益气活血类药物血清对嗅鞘细胞增殖及相关因子分泌的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.06.024

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (6): 1094-1100.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.06.024

• 干细胞与中医药 stem cells and traditional Chinese medicine • 上一篇下一篇

益气活血类药物血清对嗅鞘细胞增殖及相关因子分泌的影响

饶耀剑¹，朱文潇¹，马文虎¹，王拥军²

1 河南省洛阳正骨医院脊椎外三科，河南省洛阳市 471000
2上海中医药大学附属龙华医院，上海市 200000

收稿日期:2012-05-18 修回日期:2012-07-27 出版日期:2013-02-05 发布日期:2013-02-05
通讯作者: 王拥军，博士，主任医师，上海中医药大学附属龙华医院，上海市 200000
作者简介:饶耀剑☆，男，1972年生，湖北省武穴市人，汉族，2005年华中科技大学毕业，博士，副主任医师，主要从事脊柱脊髓损伤研究。 raotony@163.com

Serum-containing drugs responsible for supplementing qi and activating blood circulation influences proliferation of olfactory ensheathing cells and secretion of related cytokines

Rao Yao-jian¹, Zhu Wen-xiao¹, Ma Wen-hu¹, Wang Yong-jun²

1 Third Department of Spine Surgery, Luoyang Orthopedic-traumatological Hospital, Luoyang 471000, Henan Province, China
2 Affiliated Longhua Hospital of Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200000, China

Received:2012-05-18 Revised:2012-07-27 Online:2013-02-05 Published:2013-02-05
Contact: Wang Yong-jun, Doctor, Chief physician, Affiliated Longhua Hospital of Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200000, China
About author:Rao Yao-jian☆, Doctor, Associate chief physician, Third Department of Spine Surgery, Luoyang Orthopedic-traumatological Hospital, Luoyang 471000, Henan Province, China raotony@163.com

摘要/Abstract

摘要：

背景：益气化瘀是中医药对脊髓损伤的主要治则，但疗效不确切。那么，益气活血类中医药治法能否结合现代科技共同治疗脊髓损伤从而提高疗效呢？
目的：观察益气活血类汤剂促进嗅鞘细胞增殖及分泌神经生长因子、脑源性神经营养因子的作用。
方法：组织块培养法体外培养新生大鼠嗅鞘细胞；采用MTT法检测补阳还五汤和痿症方含药血清对嗅鞘细胞增殖的影响；采用Western-Blot法测定培养上清中神经生长因子、脑源性神经营养因子水平。
结果与结论：MTT结果显示补阳还五汤药物血清及痿证方药物血清均能促进嗅鞘细胞增殖，且两者促增殖作用无差异；Western-Blot结果显示补阳还五汤药物血清及痿证方药物血清均能促进嗅鞘细胞分泌神经生长因子、脑源性神经营养因子，两组间细胞因子分泌水平也无明显差异。

关键词: 干细胞, 干细胞与中医药, 补阳还五汤, 痿证方, 益气活血, 含药血清, 嗅鞘细胞, 增殖, 神经生长因子, 脑源性神经营养因子, 促增殖, 组织修复, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Supplementing qi and removing blood stasis is the main therapeutic principle of traditional Chinese medicine for the treatment of spinal cord injury, but the efficacy is not plausible. But, whether the application of serum-containing drugs responsible for supplementing qi and activating blood circulation under the guidance of modern technology can treat spinal cord injury and improve the efficacy?
OBJECTIVE: To study the effect of serum-containing drugs responsible for supplementing qi and activating blood circulation on the proliferation of olfactory ensheathing cells and the secretion of nerve growth factor and brain-derived neurotrophic factor.
METHODS: The olfactory ensheathing cells were in vitro cultured with tissue block culture method. The effect of Buyanghuanwu decoction and Weizheng decoction on the proliferation of olfactory ensheathing cells was detected with MTT assay. The expression levels of nerve growth factor and brain-derived neurotrophic factor in the culture supernatant were detected by western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: MTT results showed that both Buyanghuanwu decoction and Weizheng decoction could promote the proliferation of olfactory ensheathing cells, and there was no significant difference in proliferation-promoting effect. Western blot assay results showed that both Buyanghuanwu decoction and Weizheng decoction could promote the expression of nerve growth factor and brain-derived neurotrophic factor in olfactory ensheathing cells, and there was no significant difference in secretion level between two groups.

