基质细胞衍生因子1α培养心肌细胞和成纤维细胞的增殖与迁移

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.07.015

摘要/Abstract

摘要：

背景：在心脏缺损边缘造成新创面能够促进缺损自愈，基质细胞衍生因子1α能够促进血管生成以及心脏功能。
目的：探讨物理损伤及基质细胞衍生因子1α对心肌细胞增殖的影响及心肌细胞对心脏成纤维细胞迁移的趋化作用。
方法：原代分离培养大鼠心肌细胞和心脏成纤维细胞，采用刮伤法建立物理损伤模型，并应用10- 160 μg/L的基质细胞衍生因子1α进行干预；CCK-8法检测心肌细胞的增殖能力；Transwell法检测心肌细胞趋化下心脏成纤维细胞的迁移能力。
结果与结论：不同浓度的基质细胞衍生因子1α均可提高物理损伤下心肌细胞的增殖能力，尤以80 μg/L基质细胞衍生因子1α作用下心肌细胞增殖最明显。同时，物理损伤联合基质细胞衍生因子1α培养的心肌细胞可显著增加心脏成纤维细胞的迁移能力，并且随着趋化培养时间的延长，迁移能力增加更明显。可见基质细胞衍生因子1α能提高物理损伤心肌细胞的增殖能力，物理损伤联合基质细胞衍生因子1α培养的心肌细胞对心脏成纤维细胞的迁移具有促进作用。

关键词: 组织构建, 组织构建与生物活性因子, 心肌细胞, 心脏成纤维细胞, 基质细胞衍生因子1α, 物理损伤, 先天性心脏缺损, 房间隔缺损, 室间隔缺损, 动脉导管未闭, 增殖, 趋化, 国家自然科学基金, 组织构建图片文章

Abstract:

BACKGROUND: New wound in the border of defected hearts can promote self-healing, and stromal cell-derived factor-1 alpha can promote angiogenesis and cardiac function.
OBJECTIVE: To investigate the effects of mechanical injury and stromal cell-derived factor-1 alpha on the proliferation of cardiomyocytes and the effects of cardiomyocytes on chemotactic migration of cardiac fibroblasts.
METHODS: Rat cardiomyocytes and cardiac fibroblasts were cultured primarily. Rat cardiomyocytes were injured mechanically by scratching, and treated with 10-160 μg/L stromal cell-derived factor-1 alpha. The Cell Counting Kit-8 assay was employed to evaluate the proliferation of cardiomyocytes and the Transwell migration assay was used to detect the chemotaxis and migration capability of cardiac fibroblasts.
RESULTS AND CONCLUSION: Under mechanical injury condition, stromal cell-derived factor-1 alpha significantly promoted the growth of cardiomyocytes with the maximum effect occurring at 80 μg/L. In addition, mechanically injured and stromal cell-derived factor-1 alpha cultured cardiomyocytes remarkably promoted the migration of cardiac fibroblasts in a time-dependent fashion. These findings indicate that stromal cell-derived factor-1 alpha could promote the growth of cardiomyocytes under mechanical injury condition; otherwise, mechanically injured and stromal cell-derived factor-1 alpha cultured cardiomyocytes could promote the migration of cardiac fibroblasts.

Key words: tissue construction, tissue construction and bioactive factors, cardiomyocytes, cardiac fibroblasts, stromal cell-derived factor 1 alpha, physical damage, congenital heart defects, atrial septal defects, ventricular septal defects, patent ductus arteriosus, proliferation, chemokines, the National Natural Science Foundation of China, tissue construction photographs-containing paper

中图分类号:

R318

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图/表（结果） 5

2.1 细胞分离培养与鉴定结果 刚接种时心肌细胞尚未贴壁，呈圆形，约2 h后开始逐渐贴壁生长，培养24 h时的心肌细胞多呈短梭形或多角形，也有圆形、棱形、椭圆、棒状、星状以及分叉状不等，见图1A，且细胞表现为抽搐性搏动。心肌成纤维细胞胞体较大，胞质透明，生长较迅速，有交叉重叠生长现象，见图1B，无自发性搏动现象。

免疫荧光染色显示，细胞心肌肌钙蛋白Ⅰ呈阳性表达，可明显见到心肌的特异性横纹结构，说明所分离的细胞为心肌细胞，见图2。

锥虫蓝染色结果显示，所分离心肌细胞存活率为(92.23±1.62)%。

2.2 物理损伤及基质细胞衍生因子1α对体外培养的大鼠心肌细胞存活率的影响 物理损伤后，部分细胞被刮掉出现道状划痕，与对照组相比，刮伤组细胞存活率降低，当加入基质细胞衍生因子1α浓度为40 μg/L时细胞存活率即开始显著升高(P < 0.05)，见图3，当基质细胞衍生因子1α质量浓度增加至80 μg/L时细胞存活率提高最为明显(P <0.01)，随着基质细胞衍生因子1α质量浓度的增加存活率曲线趋于平缓，所以选择基质细胞衍生因子1α浓度为80 μg/L进行后续实验。

