蛋白胶与骨形态发生蛋白2复合后也并未影响骨形态发生蛋白本身的骨诱导活性。原因是纤维蛋白胶的网状微观结构有助于骨形态发生蛋白2的附着，其内部良好的微环境及大分子蛋白可以保护骨形态发生蛋白2不发生非特异性蛋白水解，这与某些学者的报道也相同。但是随着时间的推移，在8-12周时，Bio-oss组新生骨百分率增加了25%左右，而Bio-oss+纤维蛋白胶+骨形态发生蛋白2组只增加了10%左右，并且两组成骨率在12周时无差异，这说明骨形态发生蛋白2在8周以后不能发挥骨诱导的作用。原因是虽然纤维蛋白胶的可吸收性有利于骨形态发生蛋白2的缓慢释放，随着纤维蛋白胶的吸收，在植入材料周围形成了一个骨形态发生蛋白2的浓度梯度，延长了骨形态发生蛋白2的作用时间，使其诱导活性得以最大限度发挥，但纤维蛋白胶的吸收时间为4周左右，所以骨形态发生蛋白2的作用时间只能延长至4周以后，在8周以后，随着纤维蛋白胶的吸收，骨形态发生蛋白2的骨诱导作用也逐渐消失，因此纤维蛋白胶的缓释作用是短暂的。有报道指出，纤维蛋白胶与生物制剂混合使用，可以使生物制剂在局部缓释并维持有效浓度，从而延长有效作用时间，提高其生物利用效能，但是这种缓释作用延长的有效作用时间依赖于纤维蛋白胶的吸收时间，因此，这种缓释作用仅在早期有效，这与本实验的结果一致。