Key words: stem cells, stem cells and traditional Chinese medicine, culture and differentiation, Buyanghuanwu decoction, Weizheng decoction, supplementing qi and activating blood circulation, drug-containing serum, olfactory ensheathing cells, proliferation, nerve growth factor, brain-derived neurotrophic factor, proliferation promotion, tissue repair, photographs-containing paper of stem cells

中图分类号:

R394.2

饶耀剑，朱文潇，马文虎，王拥军. 益气活血类药物血清对嗅鞘细胞增殖及相关因子分泌的影响[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(6): 1094-1100.

Rao Yao-jian, Zhu Wen-xiao, Ma Wen-hu, Wang Yong-jun. Serum-containing drugs responsible for supplementing qi and activating blood circulation influences proliferation of olfactory ensheathing cells and secretion of related cytokines[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(6): 1094-1100.

图/表（结果） 7

2.1 嗅鞘细胞形态观察及鉴定 原代培养的嗅鞘细胞每隔2 d限定性培养液半量换液培养、纯化。培养至第3天时可见组织团块透亮且周围大量扁圆形胞体，见图1。第6天时可见3种细胞形态，即双极样、三极样和扁圆形，双极样和三极样细胞是嗅鞘细胞的典型形态，见图2。培养至第9天时，较多细胞聚集生长并以对称突起的双极样细胞和三极样细胞为主。经P75鉴定，嗅鞘细胞呈红色，见图3。培养至第12天时，细胞透亮并以双极样、三极样为主，轴突细长，细胞聚集成簇生长。培养至第15天时，细胞透亮度一般，生长旺盛且细胞数目增多，双极样与三极样细胞接连成片，见图4。

2.2 经MTT染色处理后490 nm波长下各组细胞的吸光度值 不同中药血清直接作用于嗅鞘细胞体系5 d后(镜下观察细胞汇合率达70%)吸光度值情况，见表1。可见与生理盐水对照组比较，胎牛血清组及含药血清各组吸光度值均有增加(P < 0.01)，其中补阳还五汤组、痿证方组吸光度值较胎牛血清组增加明显(P < 0.01)，而补阳还五汤组、痿证方组间差异无显著性意义(P > 0.05)。提示2个中药组含药血清均能促进嗅鞘细胞增殖，且两者间增殖作用无差异。

2.3 Western blot检测神经生长因子、脑源性神经营养因子蛋白水平 见图5。结果显示胎牛血清组与生理盐水对照组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，中药血清两组神经生长因子、脑源性神经营养因子蛋白表达量与生理盐水对照组比较，差异有显著性意义(P < 0.01)，而中药血清组间差异无显著性意义(P > 0.05)，见表2。提示补阳还五汤药物血清及痿证方药物血清均能促进嗅鞘细胞分泌神经生长因子、脑源性神经营养因子。

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引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。
时间及地点：实验于2011年10月至2012年4月在河南省洛阳正骨医院中心实验室完成。
材料：
实验动物：2月龄 SD大鼠30只，清洁级，体质量(200±20) g，雌雄各半；新生SD乳鼠10只，合格证号：SCXK(豫)2010-0002，均由河南省动物实验中心提供。实验过程中对动物的处置符合2009年《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的条例。大鼠用于含药血清的制备，乳鼠用于嗅鞘细胞的原代培养。
补阳还五汤组分：生黄芪，当归尾，赤芍，地龙，川芎，桃仁，红花。
痿证方组分：炙黄芪、党参、炒白术、当归。
主要试剂与仪器：
Main reagents and instruments:

实验方法：
大鼠分组及含药血清制备：预先将大鼠雌雄分笼随机分为补阳还五汤组、痿证方组、对照组，每组10只。补阳还五汤及痿证方原方经水煎至100 mL，制成相当于含生药1.0 g/mL的水煎剂。按人体质量60 kg每天1剂换算，200 g大鼠等效用药剂量为2.89 g^[11-12]。根据前期实验的结果(另文发表)及参阅文献^[13-15]，大鼠嗅鞘细胞存活随药物浓度的增加而呈现剂量-效应依赖关系，其中补阳还五汤最佳剂量为3倍剂量，痿证方最佳剂量为5倍剂量，故将药液浓缩至目标浓度。
大鼠试饲养1周后开始用灌胃器灌胃药物。每只大鼠每天灌胃2次，每天早9点、晚4点各1次，每次1.5 mL，对照组灌服等量生理盐水。自由进食水，及时更换大鼠垫料。连续给药3 d，采血前禁食12 h。末次给药2 h后，无菌环境下乙醚麻醉大鼠，采用腹主动脉采血法收集大鼠全血，以3 000 r/min(离心半径13.5 cm)离心15 min，用0.22 μm微孔滤膜无菌分离血清，56 ℃水浴，30 min灭活，-20 ℃冰箱保存备用。
原代嗅鞘细胞的分离、培养及纯化^[16-17]：预备好2个 35 mm玻皿，装入少许无血清DMEM培养基。每次取2只新生3 d内乳鼠，断头处死，用眼科剪剪开乳鼠颅骨，暴露嗅球，眼科镊小心取出嗅球组织，置于无血清DMEM培养基，在显微镜下用显微眼科镊小心剥离脑膜。用巴氏吸管将剥膜后的嗅球组织转移至另一无血清DMEM培养基，并轻柔吹打、冲洗组织数遍。吸去清洗用培养基，用眼科弯剪将嗅球组织锐性剪切成0.5- 1.0 mm³小组织块，移至盛有DMEM液的离心管中，吹打均匀，1 200 r/min(离心半径13.5 cm)离心5 min，弃除上清，加入已制备的含体积分数为10%胎牛血清培养基2 mL，并吹散均匀。用巴氏吸管转移至2个已用多聚赖氨酸“包板”的25 cm²培养瓶中，分布均匀(0.5 cm间隔)，倒置或直立培养瓶约15 min后，从培养瓶非种植面加含体积分数为10%胎牛血清培养基至每培养瓶 4 mL，缓慢放正培养瓶，使组织块贴壁，拧紧瓶盖。置于37.0 ℃、体积分数为5%CO₂、饱和湿度的细胞培养箱中培养。48 h后，用限定性培养基(由河南省正骨研究院提供)每隔2 d半量换液培养、纯化。于倒置显微镜下观察细胞生长情况，至细胞长满为止传代，细胞培养期间间断摄片。
中药方剂含药血清干预嗅鞘细胞：嗅鞘细胞铺满培养瓶后，选择生长状态良好的细胞，制备单细胞悬液。取 100 μL单细胞悬液移至1.5 mL离心管中，加入100 μL 0.08%锥虫蓝溶液后轻摇混匀。在3 min内倒置显微镜下用血球计数板、计数器计数细胞。镜下观察见死细胞被染成淡蓝色，而活细胞拒染。依次计算细胞悬液密度，用0.125%胰蛋白酶消化液将嗅鞘细胞消化下来后，根据锥虫蓝排斥实验调节细胞浓度为2.5×10⁷ L^-1。将此浓度的细胞悬液按组别以每孔200 μL接种于2块96孔培养板，经含体积分数为10%胎牛血清培养基培养24 h后，更换不含血清的DMEM/F12培养液培养24 h(饥饿细胞使细胞在同一水平增殖)，然后分别加入补阳还五汤含药血清培养液、痿证方含药血清培养液及生理盐水组培养液，胎牛血清组(含体积分数为10%胎牛血清)于培养板上继续培养，每组48孔。
MTT法测定中药方剂含药血清对嗅鞘细胞的增殖情况：倒置显微镜下观察至培养第5天，各孔细胞汇合率达70%以上，说明细胞生长达到对数期。超净工作台下，用巴氏吸管吸尽各孔培养基并用DMEM液清洗2次后每孔加入180 μL DMEM/F12培养液，取已配制好的5 g/L的MTT试剂20 μL加入其中。在37 ℃、体积分数为5%CO₂饱和培养箱中培养5 h，吸尽废液后加入150 μL的二甲基亚砜，电动摇床上100 r/min(离心半径13.5 cm)振荡混匀10 min，使甲臜结晶充分溶解后用酶联检测仪在490 nm波长下测定各孔的吸光度值。
Western-Blot测定神经生长因子、脑源性神经营养因子表达：经含PMSF蛋白抑制剂的RIPA裂解液裂解各组嗅鞘细胞，PBS漂洗后用细胞刮刀刮下嗅鞘细胞，移至 100 mm培养皿中，并用细针头吹打。移至15 mL无菌离心管，高速冷冻离心(4 ℃，12 000 r/min，离心半径13.5 cm)15 min，取上清转移至另一15 mL无菌离心管。采用BCA法测定蛋白含量，得出蛋白质量浓度为2.95 g/L。稀释调整到2 g/L，分装，-70 ℃贮存。测完蛋白含量后，取2 g/L的蛋白样品溶液约60 μL至1.5 mL离心管中，参照试剂盒说明书，并参考文献得知目标蛋白神经生长因子、脑源性神经营养因子的相对分子质量均在13 000左右^[18]，故按1∶1的比例将蛋白样品加入Tricine蛋白上样缓冲液。经100 ℃变性5 min后，迅速高速离心，12 000 r/min(离心半径13.5 cm)离心5 min。取做为加样用的上清备用。采用低分子多肽凝胶电泳，故配制15%的SDS-PAGE分离胶，每次配制5 mL，并配制5%SDS-PAGE浓缩胶，每次配制1 mL。灌胶后，按预定顺序使用微量注射器进行加样，Marker 10 μL，各组蛋白样品每泳道10 μL，每组8道，加样时将针尖伸到加样孔底部，缓慢小心加入。连接电源，浓缩胶部分50 V电压使样品浓缩成一条窄带，到分离胶选择100 V电压，直至溴酚蓝到达底部停止电泳。从电泳装置上卸下玻璃板，放在纸巾上撬开玻璃板，取下凝胶，置于盛有纯水的洁净托盘中，切胶并凝胶切角做记号。
采用Bio-Rad转移装置，进行蛋白质转移。转移结束后，将硝酸纤维素膜放置一平皿中，加丽春红染料染膜5 min，用双蒸水冲洗直至有条带显出，在蛋白质标准泳道边，标上相对分子质量，然后将染色后的硝酸纤维素膜置于平皿中，在摇床上用TBST摇荡洗涤30 min，洗去染色剂。将硝酸纤维素膜放置一平皿中，加浸没膜量的封闭液室温振摇1 h。封闭结束后，将膜放入一塑料袋中，加入一抗，封口，4 ℃轻轻振摇6 h；取出膜，用TBST洗30 min；将膜转入另一塑料袋中，加入二抗，封口，4 ℃轻轻振摇2 h；取出膜，用TBST洗30 min。将硝酸纤维素膜放于暗盒中，放上X射线胶片，显影、定影、洗片。将X射线胶片置于Gel Doc-XR图像分析系统，通过Quantity One软件测定目的蛋白条带的平均吸光度值。
统计学分析：用SPSS 16.0软件包进行统计学分析，计量资料以x(_)±s表示，多个样本均数间的比较若符合正态分布则采用成组t 检验；若不符合正态分布则采用Krukal-Wallis H检验及Nemenyi检验。P < 0.05为差异有显著性意义，P< 0.01为差异有非常显著性意义。