2.3 物理损伤及基质细胞衍生因子1α干预的心肌细胞对心脏成纤维细胞迁移能力的影响 Transwell实验结果显示，与对照组比较，细胞刮伤组和基质细胞衍生因子1α培养组心脏成纤维细胞迁移数均有所增加，见图4。趋化培养24 h时，分别为对照组的1.67倍和2.32倍，细胞刮伤联合基质细胞衍生因子1α培养组细胞迁移数达到最高，约为对照组的3.13倍，见表1。随着趋化培养时间的延长，心脏成纤维细胞迁移数有所增加。表明物理刮伤心肌细胞联合基质细胞衍生因子1α培养可进一步增加心脏成纤维细胞的迁移趋化作用，提高其迁移率。

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引言

材料方法

设计：体外细胞学观察实验。
时间及地点：于2012年5至10月在解放军沈阳军区总医院心血管病研究所国家级重点实验室完成。
材料：
实验动物：选择清洁级新生1-3 d的远交群SD大鼠进行心肌细胞和成纤维细胞的原代分离，体质量5.0- 6.0 g，雌雄不限，购自中国医科大学实验动物中心，许可证号：SYXK(辽)2003-0013。
物理损伤及基质细胞衍生因子1α培养大鼠心肌细胞和成纤维细胞的增殖与迁移实验中所用主要试剂及仪器：
Main reagents and instruments used to detect the effect of mechanical injury and stromal cell-derived factor-1 alpha on the proliferation and migration of cardiomyocytes and cardiac fibroblasts:

实验方法：
原代分离培养大鼠心肌细胞和心脏成纤维细胞：将新生1-3 d SD大鼠颈椎脱臼处死，开胸取出左心室，用PBS反复冲洗，以洗净残留积血。将心室剪成1 mm³心肌组织块，用0.7 g/L的胰蛋白酶和0.5 g/L的Ⅱ型胶原酶在 37 ℃水浴中反复消化直至组织完全消失。每次消化的上清液均加入等体积的含血清培养基终止消化反应。将消化下来的细胞悬液1 000 r/min离心10 min，弃上清液。沉淀物中加入1.0-2.0 mL含体积分数10%胎牛血清的高糖DMEM培养基，用吸管轻轻吹打制成细胞悬液，200目筛网过滤后分装于24孔板中，置于培养箱中培养。2 h后心脏成纤维细胞贴壁，上清悬液中则为较纯的心肌细胞，将心肌细胞悬液重新接种于24孔板中，待心肌细胞贴壁后，换成含0.1 mmol/L 5-溴脱氧尿核苷的高糖DMEM培养基，以抑制成纤维细胞的增殖。心脏成纤维细胞则添加含体积分数10%胎牛血清的高糖DMEM培养基。将培养板置于37 ℃、体积分数5%CO₂、饱和湿度条件下继续培养，免疫荧光法检测心肌肌钙蛋白Ⅰ的表达，鉴定心肌细胞。
细胞存活率检测：2.5 g/L胰酶消化、收集细胞，1 mL细胞重悬液重悬细胞。吸取100 μL重悬细胞至1.5 mL EP管中，加入100 μL锥虫蓝染色液，混匀，染色3 min。吸取少量染色细胞，血球计数板计数，数出蓝色细胞和细胞总数。

大鼠心肌细胞物理损伤模型的建立：分离培养的大鼠心肌细胞培养于含体积分数10%胎牛血清的高糖DMEM培养基中，在37 ℃、体积分数5%CO₂、饱和湿度条件下的细胞培养箱中培养，细胞贴壁生长。去血清饥饿 24 h使细胞同步化于G0期，将200目筛网剪至2.5 cm长，灭菌后在细胞培养板上沿同一个方向刮伤细胞，使融合生长的大鼠心肌细胞出现平行的道状划痕。
CCK-8法检测大鼠心肌细胞的存活率：胰蛋白酶消化收集正常细胞和刮伤细胞，接种于96孔培养板中。分组为：对照组，正常条件培养细胞；刮伤组，细胞刮伤但不加基质细胞衍生因子1α；刮伤联合基质细胞衍生因子1α培养组，细胞刮伤后加入10，20，40，80，160 μg/L 基质细胞衍生因子1α进行培养。所有细胞培养24 h后行增殖能力检测，每孔加入10 μL CCK-8试剂孵育，检测细胞的A450值，每组设置5个复孔，按照公式计算细胞存活率，根据细胞存活情况确定基质细胞衍生因子1α的有效作用浓度。