讨论

脊髓损伤在中医学属于“腰痛”、“痿躄”、“体惰”、“癃闭”等范畴，是长久以来悬而未决的医学难题之一。四肢痿软，步履艰难，肢体无力是为 “痿”表现，明•李梴《医学入门》：痹者，气闭塞不流通也，或痛痒，或麻痹，或手足缓弱，与痿相类。但痿属内因，血虚火盛，肺焦而成；痹属风寒湿三气侵入而成，然外邪非气血虚则不入，此所以痹久亦能成痿。明•方隅《医林绳墨》：痿者，气之软弱也，肢体沉重而痿弱难行者也。其病因为“瘀血”，病机为“督脉枢机不利”。中医学认为脊髓损伤后所产生的各种临床症状，乃因疾而阻滞督脉，枢机统帅失职，三阳经气血逆乱而致。《内经》指出调理气血应该“疏其气血，令其调达，以致和平”。痿证方是上海中医药大学施杞教授的经验方，他根据《内经》等中医药理论，结合大量临床实践和基础研究，认为痿证包括肾精亏损、痰滞于内和脾胃虚弱、肌肉失养。治疗前者当补益肾精，化痰通络，地黄饮子加减。后者当补益脾胃，益气和营，人参养营汤加减，并据此衍生出“痿证方”，经临床应用，疗效显著。而补阳还五汤作为治疗脊髓损伤的效方，源自清代医家王清任《医林改错•卷下•瘫痿论》，由生黄芪、川芎、桃仁、红花、赤芍、当归尾、地龙组成，有补气行气、养血活血化瘀的功效，调气机，通经络，主治半身不遂，遗尿不禁等^[19]。目前已有较多研究发现，补阳还五汤对晚期脊髓损伤改善症状、脊髓功能恢复有积极效果^[20-23]。

中药血清药理学研究方法是将中药给予动物灌胃后在一定时间采集动物血液、无菌分离血清并用含药血清加入到某种体系中进行体外试验的一种实验方法。本实验运用该方法，并通过MTT检测细胞生长增殖情况，探讨中药复方补阳还五汤和痿证方对体外培养嗅鞘细胞增殖的影响，实验结果表明：益气化瘀类代表方剂补阳还五汤和痿证方均能促进大鼠嗅鞘细胞增殖，且两组作用一致。

嗅鞘细胞表达的神经营养因子在促进脊髓功能恢复中起着重要作用。神经生长因子、脑源性神经营养因子、神经营养素3、神经营养素4/5以及神经营养素6和神经营养素7这几种因子，是主要由神经支配的皮肤、肌肉、腺体和神经元等细胞所分泌的小分子多肽^[24]。这些多肽经突触后神经元摄取并通过突触前神经元逆行运送至中枢神经元胞体，与特异的神经元受体结合并激活细胞代谢，调节细胞生长而发挥作用^[25-26]。神经生长因子与脑源性神经营养因子均是神经营养因子家族中主要成员，两者有50%同源性，对中枢和周围神经系统均有广泛作用。不仅在中枢神经系统发育过程中对神经元的生存、分化、生长和维持神经元正常的生理功能等方面起重要作用，还具有抗损伤性刺激，促进神经元的再生，保护缺血缺氧的神经元，维持神经元功能和再生修复及防止神经元细胞进行性病变，刺激诱导轴突再生以及促进神经通路、抑制神经细胞凋亡的重要作用^[27]。脊髓损伤后内源性神经生长因子的表达即上调。通过Northern blot杂交分析大鼠胸髓挤压伤后，脊髓中神经生长因子受体mRNA含量在损伤后4 d胸髓中(包括损伤区)含量显著增加，7 d达高峰，为正常的5-7倍，且在损伤后14 d和28 d，仍保持较正常高4倍的水平^[28]。提示脊髓中神经生长因子水平的变化可能与脊髓自身修复能力有关。而脊髓损伤后给予外源性神经生长因子(包括直接给予神经生长因子和转基因导入神经生长因子)，发现神经生长因子在脊髓外伤治疗中有明显的生物学效应^[29]。脑源性神经营养因子在脊髓可塑性中具有重要作用，可促进神经元的存活，神经纤维的延长，阻止损伤神经元胞体的萎缩，促进受损的红核脊髓神经元和皮质脊髓神经元轴突再生^[30]。实验用补阳还五汤含药血清、痿证方含药血清干预培养嗅鞘细胞5 d，镜下观察见嗅鞘细胞汇合率达70%，然后运用Western-Blot，并用Gel Doc-XR成像分析仪及Quantity-One软件测得嗅鞘细胞上清液中，补阳还五汤含药血清组和痿证方含药血清组Mr12 300处及Mr13 000处的脑源性神经营养因子、神经生长因子表达较对照组明显强烈。这提示益气化瘀类代表方剂补阳还五汤和痿证方均能够促进大鼠嗅鞘细胞分泌神经生长因子、脑源性神经营养因子，结合MTT试验提示补阳还五汤不仅能促进嗅鞘细胞增殖、提高其存活，还能促进嗅鞘细胞分泌神经营养因子从而能够促进神经功能恢复。

结论：益气活血类中药方剂在治疗脊髓损伤的临床应用中有着肯定功效，代表方补阳还五汤及痿证方均以补气药黄芪为君药，按“治痿独取阳明”，充实阳明气血，“气行则血行”，故其应用范围越来越广泛。本实验针对益气活血类中药方剂对嗅鞘细胞增殖及其分泌神经营养因子的影响，并以益气活血类中药方剂的代表方补阳还五汤及痿证方进行了初步探讨，证明两方均能够促进嗅鞘细胞增殖并能有效促进其分泌神经营养因子，提示益气活血类中药方剂通过增强细胞分泌、表达达到“补气行气”之功。

致谢：感谢河南省正骨研究院给予支持和帮助。
作者贡献：实验设计为饶耀剑，实验实施为马文虎，实验评估为朱文潇，资料收集为朱文潇。饶耀剑成文，王拥军审校，饶耀剑对文章负责。
利益冲突：课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济组织直接或间接的经济或利益的赞助。
伦理要求：实验过程中对动物的处置符合2009年《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的条例。
作者声明：文章为原创作品，数据准确，内容不涉及泄密，无一稿两投，无抄袭，无内容剽窃，无作者署名争议，无与他人课题以及专利技术的争执，内容真实，文责自负。

益气活血类药物血清对嗅鞘细胞增殖及相关因子分泌的影响

Serum-containing drugs responsible for supplementing qi and activating blood circulation influences proliferation of olfactory ensheathing cells and secretion of related cytokines

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