Transwell法检测心肌细胞对心脏成纤维细胞迁移能力的影响：分组为4组：对照组，即正常生长条件下培养细胞；细胞刮伤组；基质细胞衍生因子1α培养组，根据上述CCK-8结果确定基质细胞衍生因子1α最佳浓度，用其培养细胞；细胞刮伤联合基质细胞衍生因子1α培养组，即细胞刮伤后加入最佳浓度基质细胞衍生因子1α。Transwell小室的下室预先接种上述各实验组细胞，待细胞贴壁24 h后，上室加入0.1 mL细胞浓度为1×10⁹L^-1的心脏成纤维细胞，上述各组细胞在37 ℃、体积分数5%CO₂、饱和湿度条件下分别培养24，48，72 h。取出Transwell小室，PBS冲洗，用棉签擦去微孔膜上层细胞；多聚甲醛室温下固定20 min，苏木精染液染色 3 min，蒸馏水冲洗，在倒置显微镜下(×200)对迁移至微孔膜下层的细胞计数。每个样本选取3个视野计数细胞个数，取平均数。
主要观察指标：①物理损伤及基质细胞衍生因子1α干预下体外培养的大鼠心肌细胞的增殖能力。②物理损伤及基质细胞衍生因子1α干预的心肌细胞对心脏成纤维细胞迁移能力的影响。
统计学分析：采用SPSS 16.0软件进行统计学处理，各组数据以x(_)±s表示，组间比较采用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

早期开胸手术治疗先天性心脏缺损不仅创伤大且有一定的危险性。近年兴起经导管置入封堵器介入治疗先天性心脏缺损与开胸手术相比创伤小、危险性低而被许多患者接受，已在临床广泛应用；但是置入金属封堵器存在封堵器栓塞、术后残余漏、心律失常、心肌穿孔、三尖瓣腱索断裂等并发症^[7-8]，随着医学科学技术的不断发展，研究以“非置入技术”替代“置入技术”治疗先天性心脏缺损已成为该领域发展的新趋势。

解启莲等^[9]报道1例室间隔缺损封堵术介入治疗中出现严重心律失常患者，取出封堵器终止手术，术后3个月回院复查，发现室间隔缺损已经自愈。分析其原因，可能为用封堵器介入治疗过程中在缺损边缘造成新创面，刺激细胞增殖、组织修复，促使缺损自愈。基于心肌细胞和心脏成纤维细胞的生物学特性，对先天性心脏缺损患者缺损部位进行处理，使得细胞增殖、迁移能力增加从而进行缺损修复，可能成为先天性心脏缺损潜在的治疗方法。

心肌的构成较为复杂，由心肌细胞、心脏成纤维细胞和微血管等组成，心肌细胞占心脏组织的30%左右，在胚胎期和新生期发育迅速，随后成为高度分化的终末细胞，主司收缩功能^[10]，心脏成纤维细胞则具有增殖能力，负责心脏的细胞外基质，主要是Ⅰ、Ⅲ型胶原纤维的产生和沉积^[11]，联接心肌细胞及肌束，对心脏起支持保护等作用，活化的心脏成纤维细胞具有较强的迁移能力，当心肌细胞出现损伤时，可能激活相应巨噬细胞进而释放多种活性因子，激活静息期的细胞外基质产生细胞转化为成纤维细胞，并在多种炎症因子和细胞因子的作用下，迁移至心脏损伤区域并迅速增殖^[12-13]。

心肌细胞和心脏成纤维细胞在体外培养时，结构和功能的许多方面都得以保留。实验过程中，心肌细胞在体外培养时可以自发的收缩，而传代过程中心肌成纤维细胞也能保持原代培养特点。所以，采用体外干预因素作用于心肌细胞和心脏成纤维细胞为先天性心脏缺损的病理生理机制研究提供了一个极好的模型。有研究以缺氧/复氧乳鼠心肌细胞模型成功模拟在体心肌缺血再灌注损伤^[14]，采用与血管紧张素Ⅱ共培养的心肌细胞肥大模型模拟心肌肥厚^[15]。同时，董悦等^[16]研究发现，缺血心脏成纤维细胞可构建工程化心肌样组织。以上的研究报道均表明采用心肌细胞和心脏成纤维细胞作为心脏疾病发病机制和治疗研究已取得一定进展，可成为研究心脏疾病的可靠模型。

细胞的增殖、迁移受多种细胞因子调控，基质细胞衍生因子1属于趋化因子蛋白家族，大鼠基质细胞衍生因子分为基质细胞衍生因子1α、基质细胞衍生因子β及基质细胞衍生因子γ 3种形式，主要由基质细胞产生，在多种组织中存在表达，与诱导性表达的化学因子不同，基质细胞衍生因子1为持续性表达，且炎性介质不能使其表达增加。虽然大鼠心脏中基质细胞衍生因子1γ表达最高，但研究发现当出现急性心肌梗死时，基质细胞衍生因子1α表达代偿性增加，而基质细胞衍生因子1γ表达变化不明显。Liehn 等^[17]和Tang等^[18]证实，基质细胞衍生因子1α与心肌梗死后的修复作用密切相关，可提高血管生成和心脏功能。基质细胞衍生因子1α既可通过调控PI3K/Akt和ERK信号通路抑制低氧低血清导致的间充质干细胞凋亡^[19]，又可调节内源性干细胞的归巢、招募^[20-21]。同时，有研究表明，基质细胞衍生因子1可促进内皮祖细胞和乳腺癌细胞的增殖和迁移^[22-23]。大鼠的基质细胞衍生因子1α与人和小鼠的序列高度一致，提示其在进化过程中高度保守，这种保守同时体现在其受体CXCR4中。近年来发现基质细胞衍生因子1与CXCR4在造血、心脏生成、神经发育等生理过程起到关键作用，同时基质细胞衍生因子1γ可能在胚胎期心脏室间隔的发育中起到重要作用。

实验以心肌细胞和心脏成纤维细胞作为体外培养模型，采用刮伤模拟物理损伤造成细胞缺损，同时，向培养基中添加基质细胞衍生因子1α，观察物理损伤及基质细胞衍生因子1α对心肌细胞增殖影响和处理后心肌细胞对心脏成纤维细胞的趋化作用。实验结果表明，物理损伤后，部分细胞被刮掉使融合的大鼠心肌细胞出现道状划痕，刮伤组细胞存活率较对照组比较有所降低，在物理损伤基础上添加不同浓度的基质细胞衍生因子1α共同培养，发现基质细胞衍生因子1α可促进物理损伤后的心肌细胞增殖；同时，物理损伤后的心肌细胞和基质细胞衍生因子1α联合作用对心脏成纤维细胞的趋化作用有所增强，可显著性增加心脏成纤维细胞的迁移能力，提高迁移率，说明物理损伤及基质细胞衍生因子1α可能通过多种方式激活心肌细胞和心脏成纤维细胞，并增强心脏成纤维细胞的迁移能力。

基于以上结果，作者假设，在先天性心脏缺损的治疗应用中，心脏成纤维细胞则可能迁移至缺损部位后进行组织修复，促进缺损自愈，而物理损伤及基质细胞衍生因子1α对心肌细胞和心脏成纤维细胞的作用机制研究，如对静止状态成纤维细胞的激活机制，对细胞增殖、迁移/趋化、细胞外基质合成(模拟缺损部位组织修复)及核转录因子、促炎症因子和抗炎症因子表达的影响，则有待于进一步深入探讨。

总之，基质细胞衍生因子1α可能提高物理损伤后的心肌细胞增殖能力，物理损伤联合基质细胞衍生因子1α培养的心肌细胞对心脏成纤维细胞的迁移具有促进作用，提示使用生物手段在先天性心脏缺损治疗和恢复阶段的一种新的探索方向。

基金资助：国家自然科学基金面上项目(30972956)。
作者贡献：第一作者和第二作者为实验设计者，实验主要由第二作者实施，其他作者参与实施。实验评估为第一作者和第二作者，资料收集为第二作者，第二作者成文，第三作者审校，第一作者和二作者对文章负责。
利益冲突：课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济组织直接或间接利益赞助。
伦理要求：实验过程中对动物的处置符合2009年《Ethical issues in animal experromentation》相关动物伦理学标准的条例。
文章概要：
文章要点：通过创伤使心肌细胞和成纤维细胞增殖促先天性心脏缺损自愈。
关键信息：研究另辟蹊径，利用损伤后细胞可以增殖的构思，达到治疗先天性心脏缺损的目的。
研究的创新之处与不足：研究的创新之处是通过创伤使心肌细胞和成纤维细胞增殖促先天性心脏缺损自愈。研究的不足是还需要进行动物实验和临床实验进行验证其效果
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